[0001]
本发明涉及天然提取物领域，更具体地，涉及一种首乌藤提取物的制备方法及应用。
背景技术：
[0002]
口腔中定植着数量庞大、种类丰富的微生物群落，这些微生物的群落结构特征及其稳态与宿主的口腔及全身健康密切相关，其病理性改变可诱发龋病、牙周病等口腔感染性疾病，还与糖尿病、类风湿性关节炎等系统性疾病有关。口腔微生物群落因口腔半开放式的生态环境处于动态变化中。已有研究表明，某些口腔微生物能诱发宿主口腔及其他全身性疾病，例如变形链球菌(streptococcus mutans)是龋病的主要致病菌，牙龈卟啉单胞菌(porphyromonas gingivalis)是牙周病的重要致病菌，具核梭杆菌(fusobacterium nucleatum)能够引起多种机会性感染，与结直肠癌的发生、发展密切相关。
[0003]
首乌藤是蓼科植物何首乌(polygonum multiflorum thunb.)的地上藤茎或带叶藤茎，为药食两用，具有养心安神、通络祛风功效。首乌藤的有效成分主要是蒽醌类化合物(如大黄素、大黄酚、大黄素甲醚等)、黄酮类化合物(如β-谷甾醇等)等。其中黄酮类化合物多以苷类形式存在，具有多种生物活性，如调节免疫、防治血管硬化、降血糖等。已有研究主要集中在首乌藤提取物或化合物对常见食源性致病菌的抑菌筛选，而针对防治口腔致病菌的首乌藤提取物的报道未见。
[0004]
因此，如何提供一种适用于防治口腔致病菌的首乌藤提取物成为本领域亟需解决的技术难题。
技术实现要素：
[0005]
本发明的一个目的是提供一种适用于防治口腔致病菌的首乌藤提取物的制备方法的新技术方案。
[0006]
根据本发明的第一方面，提供了一种首乌藤提取物的制备方法。
[0007]
该首乌藤提取物的制备方法包括如下步骤：
[0008]
步骤(1)：粉碎首乌藤，采用石油醚浸泡一段时间后风干，得到首乌藤粉；
[0009]
步骤(2)：采用有机溶剂对首乌藤粉进行超声提取，过滤得到首乌藤提取液，其中，首乌藤与有机溶剂的质量体积比为1:(15-25)，首乌藤的质量的单位为g，有机溶剂的体积的单位为ml；
[0010]
步骤(3)：对首乌藤提取液进行减压浓缩处理，得到首乌藤浓缩液；
[0011]
步骤(4)：对首乌藤浓缩液进行冷冻干燥处理，即获得首乌藤提取物。
[0012]
可选的，所述步骤(1)中将首乌藤粉碎至粒径为35目-45目。
[0013]
可选的，所述步骤(1)中的浸泡时间为15h-33h。
[0014]
可选的，所述步骤(1)中的风干时间大于6h。
[0015]
可选的，所述步骤(2)中的有机溶剂为体积分数为50％-70％的乙醇。
[0016]
可选的，所述步骤(2)中的超声提取的条件如下：
[0017]
超声功率410w-525w，温度35℃-40℃，时间15min-20min。
[0018]
可选的，所述步骤(3)中将首乌藤减压浓缩至密度为1.200g/ml
±
0.005g/ml。
[0019]
可选的，所述步骤(4)中冷冻干燥的条件如下：
[0020]
温度为-30℃至-35℃，时间为20h-25h。
[0021]
根据本发明的第二方面，提供了一种由本公开的首乌藤提取物的制备方法制备的首乌藤提取物的应用，所述首乌藤提取物用于抑制具核梭杆菌。
[0022]
可选的，所述首乌藤提取物抑制具核梭杆菌的最低抑菌浓度为0.5wt％。
[0023]
本公开的首乌藤提取物的制备方法可快速高效地获得高纯度的首乌藤提取物，得到的首乌藤提取物可用于抑制具核梭杆菌(f.nucleatum)。
具体实施方式
[0024]
现在将详细描述本发明的各种示例性实施例。应注意到：除非另外具体说明，否则在这些实施例中阐述的部件和步骤的相对布置、数字表达式和数值不限制本发明的范围。
[0025]
以下对至少一个示例性实施例的描述实际上仅仅是说明性的，决不作为对本发明及其应用或使用的任何限制。
[0026]
对于相关领域普通技术人员已知的技术、方法和设备可能不作详细讨论，但在适当情况下，所述技术、方法和设备应当被视为说明书的一部分。
[0027]
在这里示出和讨论的所有例子中，任何具体值应被解释为仅仅是示例性的，而不是作为限制。因此，示例性实施例的其它例子可以具有不同的值。
[0028]
本公开提供了一种首乌藤提取物的制备方法，包括如下步骤：
[0029]
步骤(1)：粉碎首乌藤，采用石油醚浸泡一段时间后风干，得到首乌藤粉。
[0030]
为了更高效地提取首乌藤中的有效成分，步骤(1)中将首乌藤粉碎至粒径为35目-45目。
[0031]
为了更高效地提取首乌藤中的有效成分，步骤(1)中的浸泡时间为15h-33h。
[0032]
为了更高效地提取首乌藤中的有效成分，步骤(1)中的风干时间大于6h。
[0033]
步骤(2)：采用有机溶剂对首乌藤粉进行超声提取，过滤得到首乌藤提取液，其中，首乌藤与有机溶剂的质量体积比为1:(15-25)，首乌藤的质量的单位为g，有机溶剂的体积的单位为ml。
[0034]
为了更有效地控制提取成本，步骤(2)中的有机溶剂为体积分数为50％-70％的乙醇。
[0035]
为了更高效地提取首乌藤中的有效成分，步骤(2)中的超声提取的条件如下：
[0036]
超声功率410w-525w，温度35℃-40℃，时间15min-20min。
[0037]
步骤(3)：对首乌藤提取液进行减压浓缩处理，得到首乌藤浓缩液。
[0038]
为了更高效地得到首乌藤提取物，步骤(3)中将首乌藤减压浓缩至密度为1.200g/ml
±
0.005g/ml。
[0039]
步骤(4)：对首乌藤浓缩液进行冷冻干燥处理，即获得首乌藤提取物。
[0040]
为了更高效地得到首乌藤提取物，步骤(4)中冷冻干燥的条件如下：
[0041]
温度为-30℃至-35℃，时间为20h-25h。
[0042]
本公开还提供了一种由本公开的首乌藤提取物的制备方法制备的首乌藤提取物的应用，首乌藤提取物用于抑制具核梭杆菌。
[0043]
具体实施时，首乌藤提取物抑制具核梭杆菌的最低抑菌浓度为0.5wt％。
[0044]
下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法，所使用的材料和试剂，如无特殊说明，均可从商业途径得到，实验中使用的设备如无特殊说明，均为本领域技术人员熟知的设备。
[0045]
实施例1
[0046]
(1)称取首乌藤(购自云南福林堂药业有限公司)5g，置于恒温干燥箱中干燥至恒重，粉碎后过40目筛，取小粒径粉末浸泡于石油醚(沸程60-90℃)中24h，然后置于通风橱内风干6h以上，得到首乌藤粉；
[0047]
(2)根据料液比1:25，采用体积分数50％的乙醇(ml)对首乌藤粉进行超声提取，超声功率为450w，超声温度为40℃，超声为时间20min，过滤得到首乌藤提取液；
[0048]
(3)将首乌藤提取液在-15in.hg、80℃条件下减压浓缩至密度为1.200g/ml
±
0.005g/ml后，在-35℃的条件下冷冻干燥20h，获得首乌藤提取物。
[0049]
测定首乌藤提取物的抑菌圈大小，具体步骤如下：
[0050]
(1)菌悬液制备：采用厌氧固体培养基(蛋白胨15.0g/l，酵母粉5.0g/l，大豆胨5.0g/l，牛肉粉5.0g/l，葡萄糖5.0g/l，氯化钠5.0g/l，可溶性淀粉5.0g/l，半胱氨酸0.5g/l，磷酸二氢钾2.5g/l，氯化血红素0.005g/l，维生素k10.001g/l，琼脂12g/l，ph7.3；121℃高压蒸汽灭菌15min)活化f.nucleatum，置于37℃培养箱内厌氧培养24h，传代两次。挑取单菌落至bhi液体培养基(胰蛋白胨10.0g/l，葡萄糖2.0g/l，牛心粉5.0g/l，氯化钠5.0g/l，磷酸氢二钠2.5g/l，ph7.4；121℃高压蒸汽灭菌15min)中，制成菌悬液，浓度为2
×
106cfu/ml；
[0051]
(2)含菌平板的制备：采用无菌棉签沾取菌悬液，划线于bhi固体培养基上；
[0052]
(3)首乌藤提取物的稀释：采用无菌水将首乌藤提取物稀释至首乌藤提取物的质量百分含量为50％、10％、2％、0.4％、0.08％；
[0053]
(4)加样及培养：取定性滤纸，制成6mm直径的圆片，高压灭菌后烘干备用；将滤纸片浸泡于首乌藤提取物稀释液中，取出贴放于含菌平板表面，同时以浸泡青霉素-链霉素溶液(1mg/ml)的纸片作为阳性对照，以浸泡无菌水的纸片作为空白对照。纸片之间及纸片与平板边缘距离15mm，每个平板贴放4张滤纸片。将贴好纸片的平板置于37℃培养箱内厌氧培养24h，观察抑菌圈；
[0054]
(5)抑菌圈测定：采用游标卡尺测定抑菌圈直径，发现50％的首乌藤提取物稀释液对f.nucleatum的抑菌圈直径为13.5
±
0.42mm，10％的首乌藤提取物稀释液的抑菌圈直径为6.3
±
0.21mm，其余3个浓度无明显抑菌圈，阳性对照青霉素-链霉素溶液的抑菌圈直径为20.1
±
0.57mm。
[0055]
测定最低抑菌浓度(mic)及最低杀菌浓度(mbc)，具体步骤如下：
[0056]
(1)菌悬液的制备：采用厌氧固体培养基活化f.nucleatum，置于37℃培养箱内厌氧培养24h，传代两次；挑取单菌落至bhi液体培养基中，制成菌悬液，浓度为2
×
106cfu/ml；
[0057]
(2)首乌藤提取物的稀释：采用bhi液体培养基将首乌藤提取物稀释至首乌藤提取物的质量百分含量为10％、5％、2.5％、1％、0.5％、0.25％、0.125％、0.0625％；
[0058]
(3)加样及培养：
①
实验组：在96孔细胞培养板中每孔加入20μl菌悬液、180μl首乌
藤提取液稀释液；
②
空白组：每孔200μlbhi液体培养基；
③
生长对照组：每孔20μl菌液、180μlbhi液体培养基；以上均为每组6孔重复；置于37℃、50r/min恒温摇床培养24h；
[0059]
(4)mic测定：在酶标仪570nm处测定吸光度值；根据公式：i(抑菌率)＝1－(a
实验组-a
空白组
)/(a
生长对照组-a
空白组
)
×
100％(其中a
实验组
：实验组的吸光度值，a
空白组
：空白组的吸光度值，a
生长对照组
：生长对照组的吸光度值)，当抑菌率≥80％，此时的首乌藤提取物浓度为最低抑菌浓度mic。结果表明首乌藤提取物对f.nucleatum的mic为0.25％；
[0060]
mbc测定：基于mic获取等份试样的细菌悬液，涂布于tbhi平板上，37℃恒温培养5～7d，观察菌落数量，若少于5个菌落，判定为此浓度为最小杀菌浓度mbc。结果表明首乌藤提取物对f.nucleatum的mbc为1.00％。
[0061]
采用人工唾液+试管稀释法模拟口腔环境，开展首乌藤提取物对f.nucleatum的抑制效果，具体步骤如下：
[0062]
(1)人工唾液配制：氯化钠0.5g/l，磷酸二氢钠0.5g/l，氯化钾1g/l，氯化钙1g/l，尿素1g/l，羧甲基纤维素钠3g/l，木糖醇5g/l，氟化钠2.2mg/l，蔗糖0.1g/l，胎牛血清50ml/l，蒸馏水1l，ph7.0，通过无菌滤膜0.22μm过滤后备用；
[0063]
(2)菌悬液的制备：采用厌氧固体培养基活化f.nucleatum，置于37℃培养箱内厌氧培养24h，传代两次；挑取单菌落至人工唾液中，制成菌悬液，浓度为2
×
106cfu/ml；
[0064]
(3)首乌藤提取物的稀释：采用上述人工唾液将首乌藤提取物稀释至首乌藤提取物的质量百分含量为10％、5％、2.5％、1％、0.5％、0.25％、0.125％、0.0625％；
[0065]
(4)加样及培养：
①
实验组：在50ml无菌玻璃试管中，每管加入1ml菌悬液、19ml首乌藤提取液稀释液；
②
空白组：每管20ml人工唾液；
③
生长对照组：每管1ml菌液、19ml人工唾液；每组3个重复；置于37℃恒温培养24h；
[0066]
(5)观察及结果：以空白组(无菌生长，透明)、生长对照组(有菌生长，浑浊)作为参照，实验组试管内无菌生长的浓度为对f.nucleatum的最低抑菌浓度。结果表明人工唾液模拟条件下首乌藤提取物对f.nucleatum的mic为0.5％。
[0067]
在实施例中采用纸片扩散法测定首乌藤提取物对f.nucleatum的抑制作用，再采用微量稀释法开展最低抑菌浓度(mic)及最低杀菌浓度(mbc)的测定。进一步，采用人工唾液验证首乌藤提取物对f.nucleatum的抑制效果。同时设置首乌藤提取物组(根据不同实验选用无菌水或液体培养基作稀释液)，空白组(无菌水)，阳性对照组(青霉素-链霉素溶液1mg/ml)，每组实验重复三次。结果表明：首乌藤提取物(50wt％)对f.nucleatum的抑菌圈直径为13.5
±
0.42mm(阳性对照青霉素-链霉素溶液的抑菌圈直径为20.1
±
0.57mm)；微量稀释法条件下对f.nucleatum的mic和mbc分别是0.25wt％、1.00wt％；人工唾液条件下首乌藤提取物对f.nucleatum的mic是0.5wt％。
[0068]
虽然已经通过例子对本发明的一些特定实施例进行了详细说明，但是本领域的技术人员应该理解，以上例子仅是为了进行说明，而不是为了限制本发明的范围。本领域的技术人员应该理解，可在不脱离本发明的范围和精神的情况下，对以上实施例进行修改。本发明的范围由所附权利要求来限定。