一种抗氧化肽组合物及其制备方法和应用与流程

本发明属于化妆品领域，尤其涉及一种抗氧化肽组合物及其制备方法和应用。

背景技术：

氧化与抗氧化作用的平衡是细胞健康的关键，对人体的健康也极为重要。呼吸、营养代谢和排毒等许多生命过程中都伴随着氧化作用，产生自由基和活性氧，发挥如信号传递作用、抵御感染的功能。然而，研究发现机体内过多的自由基使构成细胞组织的各种物质如糖类、dna、蛋白质和脂类等发生氧化反应，引起变性、交联、断裂等损伤了正常细胞，加速细胞老化。

长期暴露在严重大气污染环境中的女性，其额头和脸颊有更多数量的斑和法令纹、皱纹。生活在高污染区的女性，皮肤上大量吸附的粉尘，会使得皮脂过氧化，从而破坏皮肤屏障和保湿功能，让皮肤更敏感，甚至出现炎症。造成皮肤过氧化状态的原因除了污染外，还有紫外线以及内在的生化因素包括疲劳、压力、妊娠或疾病等均会影响机体细胞的氧化和抗氧化平衡。失衡的自由基水平，使得皮肤上出现细纹、色素沉积、皮肤变薄，干燥等老化问题。

鉴于过量自由基对人体的危害，如何清除这些自由基成为一个重要的问题。自由基是指游离的、带有不对称电子的分子、原子或离子。

目前，发现与人体衰老有关的氧自由基主要包括5类：超氧化物自由基、过氧化氢、羟基自由基、单线态氧和过氧化脂质。能够清除上述物质的，被统称为抗氧化剂。在护肤品中，最早添加的抗氧化剂仅用于来保持某些已氧化物料的稳定性。例如，一些添加的植物油成分含有不饱和的双键，存放中会被氧气氧化而酸败变质。这时候常用的抗氧化剂为叔丁基对苯二酚(tbhq)、丁基羟基茴香醚(bha)、二丁基羟基甲苯(bht)。这些化学合成的抗氧化剂，具有潜在的不安全性因素，因此一般都被严格地限量使用。

随着人们对于皮肤也需要抗氧化的逐渐认识，在食品及药品行业被广泛应用的天然抗氧化剂，被引入到护肤品中，用于增强皮肤的抗氧化能力。天然抗氧化剂具有高稳定性、低毒性、较好的生物相容性、多种生物活性和易吸收等优点，逐渐受到人们的重视。在天然抗氧化剂的研究中，抗氧化肽是目前的热门方向之一，它不仅具有清除体内过量自由基的功能，而且兼具营养作用，能提供人体所需的氨基酸，具有极高的安全性。更重要的是，有些抗氧化肽还具有生理调节活性，例如：免疫调节、降血压、降血脂、抗菌等生理活性。在生物医药、化妆品、保健食品等领域具有巨大的开发潜力。

近年来，已有护肤品的配方中的使用了抗氧化肽。例如，cn105878094a公开了一种含茶籽抗氧化肽的化妆品的制备方法，以茶籽粕为原料，提取茶籽蛋白，然后水解生成茶籽抗氧化肽。但该发明并没有指明该抗氧化肽的结构及其组成；cn102085157a公开了一种源于海洋扇贝的抗氧化肽纳米脂质体以及制备方法，指出该脂质体形态均一，粒径200nm以下，包封率高，渗透率低。但是该纳米脂质体制备较为复杂，不适用于推广应用。

由此可见，目前针对抗氧化肽在护肤领域的开发，缺乏对其吸收率的评价。而实际应用中，由于皮肤角质层的天然屏障作用，护肤成分的吸收与其重要有着直接的关系。如果抗氧化肽无法渗透到角质层下，其清除自由基、抗衰效果将难以发挥。因此，提供一种渗透率较高、抗氧化性能较好的抗氧化肽组合物对本领域而言具有重要的应用价值。

技术实现要素：

鉴于现有技术中存在的问题，本发明的目的在于提供一种抗氧化肽组合物及其制备方法和应用。所述抗氧化肽组合物具有生物相容性好、高抗氧化性和高皮肤渗透性等优点，适用于制备对抗皮肤老化和延缓皮肤衰老的化妆品。

为达此目的，本发明采用以下技术方案：

第一方面，本发明提供一种抗氧化肽组合物，所述抗氧化肽组合物中包括：抗氧化肽、可溶性胶原蛋白、神经酰胺和分散剂；所述抗氧化肽的序列结构中包括组氨酸(his，h)和/或半胱氨酸(cys，c)。

本发明中，所述抗氧化肽包含组氨酸和/或半胱氨酸，组氨酸上的咪唑环可以螯合金属离子，从而抑制金属离子参与的催化作用，抑制羟基自由基的形成，半胱氨酸的侧链上含有巯基(-sh)，通过巯基氧化-还原态的转换，作为可逆的供氢体，起到抗氧化作用。此外，选择含组氨酸和/或半胱氨酸的抗氧化肽、可溶性胶原蛋白以及神经酰胺进行三元组合时，三者之间具有协同增效的作用，所得抗氧化肽组合物具有高效的渗透效率，能够显著提高抗氧化肽的清除自由基的效果。

作为本发明优选的技术方案，所述抗氧化肽包括如seqidno.1～15所示的抗氧化肽中的任意一中或至少两种的组合。其中，seqidno.1～15如下表所示：

优选地，所述可溶性胶原蛋白的分子量围为300～5000da，例如可以是350da、400da、500da、1000da、1200da、1500da、2000da、2500da、3000da、3500da、4000da或4500da等，优选为300～2000da。

优选地，所述抗氧化肽组合物中抗氧化肽、可溶性胶原蛋白和神经酰胺的质量分数比为1:(0.2～10):(0.2～10)，优选为1:(0.5～5):(0.2～1)。

作为本发明优选的技术方案，所述可溶性胶原蛋白的原料包括：海洋鱼类的鱼骨、海洋鱼类的鱼鳞、海洋鱼类的鱼皮、海参、猪皮或猪骨中的任意一种或至少两种的组合。

胶原蛋白是结缔组织的主要成分，作为结构蛋白质，它是一种纤维蛋白，能给予皮肤紧实性与耐久性；其中，可溶性胶原蛋白有更强的水分粘着力可到达角质的各个角落，为皮肤带来充足水分。可溶性蛋白胶原中又以海洋鱼类提供的可溶性胶原蛋白为佳，其纯度较高，效果更好。

优选地，所述神经酰胺包括神经酰胺1、神经酰胺2、神经酰胺3、神经酰胺4、神经酰胺5、神经酰胺6i、神经酰胺6ii、神经酰胺7、神经酰胺8或神经酰胺9中的任意一种或至少两种的组合。

作为本发明优选的技术方案，所述抗氧化肽组合物中还包括皮肤调理剂。

优选地，所述皮肤调理剂包括超氧化物歧化酶(sod)、辅酶q10、维生素a、维生素c、维生素e、类黄酮、硫辛酸、白藜芦醇、阿魏酸、类胡萝卜素、原花青素opc、硒、绿茶提取物、石榴提取物或番石榴提取物中的任意一种或至少两种的组合。

优选地，以质量百分比计所述抗氧化肽组合物包括：抗氧化肽1～5％、可溶性胶原蛋白1～10％、神经酰胺1～10％和皮肤调理剂0.1～5％，余量为分散剂。

本发明中，所述抗氧化肽的质量分数可以是1.2％、1.5％、2％、2.5％、3％、3.2％、3.5％、3.8％、4％、4.5％或4.8％等；所述可溶性胶原蛋白的质量分数可以是2％、3％、4％、5％、6％、7％、8％或9％等；所述神经酰胺的质量分数可以是2％、3％、4％、5％、6％、7％、8％或9％等；所述皮肤调理剂的质量分数可以是0.2％、0.5％、1％、2％、2.5％、3％、3.5％或4％等。

优选地，所述抗氧化肽组合物的ph为3.5-7.5，此ph更加适合人体皮肤，例如可以是4、4.5、5、5.5、6、6.5或7等。

作为本发明优选的技术方案，所述分散剂包括水、多元醇或增溶剂中的任意一种或至少两种的组合。

优选地，所述多元醇包括聚乙二醇、丙二醇、甘油、1,3-丁二醇或1,2-戊二醇中的任意一种或至少两种的组合。

优选地，所述增溶剂包括peg-40氢化蓖麻油、peg-30氢化蓖麻油、peg-20氢化蓖麻油、peg-10氢化蓖麻油、peg-5氢化蓖麻油、聚山梨醇酯80、聚山梨醇酯60、聚山梨醇酯40、聚山梨醇酯20、peg-30二聚羟基硬脂酸酯、peg-8辛酸癸酸甘油酯、peg-6辛酸/癸酸甘油酯、聚甘油-10硬脂酸酯、月桂醇聚醚-23、聚氧乙烯蓖麻油-20、聚氧乙烯蓖麻油-30、聚氧乙烯蓖麻油-35、聚氧乙烯蓖麻油-40、聚甘油-10肉豆蔻酸酯、聚甘油-4油酸酯、鲸蜡硬脂醇聚醚-20、鲸蜡硬脂醇聚醚-25、聚氧乙烯蓖麻油-20醚、聚氧乙烯蓖麻油-30醚、聚氧乙烯蓖麻油-35醚、聚氧乙烯蓖麻油-40醚、聚乙二醇400单甘油酯、聚乙二醇400双甘油酯、聚乙二醇600单甘油酯、聚乙二醇600双甘油酯、椰油基葡糖苷、鲸蜡硬脂醇聚醚-20、鲸蜡硬脂醇聚醚-25、二(月桂酰胺谷氨酰胺)赖氨酸钠、角鲨烷、丁醇聚醚-26、蛋黄卵磷脂或大豆卵磷脂中的任意一种或至少两种的组合。

第二方面，本发明还提供一种如第一方面所述的抗氧化组合物的制备方法，所述制备方法包括：

将抗氧化肽与分散剂混合，分散，再加入可溶性胶原蛋白、神经酰胺和任选的皮肤调理剂，调节ph后得到所述抗氧化组合物。

作为本发明优选的技术方案，所述可溶性胶原蛋白、神经酰胺和任选的皮肤调理剂在搅拌条件下加入。

优选地，所述搅拌的速率为1000～2000rpm，例如可以是1100rpm、1200rpm、1300rpm、1500rpm、1600rpm、1700rpm、1800rpm或1900rpm等。

优选地，所述调节ph时使用的ph调节剂包括：三乙醇胺、碳酸钠、乳酸、苹果酸、柠檬酸或醋酸中的任意一种或至少两种的组合，优选为三乙醇胺。

优选地，所述调节ph后还包括过滤除菌的操作。

作为本发明优选的技术方案，所述制备方法包括如下步骤：

(1)将抗氧化肽与分散剂混合，分散，得到抗氧化肽分散液；

(2)在1000～2000rpm的转速下将可溶性胶原蛋白、神经酰胺和皮肤调理剂加入至步骤(1)所得的抗氧化肽分散液中，调节ph至3.5～7.5，得到所述抗氧化组合物。

第三方面，本发明还提供一种抗细胞衰老的组合物，包含如第一方面所述的抗氧化肽组合物。

第四方面，本发明提供如第一方面所述的抗氧化肽组合物或如第三方面所述的抗细胞衰老的组合物在制备化妆品中的应用。

本发明中，所述抗氧化肽组合物能够用于制备延缓细胞衰老、减少皮肤老化的迹象的化妆品。所述抗氧化肽组合物能够应用于任何形式的化妆品，包括直接施用于局部皮肤的化妆水、面霜、乳液、精华、冻干粉、洗面奶或面膜中的任意一种。

本发明所述的数值范围不仅包括上述列举的点值，还包括没有列举出的上述数值范围之间的任意的点值，限于篇幅及出于简明的考虑，本发明不再穷尽列举所述范围包括的具体点值。

与现有技术相比，本发明至少具有以下有益效果：

(1)本发明中提供的抗氧化肽组合物中包含的抗氧化肽、可溶性胶原蛋白、和神经酰胺成分；其中，抗氧化肽分子结构明确，生物活性高，可溶性胶原蛋白具有较好的水分粘着力，增强肌肤保湿力，提升皮肤弹性，神经酰胺可发挥高效保湿、增强皮肤屏障功能、防敏等功效；所述抗氧化肽组合物将三者组合，三者之间协同增效，互相促进，进一步提高了抗氧化肽的抗氧化能力，使得到的抗氧化肽组合物具有高抗氧化性和皮肤渗透性；

(2)本发明所述的抗氧化肽组合物相比于未添加可溶性胶原蛋白和神经酰胺的抗氧化肽而言，其abts自由基清除能力明显提高，清除率提高148.4％～197.8％；通过细胞水平的抗氧化活性测试，其细胞存活率为62％～99％；将其制备成面霜，将所得面霜应用于皮肤外植体和志愿者皮肤上，均体现出较好的抗氧化能力和高渗透性；

(3)本发明所述的抗氧化肽组合物中添加的有效组分均为生物来源，生物相容性好，对皮肤刺激小，安全度高，对于敏感肌人群较为友好；且其制备方法简单，工艺易于控制，适宜工业化规模生产。

附图说明

图1为试验例1中实施例与对比例提供的抗氧化肽组合物的abts自由基清除能力结果图。

图2为试验例5中实验组和对照组的皮肤切片的形态得分柱状图。

图3为试验例5中实验组和对照组的皮肤组织中mt-1h染色强度柱状图。

图4为试验例5中实验组和对照组的细胞培养基中的mda水平柱状图。

图5为试验例5中实验组和对照组的皮肤组织中朗格汉斯细胞数量柱状图。

图6为试验例6中女性志愿者皮肤的mda变化柱状图。

具体实施方式

下面结合附图并通过具体实施方式来进一步说明本发明的技术方案，但下述的实例仅仅是本发明的简易例子，并不代表或限制本发明的权利保护范围，本发明的保护范围以权利要求书为准。

以下实施例中，除特殊说明外，所使用的试剂及耗材均可以从本领域常规试剂厂商购得。

以下实施例中，所述多肽均通过固相合成法制备得到；然而需要知晓的是，所述多肽的制备方法并不局限于固相合成法，其他可以用于制备多肽的方法同样适用。

实施例1

本实施例中提供一种抗氧化肽组合物。具体包括：

其配制方法如下：

(1)在配料罐中加入5gseqidno.3和500g的丁二醇，充分搅拌均匀，得到seqidno.3的丁二醇溶液。

(2)依次将50g可溶性胶原蛋白和50g神经酰胺1，在1000rpm转速下缓慢加入到上述肽溶液中，继续搅拌至混合均匀。

用三乙醇胺将体系ph调节6.0，最后用纯化水定重至1000g；无菌pes滤膜过滤，得到抗氧化肽组合物。

对比例1

与实施例1的区别在于，将其中的可溶性胶原蛋白和神经酰胺替换为等质量的纯化水，其余步骤与实施例1相同。

实施例2

本实施例中提供一种抗氧化肽组合物。具体包括：

其配制方法如下：

(1)在配料罐中加入50gseqidno.10、80g吐温80和500g的纯化水，充分搅拌均匀。

(2)依次将100g可溶性胶原蛋白h008和50g神经酰胺6i1，在2000rpm转速下缓慢加入到上述肽溶液中，继续搅拌至混合均匀；

用三乙醇胺将体系ph调节5.0，最后用纯化水定重至1000g，无菌pes滤膜过滤，得到抗氧化肽组合物。

对比例2

与实施例2的区别在于，将其中的可溶性胶原蛋白和神经酰胺替换为等质量的纯化水，其余步骤与实施例2相同。

实施例3

本实施例中提供一种抗氧化肽组合物。具体包括：

其配制方法如下：

(1)在配料罐中加入5gseqidno.1、5gseqidno.14、5gseqidno.15、20gpeg-40氢化蓖麻油和500g的纯化水，充分搅拌均匀。

(2)依次将100g可溶性胶原蛋白h008和50g神经酰胺6i1，在2000rpm转速下缓慢加入到上述肽溶液中，继续搅拌至混合均匀。

用三乙醇胺将体系ph调节5.0，最后用纯化水定重至1000g。无菌pes滤膜过滤，得到抗氧化肽组合物。

对比例3

与实施例3的区别在于，将其中的可溶性胶原蛋白和神经酰胺替换为等质量的纯化水，其余步骤与实施例3相同。

实施例4

本实施例中提供一种抗氧化肽组合物。具体包括：

配制方法：

(1)在配料罐中加入10gseqidno.2、10gseqidno.4、100g甘油和400g的纯化水，充分搅拌均匀。

(2)依次将10g可溶性胶原蛋白maricols和50g神经酰胺3，在1000rpm转速下缓慢加入到上述肽溶液中，继续搅拌至混合均匀。

用三乙醇胺将体系ph调节6.0，最后用纯化水定重至1000g。无菌pes滤膜过滤，得到抗氧化肽组合物。

对比例4

与实施例4的区别在于，将其中的可溶性胶原蛋白和神经酰胺替换为等质量的纯化水，其余步骤与实施例4相同。

实施例5

含有seqidno.6、可溶性胶原maricols和神经酰胺9的抗氧化肽组合物的制备

本实施例中提供一种抗氧化肽组合物。具体包括：

配制方法：

(1)在配料罐中加入10gseqidno.6、50g1,2-戊二醇，充分搅拌均匀，得到seqidno.6的戊二醇溶液。

(2)依次将100g可溶性胶原蛋白maricols和10g神经酰胺9，在1000rpm转速下缓慢加入到上述肽溶液中，继续搅拌至混合均匀。

用三乙醇胺将体系ph调节5.0，最后用纯化水定重至1000g。无菌pes滤膜过滤，得到抗氧化肽组合物。

对比例5

与实施例5的区别在于，将其中的可溶性胶原蛋白和神经酰胺替换为等质量的纯化水，其余步骤与实施例5相同。

实施例6

本实施例中提供一种抗氧化肽组合物。具体包括：

配制方法：

(1)在配料罐中加入5gseqidno.7、5gseqidno.8、5gseqidno.9、100g吐温和500g的纯化水，充分搅拌均匀。

(2)依次将60g可溶性胶原蛋白h008和40g神经酰胺8，在2000rpm转速下缓慢加入到上述肽溶液中，继续搅拌至混合均匀。

用三乙醇胺将体系ph调节5.0，最后用纯化水定重至1000g。无菌pes滤膜过滤，得到抗氧化肽组合物。

对比例6

与实施例6的区别在于，将其中的可溶性胶原蛋白和神经酰胺替换为等质量的纯化水，其余步骤与实施例6相同。

实施例7

本实施例中提供一种抗氧化肽组合物。具体包括：

配制方法：

(1)在配料罐中加入60gseqidno.11、100g吐温20和500g的纯化水，充分搅拌均匀。

(2)依次将60g可溶性胶原蛋白maricols和60g神经酰胺2，在2000rpm转速下缓慢加入到上述肽溶液中，继续搅拌至混合均匀。

用三乙醇胺将体系ph调节5.0，最后用纯化水定重至1000g。无菌pes滤膜过滤，得到抗氧化肽组合物。

对比例7

与实施例7的区别在于，将其中的可溶性胶原蛋白和神经酰胺替换为等质量的纯化水，其余步骤与实施例7相同。

实施例8

本实施例中提供一种抗氧化肽组合物。具体包括：

配制方法：

(1)在配料罐中加入20gseqidno.12、30g甘油、10g丁二醇和100g的纯化水，充分搅拌均匀。

(2)依次将30g可溶性胶原蛋白maricols和20g神经酰胺8，在1000rpm转速下缓慢加入到上述肽溶液中，继续搅拌至混合均匀。

用三乙醇胺将体系ph调节6.0，最后用纯化水定重至1000g。无菌pes滤膜过滤，得到抗氧化肽组合物。

对比例8

与实施例8的区别在于，将其中的可溶性胶原蛋白和神经酰胺替换为等质量的纯化水，其余步骤与实施例8相同。

实施例9

本实施例中提供一种抗氧化肽组合物。具体包括：

配制方法：

(1)在配料罐中加入5gseqidno.5、10gseqidno.13、100g吐温80和400g的纯化水，充分搅拌均匀。

(2)依次将30g可溶性胶原蛋白maricols和40g神经酰胺8，在2000rpm转速下缓慢加入到上述肽溶液中，继续搅拌至混合均匀。

用三乙醇胺将体系ph调节5.0，最后用纯化水定重至1000g，无菌pes滤膜过滤得到抗氧化肽组合物。

对比例9

与实施例9的区别在于，将其中的可溶性胶原蛋白和神经酰胺替换为等质量的纯化水，其余步骤与实施例9相同。

对比例10

与实施例9的区别在于，其中不包含可溶性胶原蛋白，其缺少的重量由抗氧化肽和神经酰胺补足，即seqidno.5增加3g，seqidno.13增加7g，神经酰胺增加20g；其余步骤与实施例9相同。

对比例11

与实施例9的区别在于，其中不包含神经酰胺，其缺少的重量由抗氧化肽和可溶性胶原蛋白补足，即seqidno.5增加5g，seqidno.13增加10g，可溶性胶原蛋白增加25g；其余步骤与实施例9相同。

试验例1abts自由基清除能力测试

abts自由基清除能力(troloxequivalentantioxidantcapacity，teac)测试是最常见的用于评价化合物的抗氧化活性的一种方法。其主要原理为用过硫酸钾(k2s2o8)与abts直接生成稳定的阳离子自由基abts⁺，抗氧化物质与abts⁺发生反应而使反应体系褪色。具体方法如下：

(1)配制abts⁺储存液：将5mlabts溶液(7.4mmol/l)与5ml过硫酸钾(2.6mmol/l)混合均匀，在25℃下放置12h；

(2)使用前，采用ph为7.4的pbs缓冲液将abts⁺储存液稀释，使得常温下在734nm下的吸光度值为0.70±0.02；

(3)取0.2mlabts⁺工作液与10μl组合物样品(以实施例1～9中的抗氧化肽组合物为实验组，以对比例1～9中的组合物为对照组)混合，在96微孔板中，30℃下反应30min，每6min测定一次吸光值。abts自由基清除能力由下式计算：

清除率(％)＝(a0-ai/a0)×100％

其中，a0为空白组的吸光度值，ai为抗氧化肽组合物组的吸光度值。

各实施例中的实验组与对照组的abts自由基清除能力结果如图1所示。

以实验组和对照组的abts清除率的比例，评价其抗氧化活性提高率。结果如下表1所列：

表1

结合图1和表1所示的结果，本发明公开的抗氧化组合物能够明显提高抗氧化肽的生物活性。其中，由实施例2与对比例2可知，在组合物中添加适量的神经酰胺和可溶性胶原蛋白，能够将abts清除率提升197.8％，上述实验组能够将abts清除率提升118.6％～197.8％；且由实施例9与对比例10～11比较可知，神经酰胺、可溶性胶原蛋白和抗氧化肽之间存在协同作用，缺少神经酰胺或可溶性胶原蛋白时，即使总使用量相同，其抗氧化效果也无法达到相同的效果。

试验例2溶血率测试

建立aaph氧化损伤人红细胞的模型：将新鲜健康成人血液采集于肝素钠真空采血管中，4℃，3000r/m下离心10min；

取上清，使用ph为7.4pbs溶液清洗后，用pbs稀释至10％的悬浮液；

取100μl上述溶液于96孔细胞培养板中，加入50μl的抗氧化肽样品溶液(1mm)、50μl的抗氧化肽样品溶液(1mm)或pbs作为空白组，在37℃下培养30min，再加入100μl的aaph溶液(200mm)，继续培养3h(有氧损伤)。取200μl血红细胞反应液，加入1mlpbs稀释，在4℃，3000r/m下离心10min；

取200μl上清液于96孔透明微孔板中，采用多功能读数扫描仪测定540nm下吸光值，记为ai。上述过程中的1mlpbs替换为4℃预冷的超纯水，使细胞全部裂解，测得吸光度值记为a0。

溶血率(％)＝100％×ai/a0。

所得结果如表2所示：

表2

通过溶血率的测定，结果显示抗氧化组合物具有更优的抵御损伤的功效。其中，实施例2、实施例4和实施例7与相应的对比例比较，溶血率分别提升了147.1％、153.3％和148％.2％。

试验例3细胞水平的抗氧化活性测试

利用人肝癌细胞hepg-2、人胚肾细胞hek293，开展新型抗氧化肽组合物的细胞毒性及抗h2o2氧化损伤能力检测分析；

采用浓度为0.1mg/ml、0.2mg/ml、0.4mg/ml、0.6mg/ml、0.8mg/ml、1.0mg/ml的抗氧化肽组合物进行细胞培养实验，加h2o2浓度至1.0mm，以浓度为0.1mg/ml还原型谷胱甘肽(gsh)为阳性对照品，检测抗氧化肽组合物抗h2o2氧化损伤能力，以标准的mtt法测定细胞存活率，检测结果如下表3所示；

表3

结果显示，与相应的对照组相比，各实施例中的组合物显示出更高的细胞存活率，表明组合物的抵御氧化应激反应的能力更强。

试验例4安全性评价试验

参照出入境检验检疫行业标准发布的化妆品眼刺激性/腐蚀性的鸡胚绒毛尿囊膜试验标准，选取将9日龄鸡胚评价各实施例的组合物的安全性。

采用反应时间法，以质量分数为0.9％的nacl溶液为阴性对照，质量分数为0.3％的naoh溶液为阳性对照，分数为1％的脂肪醇醚硫酸钠盐混合物(asv)为基准物质对照。结果如下表4所示：

表4

根据标准is＝(301-sech)×5/300+(301-secl)×7/300+(301-secc)×9/300；其中，is<1无刺激；1<is<5轻度刺激；5<is<9中度刺激；is>9重度刺激。上述结果表明本发明的组合物具有良好的安全性。

应用例

本应用例提供一种抗氧化乳霜配方，其具体组分如下：

表5

按照上述配方制备抗氧化日霜，具体制备方法如下：

将a相和b相中的各组分混合，分别加热至70℃溶解后，搅拌混合均匀；

将a相和b相混合，均质搅拌5分钟，降温至50℃后，加入c相，搅拌混合均匀；降温至25℃后，加入d相和e相，继续搅拌均匀后即可出料。

其中，添加不同d相成分，对应得到实验组和对照组两组乳霜，用于后续的评价。

试验例5皮肤外植体中抗氧化活性检测

模型方法：分别用实施例1～3中的抗氧化肽组合物和对比例1～3提供的组合物处理人皮肤外植体，每天一次，连续一周；最后一次处理后4小时，将皮肤外植体暴露于污染混合物中，测定皮肤形态、金属硫蛋白的表达、脂质过氧化和朗格汉斯细胞细胞数量。具体步骤如下：

(1)起始时，对皮肤进行切片，然后应用masson′strichrome法对皮肤切片进行染色，记录皮肤的初始状态；

(2)通过免疫染色法，根据免疫染色强度评价皮肤组织中的金属硫蛋白1h(mt-1h)表达量；

(3)通过tbars法，测定细胞培养基中的丙二醛(mda)的浓度水平；

(4)测定皮肤组织中糖蛋白cd1a的数量，用于评价朗格汉斯细胞数量；

按照上述模型方法对皮肤外植体进行一周的涂抹处理及污染处理后，记录相应的皮肤参数情况。

结果列于图2、图3、图4和图5中；其中，图2中显示了实施例1～3中的抗氧化肽组合物和对比例1～3提供的组合物处理人皮肤外植体后，表皮层和真皮层的皮肤形态总得分，由图可知，所述实验组的得分均高于对照组；图3为mt-1h表达量比较结果，由图可知，在被污染后，对照组的mt-1h明显上升而实验组中的染色强度相比于起始时只有略微增长；同样的，图4中mda的浓度水平也与mt-1h表达量结果相近；图5为起始和被污染后各组中朗格汉斯细胞数量检测结果，其中，对比例中朗格汉斯细胞数量明显下降。

试验例6保护皮肤抵御氧化压力及皮肤的渗透能力检测

招募20名女性志愿者(35～63岁)，一半脸使用实施例1的抗氧化肽组合物制备得到的面霜，另一半脸使用同样剂量的对照组乳霜，每天早晚涂抹两次，分别与使用2周和4周时，用胶带撕取左右脸皮肤样品，评估皮肤的脂质过氧化情况，比较实验组与对照组的提升皮肤抵御氧化压力及渗透性的功效。

所得结果如图6所示，实验组的mda浓度明显降低，在2周时减少量可达8％，4周时减少量超过20％，相比于对照组，其皮肤抵御氧化压力的能力较好，且具有高渗透性。

综上所述，本发明中提供的抗氧化肽组合物具有高抗氧化性和皮肤渗透性，且生物相容性较好，对皮肤刺激小，安全度高；所述抗氧化肽组合物份abts自由基清除能力明显提高，通过细胞水平的抗氧化活性测试，其细胞存活率较好；同时将其制备成面霜，将所得面霜应用于皮肤外植体和志愿者皮肤上，均体现出高抗氧化能力和高渗透性。

申请人声明，以上所述仅为本发明的具体实施方式，但本发明的保护范围并不局限于此，所属技术领域的技术人员应该明了，任何属于本技术领域的技术人员在本发明揭露的技术范围内，可轻易想到的变化或替换，均落在本发明的保护范围和公开范围之内。

sequencelisting

<110>中科院过程工程研究所南京绿色制造产业创新研究院

<120>一种抗氧化肽组合物及其制备方法和应用

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