用于治疗中枢神经系统损伤的包含氨基酸的组合物的制作方法

1.本说明书一般地涉及包含氨基酸的组合物。更具体地，本说明书涉及用于在对象中治疗中枢神经系统损伤的包含氨基酸的组合物。


背景技术：

2.中枢神经系统(central nervous system，cns)包括协调较高级别功能的脑和主要用作脑与外周之间通信途径的脊髓。中枢神经系统损伤导致的失能取决于损伤的模式、严重程度和解剖学位置。无论对cns的损伤的最初位置如何，损伤都是一个持续的过程，其中主要损伤导致一系列可影响胞体和轴突功能的有害事件，导致持续的功能障碍和长期的退化。
3.当外部身体损伤造成损害时，会发生颅脑损伤(traumatic brain injury，tbi)和创伤性脊髓损伤(traumatic spinal cord injury，sci)，并且其范围可从轻度到重度。脊髓损伤是导致具有破坏性神经学结局和有限治疗机会的失能的原因。脊髓损伤(sci)有两种主要类型，脊髓横断和脊髓挫伤。sci导致低于损伤水平的运动或感觉功能的部分或完全丧失，这在身体水平和心理水平二者上均对患者造成毁灭性的后果。显示出所述疾病的病理学基础是神经组织的损失，这使神经元脉冲从中枢神经系统到肌肉的连接断开。全世界每年约250,000至500,000人遭受脊髓损伤(相当于每小时30至60人)。这些患者在其一生中都需要广泛的医疗援助，估计每位患者的终生费用为1至4百万欧元。尽管sci意味着重要的社会和经济负担，但很少有新的治疗选择可用。在过去的30年里，医疗援助的进步提高了sci患者的存活率。然而，基础研究和转化研究在显著改善神经学结局上并未成功。


技术实现要素：

4.本说明书提供了对在对象中治疗中枢神经系统损伤特别有效的基于氨基酸的组合物。
5.根据本说明书，上述目的由于在所附权利要求书中特别提及的主题而实现，所附权利要求书被理解为构成本公开内容的必要部分。
6.本说明书的一个实施方案提供了用于在对象中治疗中枢神经系统损伤的组合物，该组合物包含活性剂，所述活性剂包含氨基酸亮氨酸、异亮氨酸、缬氨酸、苏氨酸、赖氨酸，和羧酸柠檬酸、琥珀酸、苹果酸。
7.在一个或更多个实施方案中，组合物的活性剂还包含选自组氨酸、苯丙氨酸、甲硫氨酸、色氨酸、半胱氨酸和酪氨酸的一种或更多种氨基酸。
8.在一个优选的实施方案中，中枢神经系统损伤选自脑损伤、脊髓损伤、周围神经损伤、脱髓鞘病。在一个或更多个实施方案中，脊髓损伤包括挫伤性脊髓损伤。
9.本公开内容的另一个实施方案提供了在对象中治疗中枢神经系统损伤的方法，该方法包括选择包含活性剂的组合物，所述活性剂包含氨基酸亮氨酸、异亮氨酸、缬氨酸、苏氨酸、赖氨酸，和羧酸柠檬酸、琥珀酸和苹果酸，并施用该组合物以治疗中枢神经系统损伤。
附图说明
10.现将参照附图仅以实例的方式来描述本发明，在附图中：
11.‑
图1示出了补充有根据本公开内容的一些实施方案的组合物的体外分化nsc中线粒体区域的量化。数据表示为均值
±
sem。*＝p<0.05；**＝p<0.01；
12.‑
图2示出了补充有根据本公开内容的一些实施方案的组合物的体外分化nsc中氧化代谢的量化。seahorse胞外通量分析仪允许通过顺序注射不同的线粒体电子传递链抑制剂来测量不同的生物能学参数。鱼藤酮和抗霉素a注射允许计算非线粒体ocr和基线线粒体呼吸。寡霉素注射允许测量与atp合成偶联的呼吸，并且最大呼吸是由解偶联剂fccp诱导的。数据表示为均值
±
sem。**＝p<0.01；***＝p<0.001；****＝p<0.0001；
13.‑
图3示出了补充有根据本公开内容的一些实施方案的组合物的体外分化nsc的神经元成熟模式。a和b中的图示出了在对照、α5 0.1％、α50.5％和α5 1％条件下在10div下的map2
+
神经元的定量分析。数据表示为均值
±
sem。*＝p<0.05；**＝p<0.01；***＝p<0.001；****＝p<0.0001；
14.‑
图4示出了补充有根据本公开内容的一些实施方案的组合物的体外分化nsc中的树突棘成熟和兴奋性突触标志物表达。数据表示为均值
±
sem。*＝p<0.05；**＝p<0.01；***＝p<0.001；****＝p<0.0001；
15.‑
图5示出了在三个不同实验组(bcaa1
‑
sci、bcaa2
‑
sci、bcaa3
‑
sci)中手术时动物的重量。数据示出为均值
±
sem。sci＝脊髓损伤；
16.‑
图6示出了在重度sci之后对照动物和处理动物的运动功能恢复分析的结果。该图表示在重度sci之后组合物处理(带三角形的线)和对照(带正方形的线)的bms评分。箭头表示组合物施用的起始日(3dpi)。受伤的小鼠接受无菌水中的补充(3个实验中n＝22)或仅无菌水(对照小鼠；3个实验中n＝25)。数据显示为均值
±
sem。*p≤0.05，**p≤0.01，***p≤0.001，****p≤0.0001。bms＝basso小鼠评分；dpi＝受伤之后天数；
17.‑
图7示出了表示在重度sci之后对照小鼠(带正方形的线)和经处理小鼠(带三角形的线)中的踝运动评分的图。数据显示为均值
±
sem。**p≤0.01，*p<0.05。bms＝basso小鼠评分；dpi＝受伤之后天数；
18.‑
图8示出了表示在重度sci之后对照小鼠(带正方形的线)和经处理小鼠(带三角形的线)的每日利尿的图。数据显示为均值
±
sem；dpi＝受伤之后天数；
19.‑
图9表示横断脊髓免疫染色切片，其示出了在重度sci之后对照小鼠和经处理小鼠中的胶质瘢痕反应和囊肿区域。对照小鼠(a)和经处理小鼠(b)的用特异性星形标志物gfap和to
‑
pro3
tm
进行免疫染色的横断脊髓切片说明了量化考虑的区域。对照小鼠(c)和经处理小鼠(d)的用特异性星形标志物gfap和to
‑
pro3
tm
进行免疫染色的横断脊髓切片。灰色虚线区域表示胶质瘢痕区域。白色虚线区域表示囊肿区域。白色虚线区域和灰色虚线区域(用白线描画)表示总病变区域。(e)表示在对照小鼠和经处理小鼠中囊肿面积占总病变面积的百分比比率的图。(f)表示在对照小鼠和经处理小鼠中胶质瘢痕面积占总病变面积百分比比率的图。定量数据表示为均值
±
sem；*p≤0.05；**p≤0.01。对每组分析n＝3只动物和8个切片/动物。gfap＝胶质细胞原纤维酸性蛋白；
20.‑
图10示出了表示在重度sci之后对照小鼠和经处理小鼠中胶质瘢痕面积占总切片面积的百分比比率的图。定量数据表示为均值
±
sem；*p≤0.05。对每组分析n＝3只动物
和8个切片/动物；
21.‑
图11示出了表示在经处理和对照动物的脊髓中在病变周围区域(perilesioned area)中neun阳性细胞的数目的图。数据显示为均值
±
sem；对每组分析n＝3只动物和8个切片/动物。**p<0.01；
22.‑
图12示出了表示在经处理和对照小鼠中神经丝
‑
200所覆盖的面积占所选目标区域(region of interest，roi)的百分比比率的图。定量数据表示为均值
±
sem；sci＝脊髓损伤；对每组分析n＝3只动物和8个切片/动物；
23.‑
图13：在图a和b中分别是经处理和对照小鼠的用勒克司坚牢蓝(luxol fast blue，lfb)染色的脊髓横断切片。lfb允许从脱髓鞘区域(白色区域)中鉴定脊髓实质中的髓鞘含量。c)该图表示经处理小鼠和对照小鼠脊髓切片的背侧柱中髓鞘含量的百分比，其计算为背侧柱总面积的像素中的背侧柱中髓鞘阳性像素。数据显示为均值
±
sem；对每组分析n＝3只动物和8个切片/动物。ns＝不显著。sci＝脊髓损伤。
具体实施方式
24.在以下描述中，给出了许多具体细节以提供对一些实施方案的透彻理解。这些实施方案可在没有一个或更多个具体细节的情况下，或者用其他方法、组分、材料等来实施。在其他情况下，未详细示出或描述公知的结构、材料或操作以避免使一些实施方案的一些方面模糊。
25.在本说明书通篇提及“一个实施方案”意指与该实施方案相关描述的特定的特征、结构或特性包括在至少一个实施方案中。因此，在本说明书通篇多处出现的短语“在一个实施方案中”不一定全部是指同一个实施方案。此外，在一个或更多个实施方案中，可以以任何合适的方式对特定的特征、结构或特性进行组合。本文中提供的标题仅是为了方便，而不解释实施方案的范围或含义。
26.本技术的发明人出乎意料地发现，通过向包含亮氨酸、异亮氨酸、缬氨酸、苏氨酸和赖氨酸的组合的组合物添加特定量的特定羧酸，出现了在有利于和提高分化神经元细胞中的氧化代谢方面的高有效性。
27.分化的成熟神经元的特征是从糖酵解转变为更多的氧化代谢(zheng等,2016)。为了研究补充本文中公开的组合物是否可增强这种代谢转换(促氧化代谢)并促进神经元分化，分析了组合物补充对分化脑室下区(sub
‑
ventricular zone，svz)来源nsc的影响。另外，为了进一步研究本文中公开的组合物是否影响来自其他来源的nsc的神经元细胞分化和成熟，对脑膜中存在的神经源性放射状胶质细胞样细胞进行了详细分析(bifari等,2017c)。
28.脑膜nsc和svz来源的nsc按先前所述(bifari等,2017)分离，并分别针对标志物pdgfrβ和cd133/prominin
‑
1的表达进行分选。
29.培养之后，脑膜nsc和svz来源的nsc被扩增为神经球，并通过改变培养基条件分化为神经元(bifari等,2009)。培养基补充有提高浓度的根据本技术的一些实施方案的组合物，从0.1％开始至0.5％和1％。
30.根据本技术的一些实施方案的组合物已显示出在体外增强神经元成熟，如“结果章节”中所公开的。
31.另外，在体外获得非常有前景和出乎意料的结果之后，发明人还测试了组合物施用对完全(重度)挫伤性脊髓损伤(sci)的临床前动物模型的影响。
32.sci导致低于损伤水平的运动或感觉功能的部分或完全丧失，这在身体水平和心理水平二者上均对患者造成毁灭性的后果。
33.本文中公开的组合物——包含氨基酸亮氨酸、异亮氨酸、缬氨酸、苏氨酸、赖氨酸与特定量的作为三羧酸循环底物的包括柠檬酸、琥珀酸和苹果酸在内的三种羧酸的组合作为活性剂——已经显示出在完全挫伤性sci(即没有自发性恢复且主要反映在人中观察到的病症的损伤)之后在抵消神经组织损失和有利于神经元再生方面非常有效。本文中公开的组合物比不含这样的特定羧酸的类似氨基酸组合物显著更有效。
34.在一个或更多个实施方案中，在本文中公开的组合物中，柠檬酸、琥珀酸和苹果酸的总量与氨基酸亮氨酸、异亮氨酸、缬氨酸、苏氨酸、赖氨酸的总量之间的重量比为0.05至0.3，优选0.1至0.25。
35.在一个或更多个实施方案中，活性剂可还包含选自组氨酸、苯丙氨酸、甲硫氨酸、色氨酸、半胱氨酸和酪氨酸的一种或更多种氨基酸。
36.在一个或更多个实施方案中，组合物中包含的羧酸可由柠檬酸、琥珀酸和苹果酸组成。
37.在另一个实施方案中，本文中公开的组合物的活性剂可还包括天冬氨酸和/或鸟氨酸l
‑
α
‑
酮戊二酸(okg)。
38.根据一个实施方案，组合物包含活性剂，所述活性剂由以下组成：亮氨酸、异亮氨酸、缬氨酸、苏氨酸、赖氨酸、组氨酸、苯丙氨酸、甲硫氨酸、色氨酸、半胱氨酸，和任选地酪氨酸，以及柠檬酸、琥珀酸、和苹果酸，所述氨基酸是组合物中包含的仅有氨基酸。柠檬酸、琥珀酸和苹果酸可以是组合物中包含的仅有羧酸。
39.在另一个实施方案中，组合物可包含相对于活性剂重量的按重量计35％至65％，优选按重量计42％至56％的量的氨基酸异亮氨酸、亮氨酸和缬氨酸。
40.在一个或更多个实施方案中，亮氨酸与柠檬酸之间的重量比为5至1，优选2.50至3.50。
41.在另一个实施方案中，柠檬酸的重量或摩尔量高于苹果酸和琥珀酸各自的重量或摩尔量。优选地，柠檬酸的重量或摩尔量高于苹果酸加琥珀酸的总重量或总摩尔量。在另一个实施方案中，柠檬酸与苹果酸和琥珀酸的总和之间的重量比为1.0至4.0，优选1.5至2.5。在一个优选实施方案中，柠檬酸:苹果酸:琥珀酸重量比为10:1:1至2:1.5:1.5，优选7:1:1至1.5:1:1，更优选5:1:1至3:1:1。在一个优选实施方案中，柠檬酸:苹果酸:琥珀酸重量比为4:1:1。
42.根据本公开内容的一些实施方案，优选的异亮氨酸:亮氨酸摩尔比为0.2至0.7，优选0.30至0.60，和/或优选的缬氨酸:亮氨酸重量比为0.2至0.70，优选0.30至0.65。
43.在另一个实施方案中，苏氨酸:亮氨酸摩尔比为0.10至0.90，优选0.20至0.70，和/或赖氨酸:亮氨酸重量比为0.20至1.00，优选0.40至0.90。
44.在一个优选实施方案中，柠檬酸、苹果酸、琥珀酸的总摩尔量与甲硫氨酸、苯丙氨酸、组氨酸和色氨酸的总摩尔量之间的比率高于1.35。
45.在一个或更多个实施方案中，柠檬酸、苹果酸、琥珀酸的总和与支链氨基酸亮氨
酸、异亮氨酸、缬氨酸的总和之间的重量比为0.1至0.4，优选0.15至0.35。
46.在另一个实施方案中，支链氨基酸亮氨酸、异亮氨酸、缬氨酸加苏氨酸和赖氨酸的总重量高于三种羧酸例如柠檬酸、苹果酸和琥珀酸的总重量。优选地，单一羧酸(柠檬酸、琥珀酸或苹果酸)的重量小于单一氨基酸亮氨酸、异亮氨酸、缬氨酸、苏氨酸和赖氨酸各自的重量。
47.在另一个实施方案中，赖氨酸和苏氨酸的总摩尔量高于三种羧酸柠檬酸、琥珀酸、苹果酸的总摩尔量。优选地，三种羧酸柠檬酸、琥珀酸、苹果酸的总摩尔量与赖氨酸和苏氨酸的总摩尔量之间的比率为0.1至0.7，优选0.15至0.55。
48.在一个或更多个实施方案中，本文中公开的组合物还包含维生素，其优地选自维生素b，例如维生素b1和/或维生素b6。在本公开内容的另一个实施方案中，组合物可包含碳水化合物、添加剂和/或矫味物质。
49.在一个或更多个实施方案中，本文中公开的组合物旨在用于治疗中枢神经系统损伤，其优选选自脑损伤、脊髓损伤、周围神经损伤、脱髓鞘病。脊髓损伤可包括挫伤性脊髓损伤。
50.当制备根据本公开内容的组合物且特别是活性剂时，优选地避免氨基酸精氨酸。另外，本文中公开的组合物优选避免的另一些氨基酸可以是丝氨酸、脯氨酸、丙氨酸。这样的氨基酸在组合物中在一些浓度或化学计量比下可以是起反作用的或甚至是有害的。
51.本技术中公开的氨基酸可被相应的可药用衍生物(即，盐)替代。
52.根据另一个实施方案，氨基酸组合物可包含可药用赋形剂，如例如蛋白质、维生素、碳水化合物、天然和人工甜味剂和/或矫味物质。在一个优选实施方案中，可药用赋形剂可选自乳清蛋白、麦芽糖糊精、果糖、酪蛋白钙、鱼油、三氯蔗糖、蔗糖酯、维生素d3、b族维生素。
53.对于经口使用，根据本说明书的组合物可以是片剂、胶囊剂、颗粒剂、凝胶剂、可胶凝散剂或散剂的形式。
54.本文中公开的组合物可以以8.0g至24.0g的活性剂剂量/天在对象中施用。
55.本公开内容还提供了在对象中治疗中枢神经系统损伤的方法，该方法包括选择包含活性剂的组合物，所述活性剂包含氨基酸亮氨酸、异亮氨酸、缬氨酸、苏氨酸、赖氨酸，和羧酸柠檬酸、琥珀酸和苹果酸，并施用该组合物以治疗中枢神经系统损伤。
56.关于由组合物提供的多种氨基酸的量及其之间的比率的另外的说明包含在所附权利要求书中，其构成本文中提供的关于本发明的技术教导的必要部分。
57.实施例
58.表1示出了在体外和体内测试的名为“alpha 5m(α5m)”的基于氨基酸的组合物。
59.表1
60.组合物(％w/w)α5ml
‑
亮氨酸31.0885l
‑
赖氨酸hcl盐酸盐16.903l
‑
异亮氨酸10.3628l
‑
缬氨酸10.3628l
‑
苏氨酸7.254
l
‑
半胱氨酸3.1089l
‑
组氨酸3.1089l
‑
苯丙氨酸2.0726l
‑
甲硫氨酸1.0363l
‑
酪氨酸0.6218l
‑
色氨酸2.0726维生素b1(盐酸硫胺素)0.004维生素b6(盐酸吡哆醇)0.0038无水柠檬酸8.0000苹果酸2.0000l
‑
天冬氨酸
‑
琥珀酸2.0000比率，亮氨酸:异亮氨酸:缬氨酸3:1:1
61.α5m组合物可首先通过用0.8筛目筛分所有组分来制备。为了获得预混合物，将每种成分(以总量的按重量计<10％的量)与一部分l
‑
赖氨酸hcl一起放入聚乙烯袋中，以获得总组合物的10％的重量。然后手动摇动袋5分钟。然后将预混合物与其余成分一起装载在混合器(planetaria)中，并以120rpm混合15分钟的时间以获得均匀的最终组合物。
62.方法
63.细胞培养与处理
64.脑膜nsc、脑室下区(svz)来源的nsc(men
‑
神经元和svz
‑
神经元)的细胞培养物补充有α5m组合物(α5m)。将α5m添加至特定培养基(0.1％、0.5％、1％)，然后将培养基ph调节至7.4并过滤，然后将其添加至不同的细胞培养物。每2至3天更换α5m，并在体外天数(days in vitro，div)为10天时补充α5m，直至men
‑
神经元和svz
‑
神经元成熟。
65.细胞培养免疫荧光
66.首先，将细胞平板接种在聚
‑
d
‑
赖氨酸包被的载玻片上。在4％多聚甲醛(pfa，sigma
‑
aldrich)中进行固定步骤之后，通过在封闭溶液(在pbs1x中的3％胎牛血清、1％牛血清白蛋白、0.3％triton x
‑
100)中孵育来封闭非特异性结合位点。随后，将细胞在一抗溶液(封闭溶液中的特异性一抗)中在室温下孵育1.5小时，用封闭溶液洗涤两次并在特异性二抗溶液(封闭溶液中的特异性二抗)中孵育1小时。在封闭溶液中洗涤3次之后，将载片与核染料to
‑
pro3(thermo fisher scientific)一起孵育10分钟，然后封固在显微镜载玻片上进行共聚焦显微镜量化(zeiss lsm 710共聚焦显微镜)。一抗：微管相关蛋白2(map2兔，sigma，1:200)以标记成熟神经元，tomm20(小鼠，1:200，abcam)以标记线粒体。使用以下二抗：驴抗兔alexa fluor 546(molecular probes，1:500)、山羊抗兔alexa fluor 488(molecular probes，1:500)。
67.动物和手术操作
68.实验方案是根据1986年11月24日的欧洲共同体理事会指令(european communities council directive)(86/609/eec)和意大利卫生部(italian ministry of heath)批准和实施的，并且符合国家动物保护指南(the national animal protection guidelines)。
69.使成年雌性c57bl/6j(7周龄)小鼠接受椎板切除术，并在脊椎动物胸水平11(t11)下进行挫伤性损伤(sci)。分别用18、20和12只动物进行了三个不同的实验。
70.在进行每次sci手术之前，对所有动物进行称重，并且只有重量为16至21gr的小鼠才被考虑用于实验。手术时动物的重量在图5中示出。
71.由于所进行的手术的严重程度或恢复期期间的并发症，重度sci的操作导致50只动物中有1只死亡。
72.将动物独立地圈养在干净的聚丙烯笼中并分为2组：1)对照饲喂组(ctrl，n＝22)；2)α5m饲喂组(α5m，n＝25)，即用表1中所示的氨基酸组合物饲喂的动物组。
73.运动评价
74.为了评价α5m补充对重度sci之后运动功能恢复的影响，进行了basso小鼠评分(bms)分析(basso等,2006)。在sci手术之后第一周期间在1、3、5、7dpi时评估每只小鼠的运动性能，以及每周两次(10、14、17、21、28、31dpi)进行直至实验结束(31dpi)，在实验结束时对小鼠进行灌流并解剖脊髓。只有在1dpi时显示bms评分为“0”的小鼠才被包含在分析中，具有较高bms评分的小鼠被排除在研究之外。
75.踝运动分析
76.该参数允许确定所施加的处理是否显示出避免与踝关节运动相关的肌肉痉挛状态的恢复的有益作用。在该分析中，确定了左和右踝关节二者的运动评分与其运动质量相一致：“0”对应于无运动(痉挛状态)“0.5”对应于不完整的运动，而“1”对应于正常运动。
77.膀胱功能性评价
78.从1dpi开始直至实验结束，分析动物的利尿。手动排空膀胱并收集尿，然后每天称重两次直至5dpi，并随后每天称重一次直至实验结束。组织组织学和免疫组织化学分析
79.脊髓固定及处理
80.将动物通过腹膜内注射水合氯醛(2,2,2
‑
三氯乙烷
‑
1,1
‑
二醇，2ml/kg)麻醉，并心内灌注盐水溶液(0.9％nacl)随后是添加有在pbs 1x中的4％蔗糖的4％多聚甲醛(pfa，sigma
–
aldrich)。提取脊髓并随后在4％pfa/4％蔗糖中固定过夜。然后将其储存在4℃下在30％蔗糖溶液中以冷冻保护组织。对于组织化学分析，将1.5cm解剖脊髓(距病变部位，前端(rostral)0.75cm和尾端(caudal)0.75cm)用最佳切割温度(optimal cutting temperature，oct)化合物包埋并进行冷冻切片(25μm厚的横断切片或20μm厚的纵断切片)。将获得的切片储存在
‑
20℃下，并用组织学和免疫组织化学方法进行分析。
81.勒克司坚牢蓝染色(图13)
82.通过勒克司坚牢蓝(lfb)染色量化组织切片中的髓鞘含量。首先，制备0.1％lfb溶液，使lfb(sigma
‑
aldrich)溶解于95％乙醇(etoh，carlo erba)和1.22％冰乙酸(carlo erba)中。然后，使切片在etoh溶液(100％、95％、70％和50％)中水合，并在40℃下用0.1％lfb溶液染色40分钟。然后将其用自来水冲洗并在0.05％li2co3溶液(sigma
‑
aldrich)中分化，在etoh溶液(50％、70％、95％和100％)中脱水，在二甲苯(carlo erba)中澄清并用entellan(merck
‑
millipore)封固，用于髓鞘含量的光学显微术分析(zeiss axioscop2)。
83.脊髓组织分析
84.将冷冻切片解冻，用pbs 1x洗涤并在封闭溶液(在pbs 1x中的0.25％tritonx
‑
100、2％牛血清白蛋白)中孵育30分钟以封闭非特异性结合位点。然后将载片在一抗溶液
(封闭溶液中的特异性一抗)中在4℃下孵育过夜。在封闭溶液中进行5分钟的6次冲洗之后，将载片在特异性二抗溶液(封闭溶液中的特异性二抗)中在室温下孵育4小时。在封闭溶液中洗涤3次并在pbs 1x中洗涤3次之后，将载片与核染料to
‑
pro3(thermo fisher scientific)或4’.6
‑
二脒基
‑2‑
苯基吲哚(dapi，thermo fisher scientific，1:2000)一起孵育10分钟，并使用1.4
‑
二氮杂双环(2.2.2)辛烷(dabco，sigma
‑
aldrich)封固，用于显微镜定量(zeiss lsm 710共聚焦显微镜)。使用的一抗：胶质细胞原纤维酸性蛋白(gfap山羊，1:200，abcam)以标记星形胶质细胞(图9)，神经丝
‑
200(nf200兔，1:200，sigma)以标记神经元细胞骨架的神经丝蛋白200kda(图12)、neun(neun小鼠，chemicon，1:200)以标记神经元(图11)。使用的二抗：驴抗兔alexa fluor 546(molecular probes，1:500)、山羊抗兔alexa fluor488(molecular probes，1:500)、驴抗小鼠alexa fluor 488(molecular probes，1:500)、山羊抗小鼠cy3(amersham，1:500)、驴抗山羊alexa flour 488(life
‑
technologies，1:500)。
85.结果
86.体外分析
87.体外分化nsc中的线粒体含量
88.通过免疫荧光和共聚焦分析，评价了map2阳性神经元细胞中线粒体标志物tomm20覆盖的面积。
89.图1中的图示出了分化神经元中每个map2+树突的线粒体区域(即tomm20+区域)的量化，表明α5m补充能够在0.5％的浓度下提高线粒体含量。
90.体外分化nsc中的氧化代谢
91.通过使用seahorse技术分析对照和α5m处理(0.5％浓度)的men
‑
神经元和svz
‑
神经元的氧消耗率(oxygen consumption rate，ocr)来评价nsc分化细胞的氧化代谢。
92.在补充有α5m组合物的分化神经元中观察到ocr的统计学显著的提高(图2a)，并且因此，基础和最大呼吸也提高，如在图2b和c中示出。
93.值得注意的是，atp产生翻倍(men
‑
神经元：从125.1到280.1pmol/分钟/μg，图2d；svz
‑
神经元：从156.1到523.0pmol/分钟/μg)，这表明更高的能量处理。
94.因此，与先前的结果一致，观察到补充有本技术组合物的细胞的线粒体功能性提高。
95.nsc分化细胞的树突分枝
96.在α5m补充之后，men
‑
神经元和svz
‑
神经元显示出氧化代谢和线粒体活性的提高。为了比较在对照和补充条件下脑膜nsc神经成熟和svz来源nsc神经成熟，诱导神经球分化为神经元，并通过在10div下对神经元标志物map2进行免疫荧光和共聚焦分析来分析形态变化。
97.虽然α5m补充没有改变map2
+
分化细胞的百分比，但观察到成熟神经元形态的显著增多，包括树突分支和树突棘(图3和图4)。
98.当分析分枝的map2
+
细胞的形态时，观察到在0.5％补充的men
‑
神经元中，每个细胞的分支(即包含在两个连接点之间的map2
+
段)的平均数量的统计学提高(从15.07到18.55个分支，图3a)，并且在0.5％补充的svz
‑
神经元中也观察到了类似的趋势(从15.27到17.07个分支)。
99.当补充有α5m组合物时，分支的平均数量的提高与在两个群中总树突长度的统计学提高一致(men
‑
神经元：301.6至458.6μm，图3b；svz
‑
神经元：225.5至285.2μm)。这些数据表明在补充α5m之后细胞复杂性提高，以及树突覆盖提高。
100.为了进一步表征在α5m补充的神经元中神经元成熟的提高，使用imagej软件评价了每种实验条件下的树突棘数量和密度。树突棘数量在0.5％补充的神经元中逐渐提高(men
‑
神经元：从119.6到198.2个棘/map2+神经元，图4a；svz
‑
神经元，109.2到152.0个棘/map2+神经元)。通过使用neuron studio软件(rodriguez等,2008)分析特定的棘形态。成熟神经元的树突棘将形态从细长的细棘修改为更稳定的粗短和蘑菇状棘。
101.在men
‑
神经元中，在0.1％和0.5％浓度的α5m组合物下观察到粗短的棘提高(从36.15％分别到48.62％和47.56％)，而在svz
‑
神经元中，在0.1％和0.5％下观察到蘑菇状棘的级分提高(从22.81％分别到28.58％和29.03％)。
102.这些数据表明，在补充有α5m组合物的men
‑
神经元和svz
‑
神经元二者中树突棘获得了稳定的形态(即分别为粗短的和蘑菇状)，这确认了α5m补充在增强神经元成熟方面的作用。
103.为了确认分化神经元的成熟，通过使用imagej软件(dzyubenko等,2016)，在对照和在α5m补充的神经元中分析突触前和突触后兴奋性标志物突触生长蛋白和psd95的表达来评估突触的存在。
104.与对照相比，在经补充神经元中，突触生长蛋白免疫反应性斑点(punctum)的数量(图4b)以及psd95免疫反应性斑点的数量(图4c)提高。
105.这些结果确认了与对照相比，在α5m补充的神经元中成熟提高，因为其显示出更多的分支、更成熟的棘和更多的突触标志物，这是由于分化神经元中的氧化代谢的增强所致。
106.体内分析
107.使成年雌性c57bl/6j小鼠接受椎板切除术，并在脊椎动物胸水平11(t11)下进行挫伤性损伤。由于所进行的手术的严重程度或恢复期期间的并发症，重度sci的操作导致50只动物中有1只死亡。
108.在sci之后三天(3dpi)施用α5m组合物的补充(在饮用水中3g/天)。这种治疗方法约在sci发病机制的亚急性期结束时开始。该补充维持31天。比较经处理和对照动物的运动恢复和组织组织学。
109.运动评价
110.为了评价α5m补充对重度sci之后运动功能恢复的影响，进行了basso小鼠评分(bms)分析。在sci手术之后第一周期间在1、3、5、7dpi时评估每只小鼠的运动性能，以及每周两次(10、14、17、21、28、31dpi)进行直至实验结束(31dpi)，在实验结束时对小鼠进行灌流并解剖脊髓。只有在1dpi时显示bms评分为“0”的小鼠才被包含在分析中，具有较高bms评分的小鼠被排除在研究之外。
111.图6的图表示在重度sci之后α5m组合物处理的(上方带三角形的线)和对照(下方带正方形的线)的bms评分。箭头表示α5m组合物施用的起始日(3dpi)。受伤的小鼠接受在无菌水中的α5m组合物(3个实验中n＝22)或仅无菌水(3个实验中n＝25)。
112.在施用的28天内，与对照sci小鼠相比，经处理小鼠的bms逐渐且显著提高。
113.在31dpi时经处理的小鼠达到1.773
±
0.2434的平均bms评分，而对照组达到0.92
±
1.772的平均bms评分(用双因素anova检验和事后tukey后检验分析实验条件之间的差异)。
114.因此，与对照小鼠相比，用α5m组合物处理的小鼠在运动恢复方面显示出显著改善。如图6所示，事后分析显示出在14、17、21、24、28、31dpi时bms评分的显著的组差异。
115.踝运动分析
116.认为“痉挛状态”是由损伤引起的常见症状(adam和hick,2005)，并且其是受多种中枢神经系统疾病(例如多发性硬化、卒中和脑性瘫痪)和创伤(包括sci和脑损伤)影响的个体失能的主要原因。
117.为了确定补充α5m组合物是否具有避免肌肉痉挛状态恢复的作用，评价了踝关节的运动程度。从21dpi开始直至实验结束(31dpi)，每天评估每只经处理和对照小鼠的痉挛状态，图7。
118.与对照动物相比，经处理动物的踝关节柔韧性显示出显著改善。在31dpi时，经处理动物表现出的踝运动为0.6888
±
0.0455，而对照为0.5939
±
0.0651(用双因素anova检验和事后tukey后检验分析实验条件之间的差异)。
119.因此，从21dpi直至29dpi，与对照小鼠相比，用α5m组合物处理的小鼠显示出显著更高的踝运动，这表明损伤之后肌肉痉挛状态的恢复更快。
120.膀胱功能性评价
121.sci之后最常见的影响之一是膀胱活动的功能障碍。sci之后，膀胱(通常被称为神经源性膀胱)经历剧烈变化，导致痉挛性膀胱或弛缓性膀胱(taweel w.a等,2015)。为了研究在重度sci之后α5m组合物的施用是否可在膀胱功能性的恢复中发挥有益作用，分析了α5m组合物处理的小鼠和对照小鼠的每日利尿。
122.在实验期间，α5m组合物处理的动物和对照动物显示出类似的每日利尿(图8)。在31dpi时，处理组显示出平均每日利尿为0.6359g
±
0.1073g，而对照组为0.5889g
±
0.1145g，这因此提供了α5m组合物在损伤之后在膀胱功能性恢复方面有作用的证据。
123.组织组织学
124.对脊髓的创伤性损伤会导致机械损伤和随后的组织退化。这些事件与细胞膜和轴突的剪切、血液
‑
脊髓屏障的破坏、髓鞘降解、免疫细胞迁移和脊髓细胞死亡有关(zhang等,2012)。为了研究α5m组合物处理如何有助于受伤组织的再生，脊髓实质囊性(囊肿)和胶质瘢痕形成、神经元数量、髓鞘含量。
125.囊性和胶质瘢痕形成
126.sci之后，在损伤部位周围胶质瘢痕形成和囊性形成(hu r等,2010,yi
‑
min yuan和cheng he,2013)有助于限制病变区域。然而，其在sci之后作为物理和分子屏障(fehlings m.g.和tator c.h.,1999)抑制轴突再生(rooney ge等,2009)。
127.考虑到胶质细胞响应于损伤的重要性，本技术的发明人评价了α5m组合物的施用是否对瘢痕形成和星形胶质细胞反应发挥作用。使用星形胶质细胞的特异性标志物胶质细胞原纤维酸性蛋白(gfap)进行免疫荧光染色。观察到脊髓横断切片覆盖了以病变部位(在t11椎骨水平下进行的病变)为中心的1.5cm长的实质段(15个横断脊髓切片/动物)。
128.图9示出了用特异性星形胶质细胞标志物gfap和to
‑
pro3
tm
免疫染色的对照小鼠的横断脊髓切片(a、c)以及α5m组合物处理的小鼠的横断脊髓切片(b、d)，说明了量化考虑的
区域。灰色虚线区域表示胶质瘢痕区域。白色虚线区域表示囊性(囊肿)区域。如图e所示，与对照(42.94％
±
3.249)相比，施用本文中公开的组合物导致囊肿面积显著降低(21.62
±
2.505％)。图f显示出，与对照(57.06％
±
3.294％)相比，在施用α5m之后动物表现出显著更大的胶质瘢痕面积(78.81％
±
2.232％)。
129.图10示出了表示在对照和α5m处理的小鼠中胶质瘢痕面积占总切片面积的百分比比率的图。与对照动物(7.2％
±
0.7068％)相比，在α5m处理之后动物表现出显著更小的囊肿面积(3.55％
±
0.6756％)。
130.这些数据突出了本文中公开的组合物在抵消在损伤之后的神经组织损失方面的高效力。
131.神经元含量
132.在由于第一次机械损伤引起的脊髓组织退化之后是继发性损伤，其决定了神经元细胞的进一步破坏(zhang n.等,2012)。
133.为了研究在重度sci之后补充α5m组合物对神经元含量的影响，发明人通过用特异性神经元标志物neun进行免疫荧光染色评估了脊髓病变实质中的神经元数量。分析了脊髓横断切片，其覆盖了以病变部位(在t11椎骨水平下进行的病变)为中心的1.5cm长的实质段(15个横断脊髓切片/动物)。
134.首先，评价了在整个脊髓切片中neun阳性细胞的数目。引人注目的是，分析显示出在病变周围区域，与对照组(224.9
±
58.03)相比，在α5m处理组中，存在更多的神经元(613.3
±
24.04)，并且差异是统计学显著的(图11)。
135.发明人还评价了神经元含量的差异是否也在运动神经元所在的脊髓切片的腹侧区域中维持。同样地，在这种情况下，与对照组(62.66
±
13.51)相比，在α5m处理组(255.8
±
12.35)中产生的neun阳性细胞数目显著更高。该差异是统计学显著的，因此提供了本文中公开的组合物在损伤之后的神经元含量恢复方面有作用的证据。
136.神经丝分析
137.成熟神经元轴突中的主要结构蛋白是神经丝(neurofilament，nf)。其表达与轴突生长和神经元稳态的维持密切相关(wang h.等,2012)。sci之后，灰质中的神经元损失伴随着神经丝链和髓鞘蛋白的损失(qian j.等,2010)。
138.为了研究在α5m组合物处理的sci小鼠中轴突再生的存在，发明人使用神经丝蛋白的特异性标志物神经丝
‑
200(nf200)进行了免疫荧光染色。对于分析，发明人考虑了脊髓纵断切片，其覆盖了以病变部位(在t11椎骨水平下进行的病变)为中心的1.5cm长的实质区域(6个横断脊髓切片/动物)。图12中示出的图表示在α5m处理的和对照小鼠中，在选定目标区域(roi)上神经丝
‑
200覆盖的面积的百分比比率。
139.与对照组(16.22
±
3.31％)相比，处理组表现出更高的nf200含量(23.56
±
6.441％)的趋势(图12)。
140.这些结果显示出α5m组合物有利于损伤之后轴突再生的能力。
141.髓鞘再生潜能
142.脱髓鞘构成sci病理学的重要组分部分，并导致功能丧失(waxman sg等,1989)。为了评估在重度sci之后补充α5m组合物对小鼠的髓鞘再生潜能，进行了勒克司坚牢蓝(lfb)染色。lfb允许从脱髓鞘区域(白色区域)鉴定出脊髓实质(蓝色区域)中的髓鞘含量，如图13
所示。该分析是对脊髓横断切片进行的，其覆盖了以病变部位(在t11椎骨水平下进行的病变)为中心的1.5cm长的实质段(15个横断脊髓切片/动物)。图13的图表示α5m处理(39.64％
±
0.3677)和对照(38.47％
±
0.8927)的脊髓切片的背侧柱中髓鞘含量的百分比，其计算为背侧柱总面积的像素中的背侧柱中髓鞘阳性像素。在31dpi时，接受α5m补充的动物表现出与对照动物相似的髓鞘含量，因此提供了α5m组合物在重度sci之后有髓鞘再生潜能的证据。
143.本公开内容中提供的结果表明，本文中公开的包含亮氨酸、异亮氨酸、缬氨酸、苏氨酸、赖氨酸以及柠檬酸、琥珀酸和苹果酸的组合的氨基酸组合物能够增强分化神经元中的氧化代谢，有利于损伤之后的轴突再生，并抵消sci动物模型中的神经组织损失。
144.从上文可以清楚地看出，根据本公开内容的组合物如何可用于在对象中治疗中枢神经系统损伤，其中所述损伤优选选自脑损伤、脊髓损伤、周围神经损伤、脱髓鞘病。
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