一种熏倒牛提取物及其在制备抗惊厥药中的用途的制作方法

[0001]
本发明属于医药领域，具体涉及一种熏倒牛提取物及其在制备抗惊厥药中的用途。


背景技术：

[0002]
惊厥(convulsion)是大脑功能紊乱引起的症状，表现为肌肉抽搐伴意识丧失，大多由高热引起，发作时大多伴有脑局部病灶的神经元兴奋性过高所致的阵发性异常高频放电，并向周围扩散，进而出现大脑功能短暂失调的综合症。惊厥是儿科常见急症，也是最常见的小儿神经系统症状，是儿童时期常见的一种急重病症，以临床出现肢体节律性运动(抽搐)、痉挛、昏迷为主要特征；又称“抽搐”，俗名“抽风”或“惊风”。任何季节均可发生，一般以婴幼儿为多见，6岁以下儿童惊厥的发病率大概为4％～6％，年龄越小，发病率越高。
[0003]
目前常见的抗惊厥药有地西泮、卡马西平、丙戊酸钠、苯巴比妥和苯妥英钠等，但这些药物均具有恶心、呕吐、眩晕、精神萎靡、共济失调等不良反应以及偶发性巨幼红细胞性贫血、白细胞和血小板减少、肝功能和肾功能损害等毒副作用。因此，亟需寻求天然的、疗效更好、不良反应和毒副作用更少、抗惊厥谱广的治疗药物。
[0004]
熏倒牛(biebersteinia heterostemon maxim.)为牻牛儿苗科(geraniaceae)熏倒牛属(biebersteinia)的一种一年生、具浓烈腥臭味草本植物，主要分布在我国的青藏高原东部地区，尤以青海省西宁市、海东市、黄南藏族自治州和海南藏族自治州地区分布广泛，资源量较大，常生于杂草坡地、路旁、田边或河滩地。该植物藏药名为“明见赛保”，《中华藏本草》、《藏药志》、《四部医典》等藏医药典籍中记载，熏倒牛性寒、辛、苦，具有制疠除瘟、清热解毒、镇静解痉之功效，常用于治瘟病时疫、小儿高烧、流行性感冒等症。然而有关熏倒牛的药效物质基础研究报道较少，尤其是用于抗惊厥的活性成分研究基本处于空白。
[0005]
目前还未见将牻牛儿苗科(geraniaceae)熏倒牛属(biebersteinia)植物或其提取物用来制备高活性的抗惊厥药的报道。


技术实现要素：

[0006]
本发明的一个目的在于提供牻牛儿苗科geraniaceae熏倒牛属biebersteinia植物及其提取物在制备抗惊厥药中的用途；本发明的另一个目的在于提供一种熏倒牛提取物及其制备方法和在制备抗惊厥药中的用途。。
[0007]
本发明提供了牻牛儿苗科geraniaceae熏倒牛属biebersteinia植物及其提取物在制备抗惊厥药中的用途。
[0008]
进一步地，所述的植物是熏倒牛biebersteinia heterostemon maxim.全草。
[0009]
进一步地，所述的药物是预防和/或治疗高烧惊厥、抽搐、痉挛的药物。
[0010]
本发明还提供了一种熏倒牛提取物，它是将熏倒牛乙醇提取物经分离、纯化后得到的熏倒牛浸膏状提取物，依次经过柱层析、硅胶柱色谱分离，收集薄层色谱检测比移值r
f
为0.4～0.6的馏分，浓缩或干燥得到的熏倒牛提取物；所述硅胶柱色谱分离采用石油醚/乙
酸乙酯混合溶剂为洗脱剂。
[0011]
进一步地，所述石油醚/乙酸乙酯混合溶剂中，石油醚与乙酸乙酯的体积比为(7～1)：1；
[0012]
所述薄层色谱检测条件如下：展开剂为石油醚/乙酸乙酯按6：1的体积比混合而成的溶剂，显色剂为体积浓度10％的浓硫酸乙醇溶液。
[0013]
进一步地，所述馏分为薄层色谱检测比移值r
f
为0.5的馏分；
[0014]
所述石油醚/乙酸乙酯混合溶剂中，石油醚与乙酸乙酯的体积比为3：1；
[0015]
所述硅胶柱的填料为100～200目的硅胶。
[0016]
进一步地，所述熏倒牛乙醇提取物是由以下方法制得的：取熏倒牛药材，加乙醇提取，得到熏倒牛乙醇提取物；
[0017]
所述分离、纯化步骤如下：将熏倒牛乙醇提取物经胶体磨研磨后进行均质，离心得到上清液，将上清液经膜分离，得到滤液，浓缩得熏倒牛浸膏状提取物；
[0018]
所述柱层析步骤如下：将熏倒牛浸膏状提取物经大孔吸附树脂柱吸附，收集洗脱液，得到熏倒牛提取物粗品。
[0019]
进一步地，所述乙醇为体积分数10％～95％的乙醇；所述熏倒牛药材与乙醇的质量体积比为1：(5～80)g/ml；所述提取方式为水浴提取或超声提取；所述提取温度为20～80℃；所述提取时间为0.5～48.0小时；所述熏倒牛药材为熏倒牛全草，更优选为熏倒牛全草粉碎过40～300目筛后的粉末；
[0020]
所述研磨次数为1～10次；所述均质的压力为1～200mpa；所述膜分离采用的膜为孔径0.01～10μm的陶瓷膜，膜分离时上清液的流速为0.1～10t/h，膜分离温度为15～75℃，膜分离压力为0.005～3mpa；
[0021]
所述大孔吸附树脂柱的填料为hpd300、d101、ab-8、nka-9或dm301，上样液为熏倒牛浸膏状提取物与体积分数60％～80％的乙醇混合溶解后所得液体，所述熏倒牛浸膏状提取物与体积分数60～80％的乙醇的质量比为1：(5～7)；所述熏倒牛浸膏状提取物与大孔树脂填料的质量比为1：(7～12)；所述大孔吸附树脂柱的洗脱条件如下表所示；所述收集的洗脱液为体积分数60～80％乙醇洗脱液；
[0022][0023]
进一步地，所述乙醇为体积分数90％的乙醇；所述熏倒牛药材与乙醇的质量体积比为1：30g/ml；所述提取温度为60℃；所述提取时间为4.0小时；
[0024]
所述研磨次数为3次；所述均质的压力为50mpa；所述膜分离采用的膜为孔径0.2μm的陶瓷膜，膜分离时上清液的流速为1t/h，膜分离温度为55℃，膜分离压力为1mpa；
[0025]
所述大孔吸附树脂柱的填料为ab-8，上样液为熏倒牛浸膏状提取物与体积分数
70％的乙醇混合溶解后所得液体，所述熏倒牛浸膏状提取物与体积分数70％的乙醇的质量比为1：6；所述熏倒牛浸膏状提取物与大孔树脂填料的质量比为1：10；所述收集的洗脱液为体积分数60％乙醇洗脱液。
[0026]
本发明还提供了上述熏倒牛提取物在制备抗惊厥药中的用途。
[0027]
本发明还提供了一种制备熏倒牛提取物的方法，所述制备的方法如上所述。
[0028]
本发明还提供了一种抗惊厥药，它是以上述熏倒牛提取物为活性成分，加上药学上常用的辅料制得的制剂；所述制剂优选为片剂、气雾剂、颗粒剂、缓释剂、滴鼻剂、冲剂、胶囊剂或膜剂。
[0029]
本发明中，体积分数为10～95％的乙醇即指体积分数为10～95％的乙醇水溶液。
[0030]“bv”指柱体积。
[0031]
本发明提供的熏倒牛提取物与现有技术相比具有以下优点：
[0032]
1、本发明提供的熏倒牛提取物能够明显地降低小鼠的惊厥数/惊厥率，显著缩短小鼠惊厥持续时间，显著延长惊厥潜伏期，具有良好的抗惊厥作用，能够预防/治疗高热惊厥、抽搐、痉挛等症状。本发明提供的熏倒牛提取物在制备安全、高活性的抗惊厥药物中应用前景广阔。
[0033]
2、本发明熏倒牛提取物的制备原料为熏倒牛全草，熏倒牛能大面积栽培，质量易于控制，本发明有效地降低了抗惊厥药的生产成本。
[0034]
3、本发明熏倒牛提取物的制备采用胶体磨-高压均质-膜分离联用技术，不仅能有效提高药材活性成分提取率和得率，减少生产过程中提取溶剂的消耗量，还能有效去除提取液中的泥沙、细菌、粘液质、鞣质、果胶和一些大分子物质杂质，降低设备投资和能耗，该熏倒牛提取物性质稳定、制备工艺简单。
[0035]
4、本发明熏倒牛提取物的制备采用大孔树脂富集、硅胶柱层析分离工艺，提高了提取物中抗惊厥活性成分的纯度，且大孔树脂、硅胶可以再生循环使用，可有效降低生产成本。
[0036]
5、本发明熏倒牛提取物的生产工艺简单，技术参数易于控制，适应范围广，可用于工业化大规模生产，形成生物医药产品产业链。
[0037]
显然，根据本发明的上述内容，按照本领域的普通技术知识和惯用手段，在不脱离本发明上述基本技术思想前提下，还可以做出其它多种形式的修改、替换或变更。
[0038]
以下通过实施例形式的具体实施方式，对本发明的上述内容再作进一步的详细说明。但不应将此理解为本发明上述主题的范围仅限于以下的实例。凡基于本发明上述内容所实现的技术均属于本发明的范围。
具体实施方式
[0039]
本发明所用原料与设备均为已知产品，通过购买市售产品所得。
[0040]
实施例1藏药熏倒牛提取物的制备
[0041]
⑴
将熏倒牛全草经人工挑拣、清洗、除杂后，室内阴干，粉碎后过40目筛，得到熏倒牛药材粉；
[0042]
⑵
将上述熏倒牛药材粉与体积分数为95％的乙醇按1：5(g/ml)的料液比在20℃温度下进行水浴加热提取，48h后得到提取液；
[0043]
⑶
所述提取液经胶体磨研磨10次后，在1mpa的压力下进行均质，离心分离后得到上清液；
[0044]
⑷
将所述上清液以0.1t/h的流速经孔径为10μm的陶瓷膜在温度为75℃、压力为3mpa的条件下分离除杂，得到滤液，经减压浓缩后得熏倒牛浸膏状提取物；
[0045]
⑸
将上述熏倒牛浸膏状提取物与体积分数为60％的乙醇按1:5的质量比混合溶解，经ab-8大孔吸附树脂吸附后，先用6倍柱体积去离子水洗脱至无糖，再分别用2倍柱体积、体积分数为20％、40％、60％、80％、95％的乙醇台阶梯度洗脱，收集体积分数为80％的乙醇洗脱液后减压浓缩至浸膏，得熏倒牛提取粗品。其中，熏倒牛浸膏状提取物与ab-8大孔树脂的质量比为1：12(g/g)；
[0046]
⑹
将所述熏倒牛提取粗品经硅胶柱色谱分离后，用2倍柱体积的石油醚/乙酸乙酯混合溶剂洗脱，按照每份300ml收集馏分，通过薄层色谱检测收集比移值(r
f
)为0.6的馏分，经减压浓缩干燥，即得黄色粉末状的熏倒牛提取物，按熏倒牛全草计收率为0.23％。其中，石油醚/乙酸乙酯混合溶剂是指将石油醚和乙酸乙酯按7：1的体积比(ml/ml)混合而得的溶剂；熏倒牛提取粗品与硅胶填料质量比为1：20(g/g)；硅胶柱的尺寸为50mm
×
80mm；硅胶规格为100～200目；薄层色谱检测的条件：展开剂为石油醚/乙酸乙酯按6：1的体积比(ml/ml)混合而成的混合溶剂，显色剂为体积浓度10％的浓硫酸乙醇溶液；减压浓缩干燥的条件是指真空度为0.03mpa，温度45℃。
[0047]
实施例2藏药熏倒牛提取物的制备
[0048]
⑴
将熏倒牛全草经人工挑拣、清洗、除杂后，室内阴干，粉碎后过300目筛，得到熏倒牛药材粉；
[0049]
⑵
将上述熏倒牛药材粉与体积分数为10％的乙醇按1：80(g/ml)的料液比在80℃温度下进行水浴加热提取，0.5h后得到提取液；
[0050]
⑶
所述提取液经胶体磨研磨1次后，在200mpa的压力下进行均质，离心分离后得到上清液；
[0051]
⑷
将所述上清液以10t/h的流速经孔径为0.01μm的陶瓷膜在温度为15℃、压力为0.005mpa的条件下分离除杂，得到滤液，经减压浓缩后得熏倒牛浸膏状提取物；
[0052]
⑸
将上述熏倒牛浸膏状提取物与体积分数为80％的乙醇按1:7的质量比混合溶解，经dm301大孔吸附树脂吸附后，先用6倍柱体积去离子水洗脱至无糖，再分别用20倍柱体积、体积分数为20％、40％、60％、80％、95％的乙醇台阶梯度洗脱，收集体积分数为60％的乙醇洗脱液后减压浓缩至浸膏，得熏倒牛提取粗品。其中，熏倒牛浸膏状提取物与dm301大孔树脂的质量比为1：7(g/g)；
[0053]
⑹
将所述熏倒牛提取粗品经硅胶柱色谱分离后，用7倍柱体积的石油醚/乙酸乙酯混合溶剂洗脱，按照每份800ml收集馏分，通过薄层色谱检测收集比移值(r
f
)为0.4的馏分，经减压浓缩干燥，即得黄色粉末状的熏倒牛提取物，按熏倒牛全草计收率为0.40％。其中，石油醚/乙酸乙酯混合溶剂是指将石油醚和乙酸乙酯按1：1的体积比(ml/ml)混合而得的溶剂；熏倒牛提取粗品与硅胶填料质量比为1：8(g/g)；硅胶柱的尺寸为150mm
×
200mm；硅胶规格为100～200目；薄层色谱检测的条件：展开剂为石油醚/乙酸乙酯按6：1的体积比(ml/ml)混合而成的混合溶剂，显色剂为体积浓度10％的浓硫酸乙醇溶液；减压浓缩干燥的条件是指真空度为0.09mpa，温度75℃。
[0054]
实施例3藏药熏倒牛提取物的制备
[0055]
⑴
将熏倒牛全草经人工挑拣、清洗、除杂后，室内阴干，粉碎后过60目筛，得到熏倒牛药材粉；
[0056]
⑵
将上述熏倒牛药材粉与体积分数为90％的乙醇按1：30(g/ml)的料液比在60℃温度下进行水浴加热提取，4h后得到提取液；
[0057]
⑶
所述提取液经胶体磨研磨3次后，在50mpa的压力下进行均质，离心分离后得到上清液；
[0058]
⑷
将所述上清液以1t/h的流速经孔径为0.2μm的陶瓷膜在温度为55℃、压力为1mpa的条件下分离除杂，得到滤液，经减压浓缩后得熏倒牛浸膏状提取物；
[0059]
⑸
将上述熏倒牛浸膏状提取物与体积分数为70％的乙醇溶液按1:6的质量比混合溶解，经ab-8大孔吸附树脂吸附后，先用6倍柱体积去离子水洗脱至无糖，再分别用5倍柱体积、体积分数为20％、40％、60％、80％、95％的乙醇台阶梯度洗脱，收集体积分数为60％的乙醇洗脱液后减压浓缩至浸膏，得熏倒牛提取粗品。其中，熏倒牛浸膏状提取物与ab-8大孔树脂的质量比为1：10(g/g)；
[0060]
⑹
将所述熏倒牛提取粗品经硅胶柱色谱分离后，用6倍柱体积的石油醚/乙酸乙酯混合溶剂洗脱，按照每份500ml收集馏分，通过薄层色谱检测收集比移值(r
f
)为0.5的馏分，经减压浓缩干燥，即得黄色粉末状的熏倒牛提取物，按熏倒牛全草计收率为0.43％。其中，石油醚/乙酸乙酯混合溶剂是指将石油醚和乙酸乙酯按3：1的体积比(ml/ml)混合而得的溶剂；熏倒牛提取粗品与硅胶填料质量比为1：15(g/g)；硅胶柱的尺寸为100mm
×
200mm；硅胶规格为100～200目；薄层色谱检测的条件：展开剂为石油醚/乙酸乙酯按6：1的体积比(ml/ml)混合而成的混合溶剂，显色剂为体积浓度10％的浓硫酸乙醇溶液；减压浓缩干燥的条件是指真空度为0.08mpa，温度60℃。
[0061]
对照例1对照藏药熏倒牛提取物的制备方法
[0062]
(1)将熏倒牛全草经人工挑拣、清洗、除杂后，室内阴干，粉碎后过60目筛，得到熏倒牛药材粉；
[0063]
(2)将上述熏倒牛药材粉与体积分数为90％的乙醇按1：30(g/ml)的料液比在60℃温度下进行水浴加热提取，4h后得到熏倒牛提取液；
[0064]
(3)熏倒牛提取液经减压浓缩干燥，即得熏倒牛提取物；其中，减压浓缩干燥的条件是指真空度为0.08mpa，温度60℃。
[0065]
以下通过实验例证明本发明的有益效果。
[0066]
实验例1、本发明熏倒牛提取物的抗惊厥作用测试
[0067]
1、实验方法
[0068]
最大电休克(mes)致惊厥药理实验：使用40ma、50hz、0.5ms的交流电，于健康c57bl/6雄性小鼠双耳尖部涂抹0.9％生理盐水，连接电极后给予电刺激，小鼠阵挛或后肢强直时认定为惊厥。正式实验前一天进行预筛，出现惊厥的小鼠用于实验。取筛选过的小鼠按照随机数字表法分为14组，每组10只。分别为0.9％生理盐水组、阳性药物对照组(地西泮5mg/kg)、实施例1～3熏倒牛提取物低、中、高剂量组(5、25、65mg/kg)、对照例1熏倒牛提取物低、中、高剂量组(5、25、65mg/kg)。分别于腹腔注射药物0.5、1、2、3、4h后，认真观察，以小鼠阵挛性发作数或强直性发作数作为惊厥指标，记录惊厥小鼠的数量。
[0069]
戊四唑致小鼠惊厥药理实验：将健康c57bl/6雄性小鼠随机分为14组，每组10只，分别0.9％生理盐水组、阳性药物对照组(地西泮5mg/kg)，实施例1～3熏倒牛提取物低、中、高剂量组(5、25、65mg/kg)、对照例1熏倒牛提取物低、中、高剂量组(5、25、65mg/kg)，连续灌胃给药5d，每天上午10：00时给药一次。于末次给药1h后，每组小鼠腹腔注射戊四唑(72mg/kg)，每只小鼠单独放置笼子里观察30min。以全身阵挛性或后肢强直性(持续5s或以上)惊厥为观察指标，以给药后至出现第一次阵挛或强直发作为惊厥潜伏期，以阵挛或强直发作出现的时间为惊厥持续时间，记录小鼠惊厥数量、惊厥潜伏期、惊厥持续时间。
[0070]
2、实验结果
[0071]
表1熏倒牛提取物抗最大电休克(mes)致小鼠惊厥的实验结果(n＝10)
[0072][0073][0074]
注：与生理盐水组相比，
a
p<0.01,
b
p<0.05；与相同剂量下对照熏倒牛提取物相比，
c
p<0.01,
d
p<0.05。
[0075]
表2熏倒牛提取物抗戊四唑致小鼠惊厥的实验结果(n＝10)
[0076][0077][0078]
注：与生理盐水组相比，
**
p<0.01，
*
p<0.05；与相同剂量下对照熏倒牛提取物相比，
#
p<0.05。
[0079]
实验结果如表1和表2所示。可以看出，与生理盐水组相比，本发明实施例1～3所得的熏倒牛提取物能够有效地降低小鼠的惊厥数/惊厥率，具有良好的抗惊厥作用；尤其是高、中剂量组能够显著减少小鼠惊厥数，显著缩短小鼠惊厥持续时间，使惊厥潜伏期显著延长。
[0080]
此外，与对照熏倒牛提取物相比，本发明实施例1～3提取得到的熏倒牛提取物在相同剂量下的抗惊厥活性也显著提高(p<0.05)。
[0081]
综上，本发明提供了一种熏倒牛提取物及其在制备抗惊厥药中的用途。该熏倒牛提取物能够明显地降低小鼠的惊厥数/惊厥率，显著缩短小鼠惊厥持续时间，显著延长惊厥潜伏期，具有良好的抗惊厥作用，能够预防/治疗高热惊厥、抽搐、痉挛等症状。本发明提供的熏倒牛提取物在制备安全、高活性的抗惊厥药物中应用前景广阔。