动物双歧杆菌在提高肿瘤免疫治疗应答中的作用的制作方法

本公开涉及生物医药领域，更具体地，它涉及使用微生物来提高肿瘤免疫治疗应答。

背景技术：

癌症是一种死亡率极高的恶性疾病，治疗难度高，死亡率高，会给患者及其家庭带来沉重的负担。近年来，全球癌症患者激增，最新数据表明：2017年，全球新发癌症病例2450万，癌症死亡病例960万。全球发病率排在前10位的癌症分别为：非黑色素瘤皮肤癌(non-melanomaskincancer，nmsc)、tbl(tracheal，bronchusandlung)癌、乳腺癌、结直肠癌、前列腺癌、胃癌、肝癌、宫颈癌、非霍奇金淋巴瘤和膀胱癌。全球死亡率排在前10位的癌症分别为：tbl癌、结直肠癌、胃癌、肝癌、乳腺癌、胰腺癌、食管癌、前列腺癌、宫颈癌和非霍奇金淋巴瘤。

结直肠癌(colorectalcancer，crc)，又称为大肠癌、直肠癌、大肠直肠癌、结肠直肠癌、或肠癌，为源自结肠或直肠(为大肠的一部分)的癌症。因为细胞不正常的生长，可能侵犯或转移至身体其他部分，结直肠癌是全球最常见的恶性肿瘤之一。根据世界卫生组织(who)报道，结直肠癌是男性第三位和女性第二位常见的恶性肿瘤。据最新数据报道：目前crc在全球发病率排4位，死亡率排2位。

pd-1(programmeddeath1，程序性死亡受体1)是由t细胞表达的一类免疫检查点(immunecheckpoint)分子，为cd28超家族成员。pd-1是一类重要的免疫抑制分子，其作为“关闭的开关”发挥功能，抑制t细胞攻击体内的其它细胞。当t细胞表面的pd-1与体内正常细胞上表达的pd-1配体pd-l1(programmeddeathligand-1，程序性死亡配体1)时，t细胞的细胞杀伤效果受到抑制。肿瘤细胞利用这一机制逃避t细胞的免疫攻击，其表达大量pd-l1，以与t细胞表面的pd-1结合，抑制其细胞杀伤效果。针对pd-1或pd-l1免疫检查点的抑制剂，例如单克隆抗体药物能够阻断pd-1与pd-l1结合，抑制其下游信号传导，从而增强t细胞对肿瘤细胞的免疫杀伤作用。

然而，以pd-1/pd-l1抑制剂为代表的免疫检查点抑制剂在癌症治疗方面也存在诸多问题，其中以响应率低最为突出。研究表明，靶向pd-1/pd-l1的药物治疗的患者响应率通常不超过40％，而采用ctla-4单抗药物-ipilimumab治疗的患者其响应率仅约为15％，并且其中一部分患者仅为局部应答。此外，此类治疗还存在以下问题：起效慢，其中位起效时间为12周，可能会耽误患者的救治时间；部分患者治疗效果较差；在患者体内引起副作用，诸如结肠炎、腹泻、皮炎、肝炎、内分泌疾病等免疫相关不良反应(immune-relatedadverseevents,iraes)，可能导致治疗提前终止；以及价格昂贵，令普通患者难以承担。

动物双歧杆菌乳亚种(bifidobacteriumanimalissubsp.lactis)为革兰氏染色阳性，不运动，不形成芽孢，不规则的杆状厌氧菌，发酵多种糖类，但不发酵淀粉，最适生长温度为39-42℃。

动物双歧杆菌乳亚种nexstrain02是从健康儿童粪便中分离得到，前期研究表明其具有缓解便秘和急慢性腹泻的益生功能。该菌2020年07月27日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为：cgmccno.20455。

将动物双歧杆菌乳亚种nexstrain02连续传代100代，提取a0、a50及a100代的dna，进行全基因组测序及分析。结果显示a0、a50及a100代的全基因组序列mumi值为0，说明该菌序列保守性高。

技术实现要素：

为了解决上述技术问题，本公开的目的在于提供一种微生物制剂，及其与免疫信号通路调节剂联合，用于治疗肿瘤患者，以提高肿瘤对免疫治疗的应答。

具体来讲，本公开提供了以下技术方案：

在一方面，本公开提供一种益生菌在制备用于肿瘤治疗的药物或试剂盒中的用途，所述益生菌包括动物双歧杆菌乳亚种(bifidobacteriumanimalissubsp.lactis)。

根据前述的用途，所述益生菌包括动物双歧杆菌乳亚种nexstrain02(保藏编号：cgmccno.20455)。

根据前述的用途，所述益生菌包括与动物双歧杆菌乳亚种nexstrain02的进化距离小于0.00004的细菌。

根据前述的用途，所述益生菌包括与动物双歧杆菌乳亚种nexstrain02的进化距离小于0.00003的细菌。

根据前述的用途，所述益生菌包括与动物双歧杆菌乳亚种nexstrain02的进化距离小于0.00002的细菌。

根据前述的用途，所述益生菌包括与动物双歧杆菌乳亚种nexstrain02的进化距离小于0.00001的细菌。

根据前述的用途，所述益生菌包括与动物双歧杆菌乳亚种nexstrain02的进化距离为0的细菌。

根据前述的用途，所述进化距离通过使用parsnp软件的suffixtree的算法来计算两个基因组之间的mum(maximaluniquematch)，使用mum来计算mumi，所述mumi的值即为两个基因组之间的距离，mumi计算方法为：

mumi＝1-lmum/lav，

所述lmum是指所有mums的碱基数，lav是指两个基因组碱基数的均值

根据前述任一方面的用途，所述治疗还包括应用一种或多种其它肿瘤治疗药物，优选地，所述肿瘤治疗药物为免疫信号通路调节剂，优选地，所述免疫信号通路调节剂选自pd-1/pdl-1、pd-1/pdl-2、cd28/b7-1(cd80)、cd28/b7-2(cd86)、ctla4/b7-1(cd80)、cila4/b7-2(cd86)、4-1bb(cd137)/4-1bbl(cd137l)、icos/b7rp1、cd40/cd40l、疱疹病毒进入调控因子(herpesvirusentrymediator，hvem)/b-及t-淋巴细胞衰减因子(b-andt-lymphocyteattenuator,btla)、ox40/ox40l、cd27/cd70、gitr/gitrl、kir/mhc、淋巴细胞活化基因3(lag3或cd223)/mhc、tim3/tim3配体的黏蛋白结构域、带有ig与itim结构域(tigit)/cd96的t细胞免疫受体、tigit/cd226中的一种或多种的试剂，更优选地，所述免疫信号通路调节剂为pd-1抑制剂，最优选为pd-1抗体。

根据前述任一方面的用途，所述肿瘤为消化道肿瘤，优选地，所述肿瘤为结直肠癌。

根据前述任一方面的用途，所述药物或试剂盒用于肿瘤免疫治疗，优选地，所述药物或试剂盒能够提高患者对pd-1抑制剂的治疗应答，更优选地，所述药物或试剂盒能够延长患者生存期、抑制肿瘤生长，和/或提高肿瘤部位抗肿瘤免疫细胞的富集，优选地，所述抗肿瘤免疫细胞选自cd4+cd62l-cd44+、cd8+ifn-gamma+，cd4+tnf-alpha+、cd11c+cd86+和/或gr-1+cd86+中的一种或多种。

根据前述任一方面的用途，所述药物或试剂盒能够同时提高患者对pd-1抑制剂的治疗应答、延长患者生存期、抑制肿瘤生长、提高肿瘤部位抗肿瘤免疫细胞的富集，所述抗肿瘤免疫细胞包括cd4+cd62l-cd44+、cd8⁺ifn-gamma+，cd4+tnf^-alpha+、cd11c+cd86+和gr-1+cd86+，以及所述药物或试剂盒相较于单独使用免疫信号通路调节剂的治疗能够提高肿瘤部位cd8+ifn-gamma+，cd4+tnf-alpha+，cd11c+cd86+和gr-1+cd86+抗肿瘤免疫细胞的富集。

根据前述任一方面的用途，所述益生菌的单次用量为至少1-20x10⁹cfu、或至少2-18x10⁹cfu、或至少3-15x10⁹cfu、或至少4-12x10⁹cfu；优选地，所述益生菌的单次用量为至少5-10x10⁹cfu。

根据前述任一方面的用途，所述药物或试剂盒为口服制剂，优选冻干粉、片剂、胶囊剂、溶液剂、混悬剂的一种或多种。

根据前述任一方面的用途，所述益生菌和所述其它肿瘤治疗药物同时使用。

根据前述任一方面的用途，所述益生菌和所述其它肿瘤治疗药物不同时使用。

本公开的方法使用动物双歧杆菌乳亚种，能提高消化道肿瘤免疫治疗应答，提高患者存活率，延长存活时间。口服的治疗方式简单，无创，对患者身体基本不会造成额外伤害。动物双歧杆菌乳亚种菌粉发酵冻干工艺成熟稳定，能够用于大量生产。

附图说明

图1本公开小鼠结肠癌ct26模型实验设计流程图

图2本公开实施例1小鼠结肠癌ct26模型各组肿瘤生长曲线

图3本公开实施例1小鼠结肠癌ct26模型各组动物kaplan-meier生存曲线

图4本公开实施例2细胞流式分析各组cd4+cd62l+cd44+表达量比较

图5本公开实施例2细胞流式分析各组cd4+tnf-alpha+表达量比较

图6本公开实施例2细胞流式分析各组cd8+ifngamma+表达量比较

图7本公开实施例2细胞流式分析各组gr-1+cd86+表达量比较

图8本公开实施例3小鼠结肠癌ct26模型各组肿瘤生长曲线

图9本公开实施例3小鼠结肠癌ct26模型各组动物kaplan-meier生存曲线

图10本公开实施例4nexstrain02培养上清对thp-1细胞il-6表达的作用

图11本公开实施例4nexstrain02活菌对thp-1细胞il-6表达的作用

具体实施方式

根据本公开的上述内容，按照本领域的普通技术知识和惯用手段，在不脱离本公开上述基本技术思想前提下，还可以做出其它多种形式的修改、替换或变更。

i.定义

免疫信号通路调节剂

免疫细胞信息传递途径可由细胞上的一或多个以下示例性的受体/配体对调节：pd1/pdl1、pd1/pdl2、cd28/b7-1(cd80)、cd28/b7-2(cd86)、ctla4/b7-1(cd80)、cila4/b7-2(cd86)、4-1bb(cd137)/4-1bbl(cd137l)、icos/b7rp1、cd40/cd40l、疱疹病毒进入调控因子(herpesvirusentrymediator,hvem)/b-及t-淋巴细胞衰减因子(b-andt-lymphocyteattenuator,btla)；ox40/ox40l、cd27/cd70、gitr/gitrl、kir/mhc、淋巴细胞活化基因3(lag3或cd223)/mhc、a型肝炎病毒细胞受体2(hepatitisaviruscellularreceptor2,havcr2；也称为t细胞免疫球蛋白与含有-3(tim3))/tim3配体的黏蛋白结构域、带有ig与itim结构域(tigit)/cd96的t细胞免疫受体，以及tigit/cd226。免疫细胞信息途径也可由一或多种以下示例性的细胞激素/化学激活素及其同源细胞表面受体调节：白介素2(il-2)/cd122、腺苷/腺苷a2a受体(adenosinea2areceptor,a2ar)、白介素6(il-6)/il6r(cd126)、白介素10(il-10)/il-10r、白介素15(il-15)/il-15r、转化生长因子β(tgfβ)/tgfβr，以及巨噬细胞群落刺激因子1(csf-1)/csf-1r。其他免疫分子包括，但不限于，kir2dl、vista、hlla2、tlia、dnam-1、ceacam1、cd155，以及吲哚胺2，3-二氧酶(ido)，如ido1。上述任何免疫分子可作为如本公开所述的抗癌疗法的目标。

如本公开所用，“免疫信号通路调节剂”是指相对于对照载剂，改变免疫分子(例如，如本公开所述的任何一种)的活性的试剂。“调节剂”一词在本公开中以最广泛的含义使用，且包括部分或完全改变由一或多种免疫分子调节的信息途径的任何分子，包括由如本公开所述的分子调节的信息传导途径。

于一些情况下，免疫信号通路调节剂为一种免疫检查点分子的抑制剂，其可以减少、减缓、停止，及/或阻止由该检查点分子调节的活性。“抑制剂”一词在本公开中以最广泛的含义使用，并且包括部分或完全阻断、抑制，或中和由一或多种免疫检查点分子调节的信息途径的任何分子，包括由如本公开所述的分子调节的调节途径。合适的抑制分子具体包括天然多胜肽、胜肽、反义寡核苷酸、小的有机分子、重组蛋白或胜肽等的拮抗剂抗体或抗体片段、片段或胺基酸序列变体。

在其他情况下，免疫信号通路调节剂为免疫分子的活化剂，其增强及改善由该免疫分子调节的活性。“活化剂”一词在本公开中以最广泛的含义使用，且包括增强由一或多种免疫分子调节的信息途径的任何分子，包括由如本公开所述的分子调节的信息传导途径。合适的活化剂包括激动性抗体或抗体片段、小的有机分子、重组蛋白质或胜肽等。于一些情况下，活化剂可为免疫分子的激动性抗体，例如medi0562(人源化ox40激动性抗体)、medi6469(小鼠ox4激动剂)；以及medi6383(ox40激动剂)。

识别这种调节剂的方法为本领域公知的。例如，可以使候选调节剂与合适的免疫分子目标接触，且可通过常规测定法测量由该免疫分子调节的信息传导的强度。在候选调节剂存在下，相对于空白对照的信息传导的可检测的变化表明，候选调节剂具有免疫分子的调节活性。

药物或药物组合物

本公开所述的健康人肠道菌群的菌液，与一种或多种辅料如佐剂、载体或稀释剂一起，可以置入药物组合物、单位剂量(unitdosages)或剂型(dosageforms)的形式中。所述药物组合物可以固体剂型(如粉剂、颗粒剂、丸粒剂、包衣或未包衣的片剂或经填充的胶囊)或液体的剂型(如溶液、混悬液、乳液或填充其的胶囊)或半固体剂型(如凝胶、霜剂和软膏)采用。药物剂型的一种或多种活性成分的溶解和释放特性可以在数秒至数月的范围内变化。

所述“药物”或“药物组合物”被设计用于在动物和人中的用途并可以经所有给药途径施用。优选的给药途径是口服途径、肺途径、鼻途径、直肠途径、肠胃外途径。此种药物组合物及其单位剂型可以常规或特别的比例包含常规的或新的成分，具有或不具有另外的活性化合物或成分，并且此种单位剂型可包含与目的日剂量范围相称的待采用的任何适宜有效量的活性成分。

应用于本公开的药物组合物的术语“载体”涉及与活性化合物一起施用的稀释剂、辅料或赋形剂。

本公开的药物或药物组合物可以经口地、局部地、肠胃外地或粘膜地(例如，含服地、通过吸入或直肠地)以包含常规的非-毒性药学可接受的载体的剂量单位配制剂施用。通常希望使用口服途径。所述活性试剂可以经口地以胶囊、片剂等形式(参见remington：thescienceandpracticeofpharmacy，20thedition)施用。

对于以片剂或胶囊形式的口服给药，活性药物组分可以与非-毒性的、药学可接受的辅料如粘结剂(例如，预胶化的玉米淀粉、聚乙烯吡咯烷酮或羟丙基甲基纤维素)；填料(例如，乳糖、蔗糖、葡萄糖、甘露糖醇、山梨糖醇和其它还原性和非-还原性糖类、微晶纤维素、硫酸钙或磷酸氢钙)；润滑剂(例如，硬脂酸镁、滑石粉或硅土、硬脂酸、硬脂基富马酸酯钠、甘油二十二烷酸酯、硬脂酸钙等)；崩解剂(例如，马铃薯淀粉或羟乙酸淀粉钠)；或润湿剂(例如，月桂基硫酸钠)、着色剂和调味剂、明胶、甜味剂、天然和合成的胶(如阿拉伯胶、黄蓍胶或藻朊酸盐)、缓冲盐、羧甲纤维素、聚乙二醇、蜡、等。对于以液体形式的口服给药，所述药物组分可以与非-毒性、药学可接受的惰性载体(例如，乙醇、甘油、水)、防沉降剂(例如，山梨糖醇糖浆、纤维素衍生物或氢化的可食用脂肪)、乳化剂(例如，卵磷脂或阿拉伯胶)、非-水性载体(例如，扁桃油、油酯类、乙醇或经分馏的植物油)、保藏剂(例如，p-羟基苯甲酸甲酯或p-羟基苯甲酸丙酯或山梨酸)等组合。还可以加入稳定剂如抗氧化剂(bha、bht、桔酸丙酯、抗坏血酸钠、柠檬酸)以稳定所述剂型。

包含作为活性化合物的片剂可以通过本领域熟知的方法包衣。包含作为活性化合物的式i化合物的本公开的所述组合物还可以引入小珠、微球或微胶囊，例如由聚乙醇酸/乳酸(pgla)构建的。用于口服给药的液体的制剂可以采取例如溶液，糖浆剂，乳液或混悬液的形式或者它们可以呈现为在使用前用水或其它适宜的辅料重构的干产品。用于口服给药的制剂可以适宜地配制以使活性化合物受控或延迟地释放。

本公开的药物或药物组合物可以经肠胃外递送，即，通过静脉内(i.v.)、脑室内(i.c.v.)、皮下(s.c.)、腹膜内(i.p.)、肌内(i.m.)、皮下(s.d.)或皮内(i.d.)施用，通过直接注射，经例如快速浓注或连续输液。用于注射的配制剂可以单位剂型呈现，例如在具有添加的保藏剂的安瓿瓶或多-剂量容器中。所述组合物可以采用赋形剂(excipient)的形状，在油或水性载体中的混悬液、溶液或乳液的形式，并可以包含配制试剂如防沉降剂、稳定剂和/或分散剂。备选地，所述活性成分可以以粉末形式在使用前用适宜的载体(例如无菌无热原水)重构。

本公开的药物或药物组合物还可以配制用于直肠给药，例如呈栓剂或保留灌肠(例如，包含常规栓剂基质如可可油或其它甘油酯)。

联合治疗方法

本公开提供了使用如本公开所述的免疫信号通路调节剂与健康人肠道菌群的菌液的联合癌症疗法。本公开所用的“联合疗法”一词包括以顺序方式施用这些药剂(例如，免疫信号通路调节剂与健康人肠道菌群的菌液)，即其中每种治疗剂在不同时间施用，以及施用这些治疗剂，或至少二种药剂，基本上同时进行。每种试剂的顺序，或基本上同时给药，可受任何适当途径的影响，包括，但不限于，口服途径、静脉内途径、肌肉内、皮下途径，以及通过黏膜组织的直接吸收。药剂可以通过相同的途径或不同的途径来施用。例如，可以口服给予第一药剂(例如，健康人肠道菌群的菌液)，而以静脉内施用第二药剂(例如，抗pd1抗体等抗检查点抗体)。此外，选择的组合剂可通过静脉内注射施用，而组合的其它药剂可以口服给药。或者，例如，可以通过静脉内或皮下注射施用二种或更多种药剂。

联合疗法还可包括如本公开所述的药剂(例如，免疫信号通路调节剂与发酵的组合物)进一步与其它生物活性成分(例如，不同的抗肿瘤剂)以及非药物治疗(例如，手术或放射治疗)组合的施用。在联合疗法进一步包含放射治疗的情况下，放射治疗可以在任何合适的时间进行，只要从治疗剂的组合与放射治疗的共同作用获得有益的效果即可。例如，在适当的情况下，当放射治疗暂时从治疗剂的给药中除去时，可能达到几天甚至数周，仍可达到该有益效果。

应当理解的是，免疫信号通路调节剂与如本公开所述的菌液的任何组合可以治疗癌症的任何顺序使用。可基于许多因素来选择本公开所述的组合，该因素包括，但不限于，抑制或预防癌症进展的有效性、减轻组合的另一种药物的副作用的有效性，或缓解癌症相关症状的有效性。例如，如本公开所述的联合疗法可减少与组合的每个单独成员相关联的任何副作用。下列表格中提供了一些示例。例如，该健康人肠道菌群的菌液可以在涉及免疫信号通路调节剂(例如，抗pd1抗体)的治疗过程中每天使用。

在一些实施方案中，本公开所述的免疫信号通路调节剂与如本公开所述的菌液的组合是以试剂盒的形式提供。所述试剂盒包含免疫信号通路调节剂，以及本公开所述的菌液。在一些情况下，本公开的试剂盒还可以包含其他必要的试剂。应当理解的是，本公开的试剂盒中的各种组分可以治疗癌症的任何顺序使用。

如本公开所述的免疫信号通路调节剂与健康人肠道菌群的菌液的任何组合可用于治疗癌症。本公开所用的“癌症”一词是指由肿瘤或恶性细胞群、增殖或转移调节的医学病症，包括固体癌症及非固体癌症。癌症的实例包括，但不限于，肺癌、肾癌、胃癌、乳腺癌、脑癌、前列腺癌、肝细胞癌、胰腺癌、子宫颈癌、卵巢癌、肝癌、膀胱癌、尿道癌、甲状腺癌、黑素瘤、头颈癌、结肠癌、白血病、淋巴瘤、皮肤癌、胃癌、食管癌、骨髓瘤、直肠癌、骨癌、子宫癌、前列腺癌，以及血液恶性肿瘤。

“个体”、“个人”以及“患者”等词在本公开中可互换使用，而且是指被评估用于治疗及/或被治疗的哺乳动物。个体可为人类，但亦包括其他哺乳动物，特别是可用作人类疾病实验室模型的那些哺乳动物，例如，小鼠、大鼠、兔、狗等。

如本公开所用，“有效量”是指对个体赋予治疗效果所需的每种活性剂(例如，免疫信号通路调节剂，例如，抗pd1抗体或健康人肠道菌群的菌液)的量，不论是单独或组合地与一或多种其它活性剂施用。于一些具体实施例中，治疗效果为抑制癌细胞生长及/或减少肿瘤负担。于一些具体实施例中，健康人肠道菌群的菌液的量对增强免疫信号通路调节剂的抗癌作用是有效的。在其它具体实施例中，健康人肠道菌群的菌液的量对增强个体对癌细胞的免疫力是有效的。于一些具体实施例中，治疗效果为预防或抑制肿瘤生长。于一些具体实施例中，治疗效果为与一种或多种药物/药物相关的副作用的降低。例如，可能由抑制pd-1途径(例如，疲劳、末梢水肿、发冷、发热、腹泻、恶心、腹痛、咳嗽、呼吸困难、皮疹、瘙痒、白斑病、关节痛、肌痛、背痛、头痛、头晕，及/或增加的天门冬胺酸胺基转移酶(ast))的副作用可通过与另一种药剂(例如，免疫信号通路调节剂与如本公开所述的健康人肠道菌群的菌液)的共同治疗而减轻。

如本公开所用，“治疗”一词是指将包括一或多种活性剂的组合物应用或施用于一个体，该个体患有目标疾病或病症、疾病/病症的症状，或对该疾病/病症的倾向，且其目的为治愈、治疗、缓解、减轻、改变、补救、改善、增进，或影响疾病、疾病症状，或对该疾病或病症的倾向。

缓解目标疾病/病症包括推迟疾病的发展或进展，或降低疾病严重程度。缓解疾病并不一定需要治疗结果。如其中所使用的，“延迟”目标疾病或病症的发展意指推迟、阻止、缓慢、妨碍、稳定，及/或推迟疾病进展。这样的延迟可为不同的时间长度，这取决于疾病的历史及/或被治疗的个体。一种“延迟”或减轻疾病发展，或推迟疾病发病的方法，为减少在给定时间框架内发展一或多种疾病症状的可能性，及/或在给定的时间框架内减少症状程度的方法，与未使用该方法者进行比较。这种比较通常基于临床研究，使用足以给出统计学显著结果的多个个体。

疾病的“发展”或“进展”意指疾病的初始表现及/或随后的进展。可使用本领域熟知的标准临床技术检测并评估疾病的发展。然而，发展亦指可能无法检测的进展。为了本发明的目的，发展或进展是指该症状的生物学过程。“发展”包括发生、复发及发病。如本公开所用，目标疾病或病症的“发作”或“发生”包括初始发作及/或复发。

在一些具体实施例中，如本公开所述的免疫信号通路调节剂与健康人肠道菌群的菌液的组合，以足以将一或多种目标信息传导途径的活性体内抑制至少20％(例如，30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％或更高)的量，施用于需要治疗的个体。在其它具体实施例中，该组合以将一或多种目标抗原的活性程度降低至少20％(例如30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％或以上)的有效量施用。

于一些具体实施例中，将如本公开所述的健康人肠道菌群的菌液给予已经接受或正在接受涉及使用免疫信号通路调节剂(例如，抑制剂)的抗癌疗法的个体(例如，人类癌症患者)，如本公开所述者。

医学领域的普通技术人员已知的常规方法，可用于根据待治疗的疾病的类型或疾病的部位，而向个体施用医药组合物。该组合物亦可通过其它常规途径施用，例如，口服、肠胃外、通过吸入喷雾、局部性、直肠、鼻腔、口腔、阴道，或经由植入的储库给药。本公开所用的“肠胃外”一词包括皮下、皮内、静脉内、肌内、关节内、动脉内、滑膜内、胸骨内、鞘内、脑内，以及颅内注射或输注技术。此外，其可通过可注射的贮库途径施用于个体，例如使用1、3或6个月储存罐注射或可生物降解的材料及方法。于一些实例中，该医药组合物在眼内或玻璃体内施用。

无论通过口服、直肠或肠胃外(包括静脉内的和皮下)或在某些情况下甚至局部途径，可以将本公开的式i活性成分或与一种或多种药物-可接受的辅料、载体或稀释剂，特别是和优选地以它们的药物组合物的形式，以有效量施用给需要其的对象，例如活动物(包括人)体，用于治疗、减轻或改善、缓解或消除对其敏感的适应症或病症或者阐述于本申请其它处的适应症或病症。

ii.具体实施方式

下面参照实施例进一步阐释本公开。对本公开的具体示例性实施方案的描述是为了说明和例证的目的。这些描述并非想将本公开限定为所公开的精确形式，并且很显然，根据本申请说明书的教导，可以进行很多改变和变化。对示例性实施例进行选择和描述的目的在于解释本公开的特定原理及其实际应用，从而使得本领域的技术人员能够实现并利用本公开的各种不同的示例性实施方案以及各种不同的选择和改变。

本公开的一个目的在于提供了一种用于肿瘤免疫治疗的益生菌组合物，所述益生菌包括动物双歧杆菌乳亚种(bifidobacteriumanimalissubsp.lactis)。

本公开的一个目的还在于提供一种肿瘤免疫治疗的药物组合物，所述药物组合物包含益生菌动物双歧杆菌乳亚种，以及药学上可接受的载体的药物组合物。

在一个优选的实施方案中，所述药物组合物为口服制剂，包括但不限于冻干粉、片剂、胶囊剂、溶液剂、混悬剂等。

在一个优选的实施方案中，所述益生菌为动物双歧杆菌乳亚种nexstrain02，其保藏编号为cgmccno.20455。所述动物双歧杆菌乳亚种nexstrain02，将动物双歧杆菌乳亚种nexstrain02连续传代100代，提取a0、a50及a100代的dna，进行全基因组测序及分析。结果显示a0、a50及a100代的全基因组序列间进化距离值为0，该菌序列保守性高。

在一个优选的实施方案中，所述益生菌包括与动物双歧杆菌乳亚种nexstrain02的进化距离小于0.00004，优选小于0.00003，或小于0.00002，或小于0.00001的细菌，最优选为与动物双歧杆菌乳亚种nexstrain02的进化距离为0的细菌。

在一个优选的实施方案中，所述进化距离通过使用parsnp软件(https://harvest.readthedocs.io/en/latest/content/parsnp.html)的suffixtree的算法来计算两个基因组之间的mum(maximaluniquematch，，http://europepmc.org/backend/ptpmcrender.fcgi？accid＝pmc148804&blobtype＝pdf)，使用mum来计算mumi(http://pdfs.semanticscholar.org/6904/381c6c908a6e18817f076b6f146c205856cf.pdf)，所述mumi的值即为两个基因组之间的距离，mumi计算方法为：mumi＝1-lmum/lav，所述lmum是指所有mums的碱基数，lav是指两个基因组碱基数的均值。

在一个优选的实施方案中，所述与动物双歧杆菌乳亚种nexstrain02的进化距离通过细菌全基因组测序及分析方法测定。

在一个优选的实施方案中，所述全基因组测序及分析方法包括细菌基因组dna提取及纯度检测、文库构建和测序、基因组组装、进化距离计算的步骤。

所述基因组dna提取及纯度检测、文库构建和测序、基因组组装、进化距离计算可以通过本领域的常规方法进行，例如生工细菌基因组dna快速抽提试剂盒进行提取dna，纯度检测方法包括但不限于nanodrop或qubit等。示例性地，所述文库构建和测序方法包括文库制备、文库质量检测、测序等步骤，所述基因组组装包括数据清理、基因组装等步骤，包括但不限于使用pcr扩增、高通量测序、kmer的debruijngraph算法组装等。进化距离计算可以使用例如parsnp软件计算不同菌株之间的mumi值，该mumi值即为两个基因组之间的距离。通过计算nextstrain50代、nextstrain100代和已公布的82株动物双歧杆菌(bifidobacteriumanimalis)与nextstrain10代之间的距离得到nextstrain0代、nextstrain50代和nextstrain100代之间的距离为0，其他82株已发表动物双歧杆菌(bifidobacteriumanimalis)亚种与nextstrain0代的最近距离为0.00003。

在一个优选的实施方案中，上述任意的组合物，所述益生菌的单次用量为至少1-20x10⁹cfu、或至少2-18x10⁹cfu、或至少3-15x10⁹cfu、或至少4-12x10⁹cfu，优选地为至少5-10x10⁹cfu。

在一个优选的实施方案中，上述肿瘤免疫治疗，还包括使用一种或多种其它肿瘤治疗药物。

优选地，所述其它肿瘤治疗药物为一种或多种免疫信号通路调节剂。

优选地，所述免疫信号通路调节剂包括本领域已知的任选地免疫信号通路调节剂，包括但不限于pd1/pdl1、pd1/pdl2、cd28/b7-1(cd80)、cd28/b7-2(cd86)、ctla4/b7-1(cd80)、cila4/b7-2(cd86)、4-1bb(cd137)/4-1bbl(cd137l)、icos/b7rp1、cd40/cd40l、疱疹病毒进入调控因子(herpesvirusentrymediator，hvem)/b-及t-淋巴细胞衰减因子(b-andt-lymphocyteattenuator,btla)、ox40/ox40l、cd27/cd70、gitr/gitrl、kir/mhc、淋巴细胞活化基因3(lag3或cd223)/mhc、tim3/tim3配体的黏蛋白结构域、带有ig与itim结构域(tigit)/cd96的t细胞免疫受体，以及tigit/cd226中的一种或多种的试剂；优选地，所述免疫信号通路调节剂为pd-1抑制剂，最优选为pd-1抗体。

本公开的一个目的还在于提供一种治疗癌症的试剂盒，其包上述的益生菌组合物或药物组合物，以及所述的免疫信号通路调节剂，优选pd-1抑制剂，最优选为pd-1抗体。

本公开的一个目的还在于提供上述的益生菌在制备用于治疗癌症的药物或试剂盒中的用途。

在一个优选地实施方案中，所述癌症为消化道肿瘤。

在一个更加优选地实施方案中，所述癌症为结直肠癌。

在一个优选地实施方案中，上述任一种的用途，所述药物或试剂盒用于肿瘤免疫治疗。

在一个优选地实施方案中，上述任一种的用途，所述药物或试剂盒能够提高患者对免疫信号通路调节剂(例如pd-1抑制剂)的治疗应答。

在一个优选地实施方案中，上述任一种的用途，所述药物或试剂盒能够显著延长患者生存期。

在一个优选地实施方案中，上述任一种的用途，所述药物或试剂盒能够显著抑制肿瘤生长。

在一个优选地实施方案中，上述任一种的用途，所述药物或试剂盒能够显著提高肿瘤部位抗肿瘤免疫细胞的富集，优选地，所述抗肿瘤免疫细胞选自cd4+cd62l-cd44+、cd8+ifn-gamma+，cd4+tnf-alpha+、cd11c+cd86+和/或gr-1+cd86+中的一种或多种。

优选地，所述药物或试剂盒相较于未治疗患者，能够显著提高肿瘤部位cd4+cd62l-cd44+、cd8+ifn-gamma+，cd4+tnf-alpha+和/或gr-1+cd86+抗肿瘤免疫细胞的富集。

优选地，所述药物或试剂盒相较于单独使用免疫信号通路调节剂治疗患者，能够显著提高肿瘤部位cd8+ifn-gamma+，cd4+tnf-alpha+，cd11c+cd86+和/或gr-1+cd86+抗肿瘤免疫细胞的富集。

在一个优选地实施方案中，所述药物或试剂盒能够同时提高患者对免疫信号通路调节剂(例如pd-1抑制剂)的治疗应答、延长患者生存期、抑制肿瘤生长、提高患者抗肿瘤免疫细胞的水平，所述抗肿瘤免疫细胞包括cd4+cd62l-cd44+、cd8+ifn-gamma+，cd4+tnf-alpha+、cd11c+cd86+和gr-1+cd86+，以及所述药物或试剂盒相较于单独使用免疫信号通路调节剂治疗的患者能够提高肿瘤部位cd8+ifn-gamma+，cd4+tnf-alpha+，cd11c+cd86+和gr-1+cd86+抗肿瘤免疫细胞的富集。

在一个优选的实施方案中，上述任意的用途，所述益生菌的单次用量为至少1-20x10⁹cfu、或至少2-18x10⁹cfu、或至少3-15x10⁹cfu、或至少4-12x10⁹cfu；优选地，所述益生菌的单次用量为至少5-10x10⁹cfu。

任选地，所述益生菌和所述免疫信号通路调节剂同时使用。

任选地，所述益生菌和所述免疫信号通路调节剂不同时使用，例如在使用所述益生菌的第二天、第三天或第四天等使用所述免疫信号通路调节剂。

任选地，在第一时段使用所述益生菌，在第二时段使用所述免疫信号通路调解剂，所述第一时段与第二时段不重合、部分重合或完全重合。任选地，所述益生菌在第一时段、所述免疫信号通路调解剂在第二时段的给药频次可以相同或不同。

任选地，所述益生菌和所述免疫信号通路调节剂通过相同的给药途径。

任选地，所述益生菌和所述免疫信号通路调节剂通过不同的给药途径。

iii.实施例

实施例1：动物双歧杆菌乳亚种(bifidobacteriumanimalissubsp.lactis)单独或联合pd-1免疫抑制剂，用于治疗消化道肿瘤

1.1材料、仪器和来源

受试药：

动物双歧杆菌乳亚种nexstrain02(保藏编号：cgmccno.20455)

包装：20g/包x1包，1x10¹¹cfu/g

储存温度：4℃

同型对照抗体大鼠igg2a

供货商：中美冠科生物技术有限公司

货号：cvp039

储存温度：4℃

apd-1抗体(rmp1-14)

供货商：中美冠科生物技术有限公司

货号：cvp033

储存温度：4℃

流式分析抗体(表1)

表1、流式分析所用抗体信息

试剂：

生理盐水；供应商：安徽双鹤药业有限公司；批号：171005

rmpi1640；供应商：gibco；批号：8118351

胎牛血清；供应商：excell；批号：11g271

pbs；供应商：hyclone；批号：ae24926283

trypsin；供应商：gibco；批号：2003760

仪器：

电子天平，仪器编号：t01741；厂家：scout；型号：spx222zh

电子天平，仪器编号：tbbal0890；厂家：mettlertoledo；型号：al104

电子天平，仪器编号：tbbal0760；厂家：mettlertoledo；型号：al204

电子天平，仪器编号：tbbal0210；厂家：mettlertoledo；型号：xs204

游标卡尺，仪器编号：t01675；厂家：sylvac；型号：s_calpropat

1.2实验方法

1.2.1抗生素处理

day-8到day7：配方包括氨苄青霉素(ampicillin)1mg/ml，新霉素(neomycin)10mg/ml，甲硝哒唑(metronidazole)10mg/ml，万古霉素(vancomycin)5mg/ml和两性霉素b(amphotericinb)0.1mg/ml。将氨苄青霉素添加到无菌水中供小鼠饮用，其他抗生素混合后给小鼠灌胃，每天两次，每次200μl。

1.2.2细胞培养

ct26细胞(sibs：上海生命科学研究院，cat#：tcm37)培养在含10％胎牛血清的rpmi-1640培养液中。收集指数生长期的ct26细胞，pbs重悬至适合浓度用于小鼠皮下肿瘤接种。

1.2.3供试品和对照品溶液的配制(表2)

表2、供试品和对照品溶液的配制

1.2.4动物造模和实验方案

小鼠结肠癌ct26模型的实验设计和给药方法如表3、图1所示。具体而言，购买spf级6-8周龄雌性balb/c小鼠。

将小鼠分为4组：对照组(无菌生理盐水+同型对照)，nexstrain02单独治疗组(nexstrain02+同型对照)，apd-1单独治疗组(无菌生理盐水+apd-1抗体)和nexstrain02联合治疗组(nexstrain02+apd-1抗体)，每组10只小鼠。

适应性饲养结束后，采用灌胃的方式对小鼠进行抗生素处理，处理时间为16天(从day-8到day7)，每天灌胃1次。

在抗生素处理过程中，选择在day0将培养好的ct26细胞注射到小鼠体内，进行造模，右侧皮下接种5×10⁵ct26细胞。接种当天定义为第0天(day0)。

day7灌胃结束后中断抗生素处理，将小鼠转移到新的笼子中，以防小鼠食用含抗生素的粪便。day8天根据肿瘤体积进行随机分组，各组肿瘤平均体积为87mm³。

day9在第一次微生物治疗前再一次将小鼠转移到新的笼子中。

day8，day11，day14及day17分别给予nexstrain02单独治疗组和nexstrain02联合治疗组小鼠以灌胃的形式进行治疗，每只小鼠每天灌胃1次，灌胃体积为200μl，即剂量为5x10⁹cfu/只/次；对照组和apd-1单独治疗组灌入等体积生理盐水。

day9，day12，day15及day18分别进行抗体注射，用量为200μg/只/次。其中apd-1单独治疗组和联合治疗组注射apd-1抗体，而对照组和nexstrain02单独治疗组注射同型对照。

day24处死小鼠，收集肿瘤，进行称重并测量肿瘤面积后将肿瘤组织磨碎，同时收集脾脏，用于流式细胞分析。

表3、受试物在鼠结肠癌ct26模型中的抗肿瘤作用实验设计

1.2.5实验观察和数据收集

在实验过程中，定期监控肿瘤细胞接种后小鼠体重增长和肿瘤的生长状况：用游标卡尺直接测量肿瘤体积，肿瘤体积计算公式：

肿瘤体积(mm³)＝1/2×(a×b²)(其中a表示长径，b表示短径)。

监测时间点为：第5，8，11，14，17，21及24天；接种肿瘤后小鼠体重的监测。

相对肿瘤增殖率，t/c％，即在某一时间点，治疗组和对照组相对肿瘤体积或瘤重的百分比值。计算公式如下：

t/c％＝trtv/crtv×100％(trtv：治疗组平均rtv；crtv：溶媒对照组平均rtv；rtv＝vt/v0，v0为分组时该动物的瘤体积，vt为治疗后该动物的瘤体积)；或，

t/c％＝ttw/ctw×100％(ttw：治疗组实验终结时平均瘤重；ctw：溶媒对照组实验终结时平均瘤重)。

相对肿瘤抑制率，tgi(％)，计算公式如下：

tgi％＝(1-t/c)×100％(t和c分别为治疗组和对照组在某一特定时间点的相对肿瘤体积(rtv)或瘤重(tw))。

ct26模型所有组小鼠在给药后第13天(细胞接种后第21天即day21)，由各组小鼠肿瘤生长情况(表4、图2)可知：

无菌生理盐水+同型对照对照组小鼠的平均瘤体积为1916.88mm³；

nexstrain02+同型对照组的平均肿瘤体积为1843.34mm³，相较对照组统计学上均无显著性差异，p值为0.896，相对肿瘤抑制率tgi(％)为2％；

无菌生理盐水+apd-1组的平均肿瘤体积为1402.64mm³，相较对照组统计学上均无显著性差异，p值为0.159，相对肿瘤抑制率tgi(％)为26％；

nexstrain02+apd-1组的平均肿瘤体积为1095.68mm3，相较对照组统计学上有显著性差异，p值为0.002，相对肿瘤抑制率tgi(％)为42％。

表4、在鼠结肠癌ct26模型中各组药效分析表

ct26模型所有组小鼠在给药后第15天(细胞接种后第23天即day23)，进行生存分析(表5)，用kaplan-meier方法分析各治疗组的生存曲线(图3)，nexstrain02+apd-1治疗组能够显著促进小鼠的生存期，提高小鼠的存活率，相较对照组提高生存率70％，统计学上均有显著性差异(p值为0.001)。并且nexstrain02+apd-1治疗组相较于无菌生理盐水+apd-1治疗组能进一步促进小鼠的生存期，提高小鼠存活率50％(p值为0.017)(表5、图3)。

表5、在鼠结肠癌ct26模型中的生存分析

^*mst：中位生存期(mediansurvivaltime)

^**ils：生存期延长率(increaseoflifespan)

^***n/a：不适用

实施例2：流式分析(facs)

给药后第16天(细胞接种后第24天)，每组取5个肿瘤做facs。收获的肿瘤样品经消化处理成单细胞悬液后，加入bfa(小牛血清)进行阻断，培养4小时后收获进行染色。流式上机后获得的数据通过kaluza软件进行分析(表6，图4-7)，所有检验均为双尾检验，p值小于0.05时被认为具有统计显著性。

表6、流式细胞术分析结果

注：p值小于0.05用灰色背景标出

由上可知，nexstrain02联合治疗组在以下指标相较于对照组有显著差异：cd4+cd62l-cd44+，cd8+ifn-gamma+，cd4+tnf-alpha+和cr-1+cd86+。并且nexstrain02+apd-治疗组在以下指标相较于无菌生理盐水+apd-1组有显著差异：cd8+ifn-gamma+，cd4+tnf-alpha+，cd11c+cd86+和cr-1+cd86+，说明nexstrain02能够促进t细胞和树突状细胞的富集，可能通过刺激免疫系统来提高pd-1的响应来提高pd-1的响应，抑制肿瘤生长，提高生存率，延长生存期。

实施例3：同时或提前给药的动物双歧杆菌乳亚种(bifidobacteriumanimalissubsp.lactis)单独或联合pd-1免疫抑制剂，用于治疗消化道肿瘤

3.1材料、仪器和来源

实验动物：balb/c小鼠，雌性，7-8周(肿瘤细胞接种时的小鼠周龄)，体重16.5-22.3g，84只。购自上海灵畅生物科技有限公司，动物合格证编号：20180003007017。饲养环境：spf级。

实验动物饲养室的环境条件：实验动物均饲养于恒温恒湿的独立通风盒内，饲养室温度21-25℃，湿度43-70％，10-20次/小时换气，昼夜明暗交替时间12h/12h；持续供给钴60放射灭菌鼠全价颗粒饲料，不限量自由摄取，饮用自来水(高压蒸汽灭菌后使用)，饮水瓶不间断供水，自由摄取。饲养鼠盒是聚砜鼠盒，高压灭菌后使用，规格为325mm×210mm×180mm；垫料是高压灭菌玉米芯，每盒4只动物，笼卡上标明iacuc批准号、实验编号、实验开始时间、课题负责人、实验人员、动物来源、组别和动物号等；实验动物打耳号进行标记。

受试药：

动物双歧杆菌乳亚种nexstrain02(保藏编号：cgmccno.20455)

包装：30g/包x1包+50g/包x1包，1x10¹¹cfu/g

储存温度：4℃

同型对照抗体大鼠igg2a

供货商：中美冠科生物技术有限公司

货号：cvp039

储存温度：4℃

apd-1抗体(rmp1-14)

供货商：中美冠科生物技术有限公司

货号：cvp033

储存温度：4℃

试剂：

生理盐水；供应商：江苏淮安双鹤药业有限公司；批号：1907014c

rmpi1640；供应商：gibco；批号：8119313

胎牛血清；供应商：excell；批号：11h305

pbs；供应商：hyclone；批号：ae24926283

trypsin；供应商：gibco；批号：2120734

仪器：

电子天平，仪器编号：t01741；厂家：scout；型号：spx222zh

电子天平，仪器编号：tbbal0890；厂家：mettlertoledo；型号：xs105du

电子天平，仪器编号：tbbal0760；厂家：mettlertoledo；型号：al204

电子天平，仪器编号：tbbal0210；厂家：mettlertoledo；型号：xs204

游标卡尺，仪器编号：t01675；厂家：sylvac；型号：s_calpropat

3.2实验方法

3.2.1抗生素处理

day-14到day0(第1-4组)：配方包括氨苄青霉素(ampicillin)1mg/ml，新霉素(neomycin)1mg/ml，甲硝哒唑(metronidazole)1mg/ml，万古霉素(vancomycin)0.5mg/ml和两性霉素b(amphotericinb0.1mg/ml)。将氨苄青霉素添加到无菌水中供小鼠饮用，其他抗生素混合后给小鼠灌胃，每天1次，每次200μl。抗生素处理时间为14天，含抗生素的水瓶每三天更换一次。在接收微生物治疗前48h(day0)，中断抗生素处理，并将小鼠转入到新的笼子中，以防止老鼠食用含有抗生素的粪便。day2在第一次微生物治疗前再一次将小鼠转移到新的笼子中，以防止老鼠食用还残留有抗生素的粪便。

day-23到day-9(第5-6组)：配方包括氨苄青霉素(ampicillin1mg/ml)，新霉素(neomycin10mg/ml)，甲硝哒唑(metronidazole10mg/ml)，万古霉素(vancomycin5mg/ml)和两性霉素b(amphotericinb0.1mg/ml)。将氨苄青霉素添加到无菌水中供小鼠饮用，其他抗生素混合后给小鼠灌胃，每天1次，每次200μl。抗生素处理时间为14天，含抗生素的水瓶每三天更换一次。在接收微生物治疗前48h(day-9)，中断抗生素处理，并将小鼠转入到新的笼子中，以防止老鼠食用含有抗生素的粪便。day-7在第一次微生物治疗前再一次将小鼠转移到新的笼子中，以防止老鼠食用还残留有抗生素的粪便。

3.2.2细胞培养

ct26细胞(sibs：上海生命科学研究院，cat#：tcm37)培养在含10％胎牛血清的rpmi-1640培养液中。收集指数生长期的ct26细胞，pbs重悬至适合浓度用于小鼠皮下肿瘤接种。

3.2.3供试品和对照品溶液的配制(表7)

表7、供试品和对照品溶液的配制

3.2.4动物造模和实验方案

小鼠结肠癌ct26模型的实验设计和给药方法如表8所示。具体而言，购买84只spf级6-8周龄雌性balb/c小鼠。适应性饲养一周。实验期间将饲养在不同笼子里的属于同一组别的小鼠进行随机交换。

将小鼠分为6组：对照组(无菌生理盐水+同型对照)，apd-1单独治疗组(无菌生理盐水+apd-1抗体)，益生菌nexstrain02单独治疗组1(nexstrain02+同型对照，同时给药)，益生菌nexstrain02联合治疗组1(益生菌nexstrain02+apd-1抗体，同时给药)，益生菌nexstrain02单独治疗组2(nexstrain02+同型对照，提前给药)和益生菌nexstrain02联合治疗组2(益生菌nexstrain02+apd-1抗体，提前给药)，每组14只小鼠。

适应性饲养结束后，采用灌胃的方式对小鼠进行抗生素处理，处理时间为15天(对照组、apd-1单独治疗组、nexstrain02单独治疗组1、nexstrain02联合治疗组1从day-14到day0，nexstrain02单独治疗组2、nexstrain02联合治疗组2从day-23到day-9)，每天灌胃1次。

在抗生素处理过程中，选择在day0将培养好的ct26细胞注射到小鼠体内，进行造模，右侧皮下接种5×10⁵ct26细胞。接种当天定义为第0天(day0)，根据小鼠体重进行随机分组。

在第一次微生物治疗前再一次将小鼠转移到新的笼子中。

在day2-day22分别给予益生菌nexstrain02单独治疗组1和益生菌nexstrain02联合治疗组1小鼠以灌胃的形式进行治疗，每只小鼠每天灌胃1次，灌胃体积为200μl，即剂量为1x10¹⁰cfu/只/次；在day-7-day13分别给予益生菌nexstrain02单独治疗组2和益生菌nexstrain02联合治疗组2小鼠以灌胃的形式进行治疗，每只小鼠每天灌胃1次，灌胃体积为200μl，即剂量为1x10¹⁰cfu/只/次；对照组和apd-1单独治疗组灌入等体积生理盐水。

在day9，day12，day15及day18分别进行抗体注射，用量为200μg/只/次。其中apd-1单独治疗组和联合治疗组注射apd-1抗体，而对照组和nexstrain02单独治疗组注射同型对照。

当肿瘤体积超过3000mm³时对单只小鼠进行安乐死，整个实验于细胞接种后第58天结束。

最后一次灌胃后72h所有小鼠收集粪便样品(100mg左右，按单只小鼠收集)于1.5ml离心管中，-80℃冻存。结束实验时所有小鼠收集肿瘤(一半福尔马林固定后石蜡包埋，另一半进行rnalater处理)、肠道内容物(平均分装2管，液氮速冻后置于-80℃冰箱保存)以及血浆(分装两管，-80℃冻存)。

表8、受试物在鼠结肠癌ct26模型中的抗肿瘤作用实验设计

3.2.5实验观察和数据收集

在实验过程中定期监控肿瘤细胞接种后小鼠体重增长和肿瘤的生长状况：用游标卡尺直接测量肿瘤体积，肿瘤体积计算公式：

肿瘤体积(mm³)＝1/2×(a×b²)(其中a表示长径，b表示短径)。

监测时间点为：第5，8，11，14，17，21及24天；接种肿瘤后小鼠体重的监测。

相对肿瘤增殖率，t/c％，即在某一时间点，治疗组和对照组相对肿瘤体积或瘤重的百分比值。计算公式如下：

t/c％＝trtv/crtv×100％(trtv：治疗组平均rtv；crtv：溶媒对照组平均rtv；rtv＝vt/v0，v0为分组时该动物的瘤体积，vt为治疗后该动物的瘤体积)；或，

t/c％＝ttw/ctw×100％(ttw：治疗组实验终结时平均瘤重；ctw：溶媒对照组实验终结时平均瘤重)。

相对肿瘤抑制率，tgi(％)，计算公式如下：

tgi％＝(1-t/c)×100％(t和c分别为治疗组和对照组在某一特定时间点的相对肿瘤体积(rtv)或瘤重(tw))。

3.3结论

ct26模型所有组细胞接种后第22天即day22，由各组小鼠肿瘤生长情况(表9、图8)可知：

对照组小鼠的平均瘤体积为1792.73mm³；

nexstrain02单独治疗组1的平均肿瘤体积为1739.35mm³，相较对照组统计学上均无显著性差异，p值为0.878，相对肿瘤抑制率tgi(％)为3％；

nexstrain02单独治疗组2的平均肿瘤体积为1739.35mm³，相较对照组统计学上均无显著性差异，p值为0.878，相对肿瘤抑制率tgi(％)为3％；

apd-1单独治疗组的平均肿瘤体积为1641.84mm³，相较对照组统计学上均无显著性差异，p值为0.642，相对肿瘤抑制率tgi(％)为8％；

nexstrain02联合治疗组1的平均肿瘤体积为1206.61mm³，相较对照组统计学上有显著性差异，p值为0.047，相对肿瘤抑制率tgi(％)为33％。

nexstrain02联合治疗组2的平均肿瘤体积为905.21mm³，相较对照组统计学上有显著性差异，p值为0.002，相对肿瘤抑制率tgi(％)为50％。

表9、在鼠结肠癌ct26模型中各组药效分析表

注：1.数据以“平均值±标准误差”表示；

2.apd-1单独治疗组vs.nexstrain02联合治疗组1，p＝0.155；apd-1单独治疗组vs.nexstrain02联合治疗组2，p＝0.013。

用kaplan-meier方法分析各治疗组的生存曲线，nexstrain02联合治疗组1和nexstrain02联合治疗组2能够显著促进小鼠的生存期，相较对照组统计学上均有显著性差异(p值分别为0.023和0.001)。并且nexstrain02联合治疗组2相较于apd-1单独治疗组能进一步促进小鼠的生存期(p＝0.026)。各治疗组和对照组小鼠生存情况见表10、图9。

表10、在鼠结肠癌ct26模型中的生存分析

注：apd-1单独治疗组vs.nexstrain02联合治疗组1，p＝0.700；pd-1单独治疗组组vs.nexstrain02联合治疗组2，p＝0.026。

实施例4：动物双歧杆菌乳亚种(bifidobacteriumanimalissubsp.lactis)促进thp-1细胞表达il-6

4.1材料、仪器和来源

细胞：

thp-1人急性单核细胞白血病细胞，购自北京北纳创联生物技术研究院，货号100122。

试剂耗材：

rpmimedium1640，供应商：solarbio，货号：201991031

fetalbovineserum，供应商：gibco，货号：2045512cp

1×pbs缓冲液，供应商：solarbio，货号：20200423

75cm²cellcultureflask，供应商：nest，货号：033020ab010402b

96wellcellcultureplate，供应商：nest，货号：091419ba020914a

pma，供应商：sigma-aldrich，货号：mkcl1142

lps，供应商：sigma-aldrich，货号：039m4004v

台盼蓝，供应商：bbi(生工)，货号：f902ba0025

哥伦比亚培养基，供应商：日水生物，货号：20200309

0.22μm滤膜，供应商：millex，货号：r9ea04763

mrs肉汤培养基，供应商：meilunbio，货号：m0226a

humanil-6valukineelisakit，供应商：novus，货号：968607

humanil-6/il-6elisakit，供应商：sinobiological，货号：cw13ap2403

10mlstripette，供应商：corning，货号：9220003

5mlstripette，供应商：corning，货号：03619049

仪器：

厌氧操作台，品牌为：electrotek，型号为：aw400tg

co2培养箱，品牌为：esco，型号为：clm-170b-8-nf

生物安全柜，品牌为：airtech，型号为：bsc-1604ⅱa2

centrifuge5430r，品牌为：eppendorf，型号为：5430r

centrifuge5804，品牌为：eppendorf，型号为：5804

nanodrop，品牌为：thermo，型号为：nanodropone

纯水系统，品牌为：pall，型号为：cascadeⅰ

灭菌锅，品牌为：zealway，型号为：gf88da

倒置显微镜，品牌为：olympus，型号为：ckx53

医用冰箱，品牌为：haier，型号为：hycd-290

恒温水浴锅，品牌为：上海一恒，型号为：hws-24

4.2实验方法

4.2.1thp-1细胞处理

细胞的传代与培养：thp-1为悬浮细胞，使用含10％fbs的rpmi-1640培养细胞(实验过程均未使用抗生素)，5x10⁵cells/ml接种密度，48-72h传代培养。

4.2.2nexstrain02对thp-1表达il-6的影响

4.2.2.1nexstrain02培养上清对thp-1的作用

菌株培养：从菌保管中接种菌株至cb培养基(相关试剂提前出除氧)，厌氧培养18-24h。使用nanodrop测量菌株浓度，传代接种一次，密度调整至1x10⁸cfu/ml，厌氧培养18-24h后，10000rpm，离心10min，取上清，并用0.22μm的无菌滤膜过滤，收集滤液，4℃保存待用。

上清对thp-1的影响实验：提前极化好thp-1细胞，吸去旧培养基，加入新培养基200μl。空白对照组添加4μlpbs；阴性对照组添加4μlcb培养基；阳性对照组添加0.1μg/ml的lps；实验组添加4μl菌株上清滤液。5％co2、95％空气，37℃培养24h。1000g，离心10min收集细胞培养上清，使用elisa检测il-6。

4.2.2.2nexstrain02活菌对thp-1的作用

菌株培养：从菌保管中接种菌株至cb培养基(相关试剂提前出除氧)，厌氧培养18-24h。1：100传代接种一次，厌氧培养18-24h。使用pbs洗涤菌体3次，7000g，5min离心。洗涤完毕，用除氧的1640完全培养基稀释菌株至1x10⁷cfu/ml，待用。

nexstrain02和thp-1共培养：提前极化好thp-1细胞，吸去旧培养基。空白对照组添加2μlpbs+200μl新培养基；阳性对照组添加0.1μg/ml的lps200μl新培养基；实验组添加200μl菌液。在厌氧培养箱中培养24h。1000g，离心10min收集细胞培养上清，检测il-6。

4.3实验结果

4.3.1nexstrain02培养上清对thp-1的作用

实验结果显示：nexstrain02培养上清可以促进thp-1细胞产生il-6，具有明显的促炎作用(图10)，揭示nexstrain02可能通过刺激免疫系统来提高pd-1的响应，抑制肿瘤生长，提高生存率，延长生存期。

4.3.2nexstrain02活菌对thp-1的作用

实验结果显示：1x10⁷cfu/ml的nexstrain02可以促进thp-1细胞产生il-6，具有明显的促炎作用(图11)，揭示nexstrain02可能通过刺激免疫系统来提高pd-1的响应，抑制肿瘤生长，提高生存率，延长生存期。

实施例5：nexstrain02益生菌连续培养方法及遗传稳定性

5.1材料、仪器和来源

试验菌株

乳双歧杆菌nexstrain02(bifidobacteriumlactisnexstrain02)。

仪器与设备

厌氧操作台，生物安全柜，光学显微镜，电子天平，离心机，高压蒸汽灭菌锅，pcr仪，恒温培养箱等。

活化培养基：tpymedium

调整ph7.0，121℃，15min灭菌备用

5.2试验方法

5.2.1菌种活化及保藏

将乳双歧杆菌nexstrain02从-80℃冰箱中取出，放置厌氧台解冻，将甘油管中菌液接入10ml灭菌tpy液体培养基中，37℃厌氧培养24h。

5.2.2平板划线

将活化好的菌液用接种环在tpy固体培养基上进行平板划线(注：固体平板要提前一天放置于厌氧台进行隔夜除氧)，平板倒置后于37℃厌氧培养72h。

5.2.3菌落挑取及液体扩大培养

挑取固体平板上的单菌落进行镜检及革兰氏染色，确认菌株形态，再挑取菌落接种于10ml的tpy液体培养基中37℃厌氧培养24h。

5.2.4液体再次扩培

取2.3培养的菌液进行革兰氏染色镜检观察，确认菌株形态特征，再接种到10ml(2％v/v)tpy液体培养基37℃厌氧培养24h。按照此操作，再进行一次扩培接种，接种到500ml液体培养基中37℃厌氧培养24h。

5.2.5菌体收集

取2.4中培养好的菌液进行革兰氏染色观察，确认菌株形态特征，确认无误后取2ml菌液于离心管中用于dna提取及16s测序。剩余菌液进行离心(4000rpm/min，15min，4℃)，去上清液，收集菌体加入500ml无菌生理盐水进行洗涤后再进行离心(4000rpm/min，15min，4℃)，留取沉淀完成菌体提取。

5.2.6菌种保藏

5.2.6.1保护剂配方：10％脱脂乳粉，0.1％谷氨酸钠，121℃灭菌7min急冷降温备用。

5.2.6.2保护剂密度确认：取灭菌后的一定量的保护剂进行称重，确认保护剂的密度。

5.2.6.3依照湿菌体：保护剂重量(1:2)的比例向菌体中添加冷冻保护剂，混合均匀后分装于冻存管中(每管冻存500ul)，保存于-80℃。

5.3菌株生长曲线测定

取2.3培养的菌液按接种量为1％(v/v)接种于10mltpy液体培养基中(设置3组平行)，37℃厌氧培养24h，每隔2h取样(每组取3次样进行检测)，于600nm处测定其吸光值，确定其稳定期时间。

5.4菌株连续传代培养

5.4.1传代周期

保证菌种稳定，传代应选择在稳定期，根据绘制的生长曲线确定其传代周期(24传代一次)。

5.4.2菌株培养代数计算

以二分裂的方式增殖，即经过n次分裂增殖后细菌数2n个。在每个培养周期内，菌体均按100倍的增殖，即每个周期内的生长代数(也即细菌进行分裂的次数)为log2100≈6.64代。所以传100代需要15天。

5.4.3菌株开始传代培养

将原始保藏菌株活化2代后划线于固体tpy培养基上，37℃培养72h后，挑取菌落进行染色及镜检观察，确认是否具有菌株形态特征。随机挑取单菌落接种于tpy液体培养基中，37℃厌氧培养24h，再按接种量为1％接种到相应tpy液体培养基中。编号nexstrain02-1。

5.4.4全基因组测序及分析

5.4.4.1基因组dna提取及纯度检测

基因组dna提取在最初菌种保藏期间完成一次提取，然后a0、a50及a100代提取dna，采用生工细菌基因组dna快速抽提试剂盒进行提取，提取的dna通过nanodrop进行纯度检测(a260/a280，a260/a230)

5.4.4.2全基因组组装及分析

委托测序公司进行文库构建及测序：首先进行dna样品检测，检测合格后，使用covaris超声波破碎仪随机打断，再经末端修复、加a尾、加测序接头、纯化、pcr扩增等步骤完成整个文库制备工作。文库构建完成后，先使用qubit2.0进行初步定量，稀释文库，随后使用agilent2100对文库的插入片段进行检测，插入片段大小符合预期后，使用q-pcr方法对文库的有效浓度进行准确定量，以保证文库质量。文库检测合格后，使用illumina高通量测序平台novaseq6000进行测序，测序策略为pe150。

使用cutadapt(https://github.com/marcelm/cutadapt)对二代测序数据去除reads中含有的adapter序列；然后使用fastp(https://github.com/opengene/fastp)去除测序质量低的reads；最后使用spades(https://cab.spbu.ru/software/spades/)软件，基于kmer的debruijngraph算法组装得到细菌基因组序列。

将组装出来nextstrain0代序列作为参考序列，与nextstrain50代、nextstrain100代，以及与已公布的82株动物双歧杆菌(bifidobacteriumanimalis)不同亚种(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/genome/browse/#！/prokaryotes/844/)，使用parsnp软件(https://harvest.readthedocs.io/en/latest/content/parsnp.html)，计算它们之间的进化距离。parsnp使用suffixtree的算法来计算两个基因组之间的mum(maximaluniquematch，http://europepmc.org/backend/ptpmcrender.fcgi？accid＝pmc148804&blobtype＝pdf)，然后使用得到的mums，来计算mumi值(http://pdfs.semanticscholar.org/6904/381c6c908a6e18817f076b6f146c205856cf.pdf)，计算方法为：mumi＝1-lmum/lav(lmum是指所有mums的碱基数，lav是指两个基因组碱基数的均值)，mumi值即为两个基因组之间的距离。通过计算nextstrain50代、nextstrain100代和已公布的82株动物双歧杆菌(bifidobacteriumanimalis)亚种与nextstrain10代之间的距离得到nextstrain0代、nextstrain50代和nextstrain100代之间的距离为0，其他82株已发表动物双歧杆菌(bifidobacteriumanimalis)亚种与nextstrain0代的最近距离为0.00003。示例性数据见表11。

表11、进化距离测定示例性结果