靶向氧化石墨烯复合物用于治疗耐药骨肉瘤的实验方法与流程

文档序号:24337923发布日期:2021-03-19 12:19阅读:来源:国知局

技术特征:

1.靶向氧化石墨烯复合物用于治疗耐药骨肉瘤的实验方法,线粒体靶向氧化石墨烯纳米复合物用于荧光成像引导下的协同光疗治疗耐药骨肉瘤,其特征在于,包括如下步骤:(1)、实验细胞、动物及肿瘤异种移植,将mg63/dox细胞植于小鼠背部皮下,然后用荷瘤小鼠进行活体成像和光疗,(2)、ppg、tpp-ppg和tpp-ppg@icg制备,(3)、表征,对tpp-ppg、icg和tpp-ppg@icg的光学特性采用紫外可见近红外分光光度计进行表征,(4)、单线态氧检测,用单线态氧绿色荧光探针检测单线态氧的生成,(5)、光热转换实验,用近红外光进行照射,使用红外线温度计记录温度变化,(6)、细胞摄取和细胞内定位,将mg63/dox细胞培养孵育后,用pbs洗涤后在培养基中重悬,流式细胞仪检测样品的平均荧光强度,将mg63/dox细胞与tpp-ppg@icg共同培养,pbs洗涤细胞后加入线粒体荧光探针孵育,对线粒体进行标记,pbs再次洗涤细胞后用激光扫描共聚焦显微镜扫描获取图像,(7)、体外实验,将mg63/dox细胞悬液培养加入不同浓度的icg、tpp-ppg和ppg@icg溶液,对非照射组pbs洗涤后再次培养,照射组使用808nmnir照射后再次培养,检测细胞活力同时进行活细胞/死细胞双染,将mg63/dox细胞加入pbs、tpp-ppg@icg、icg、tpp-ppg、ppg@icg及tpp-ppg@icg培养,加入双染试剂盒孵育,使用近红外荧光光谱进行观察,(8)、细胞凋亡和胞内ros检测,mg63/dox细胞培养nir照射后低速离心收集细胞,在缓冲液中重新悬浮避光染色后,低速离心收集细胞,pbs洗涤并用结合缓冲液稀释后进行流式细胞分析,用dcfh-da试剂盒检测细胞内ros的产生,(9)、线粒体膜电位检测,用jc-1记录线粒体膜电位的变化,用激光共聚焦显微镜采集图像,(10)线粒体超氧化物检测,使用线粒体超氧化物荧光探针检测线粒体超氧化物的产生,(11)、atp检测,使用atp检测试剂盒绘制atp浓度标准曲线,(12)、近红外荧光及热学成像,对mg63/dox荷瘤裸鼠尾静脉注射tpp-ppg@icg,采用近红外成像系统进行体外近红外成像,使用nri进行照射时使用红外热成像相机对小鼠肿瘤组织温度变化进行实时成像,(13)、体内pdt/ptt联合治疗,将荷瘤小鼠随机分为6组,pbs非照射组(对照组)、tpp-ppg@icg非照射组、icg照射组、tpp-ppg照射组、ppg@icg照射组和tpp-ppg@icg照射组,静脉注射icg,照射组在肿瘤部位使用808nmnir进行照射,持续15天,收集肿瘤和主要器官,获取的内脏进行苏木精-伊红染色,并进行显微镜观察。

2.根据权利要求1所述的靶向氧化石墨烯复合物用于治疗耐药骨肉瘤的实验方法,其特征在于,所述步骤(1)中mg63/dox细胞混于100μl基质凝胶中进行移植,肿瘤体积达到60mm3时,进行活体成像和光疗。

3.根据权利要求1所述的靶向氧化石墨烯复合物用于治疗耐药骨肉瘤的实验方法,其特征在于,所述步骤(5)中近红外光采用808nm近红外光。

4.根据权利要求3所述的靶向氧化石墨烯复合物用于治疗耐药骨肉瘤的实验方法,其特征在于,所述步骤(8)中mg63/dox细胞接种在6孔板中过夜,然后加入等效剂量的pbs(-)、tpp-ppg@icg(-)、icg(+)、tpp-ppg(+)、ppg@icg(+)及tpp-ppg@icg(+)共培养24h。

5.根据权利要求3所述的靶向氧化石墨烯复合物用于治疗耐药骨肉瘤的实验方法,其特征在于,所述步骤(8)中dcfh-da试剂盒检测细胞内ros的产生,要先将mg63/dox细胞接种在24孔板中过夜,加入等效剂量的pbs(-)、tpp-ppg@icg(-)、icg(+)、tpp-ppg(+)、ppg@icg(+)及tpp-ppg@icg(+)共培养24h。

6.根据权利要求5所述的靶向氧化石墨烯复合物用于治疗耐药骨肉瘤的实验方法,其特征在于,所述步骤(9)中要先将mg63/dox细胞与等效剂量的pbs(-)、tpp-ppg@icg(-)、icg(+)、tpp-ppg(+)、ppg@icg(+)及tpp-ppg@icg(+)共培养24h,nir照射后再孵育24h,未照射组在相同条件下孵育48h,然后用pbs洗涤细胞,并在37℃下加入5mm的jc-1共培养30分钟,再用pbs洗涤细胞并使用clsm进行观察。

7.根据权利要求1所述的靶向氧化石墨烯复合物用于治疗耐药骨肉瘤的实验方法,其特征在于,所述步骤(10)中要先将mg63/dox细胞接种在35毫米玻璃培养皿中过夜,然后加入等效剂量的pbs(-)、tpp-ppg@icg(-)、icg(+)、tpp-ppg(+)、ppg@icg(+)及tpp-ppg@icg(+)共培养24h,处理后用pbs洗涤细胞两次,加入5μm线粒体超氧化物荧光探针孵育10分钟,再用pbs洗涤两次并用clsm观察采集图片。

8.根据权利要求7所述的靶向氧化石墨烯复合物用于治疗耐药骨肉瘤的实验方法,其特征在于,所述步骤(11)中要先将mg63/dox细胞接种在96孔板中,加入100μldmem培养24小时,然后加入等效剂量的pbs(-)、tpp-ppg@icg(-)、icg(+)、tpp-ppg(+)、ppg@icg(+)及tpp-ppg@icg(+)共培养24h,去除培养基并加入细胞裂解液,然后加入atp检测试剂盒,检测荧光值,计算atp浓度,每个实验重复三次,计算平均值。

9.根据权利要求7所述的靶向氧化石墨烯复合物用于治疗耐药骨肉瘤的实验方法,其特征在于,所述步骤(13)中需要每3天监测一次肿瘤体积和小鼠体重的变化,持续15天,以评估治疗效果。


技术总结
本发明公开了靶向氧化石墨烯复合物用于治疗耐药骨肉瘤的实验方法,包括基础集成板、输入机构和输出机构,基础集成板上固定连接有把手,输入机构和输出机构通过支架安装在基础集成板上,输入机构和输出机构之间安装有张紧轮,同步带和张紧轮之间通过齿形带同步转动,本发明通过同步锁紧或旋松子阵锁紧螺钉,保证子阵在安装过程中不会因过于倾斜而卡住,不产生附加力,可以实现将雷达子阵在导轨间隙小、插拔力大的情况下安全有效安装到位,亦适用于维修更换时拆出,提升了雷达子阵的安装成功率和效率,亦可提升雷达子阵维修效率,该靶向氧化石墨烯复合物用于治疗耐药骨肉瘤的实验方法同时具备易操作,效率高,重量轻,便于携带,耐用,可靠性高的特点。

技术研发人员:余秋萍;周宗科;曾伟南;王端;于浩达
受保护的技术使用者:四川大学华西医院
技术研发日:2020.12.23
技术公布日:2021.03.19
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