重组蜘蛛丝挤出物制剂的制作方法

重组蜘蛛丝挤出物制剂
1.相关申请的交叉引用
2.本技术要求2019年7月12日提交的美国临时申请号62/873,395和2020年2月12日提交的美国临时申请号62/975,647的权益，这些申请的内容各自以引用的方式整体并入。
技术领域
3.本公开涉及由基于丝的挤出物形成的重组蜘蛛丝组合物，诸如可吸附至皮肤的稳定膜。


背景技术：

4.丝为一种结构蛋白，其许多特质使其适用于诸如护肤品和化妆品的应用中。最近的技术已经得到了各种重组蜘蛛丝多肽和使用各种宿主生物从重组蜘蛛丝多肽得到的多肽的可扩展生产。然而，难以将回收的丝粉末溶解于溶液中以产生期望的制剂，诸如全长基于丝的固体或凝胶组合物一直是一个重大挑战。
5.大多数掺入了丝的化妆品和护肤品产品都试图通过使用已经水解成小氨基酸链的丝来克服溶解度问题。然而，这些包含降解的丝蛋白片段的组合物失去了期望的丝的性质。此外，不期望在旨在接触皮肤的丝制剂中使用有害溶剂。
6.虽然生产丝胶蛋白耗尽的蚕丝(本文称为“丝素蛋白(silk fibroin)”)的新方法已经得到了各种确实掺入全长(即，非水解的)丝蛋白的护肤品产品，但是丝的自聚集性质可能影响这些产品的货架期稳定性。具体来说，全长丝素蛋白分子倾向于聚集并从溶液中沉淀出来。此外，这些过程是不可扩展的，因此在商业上是不可行的。
7.因为重组蜘蛛丝多肽形成与丝素蛋白类似的二级和三级结构，所以它同样期望用于化妆品和护肤品制剂中，但也可能由于自聚集而表现出类似的稳定性和溶解度问题。
8.因此，需要的是增加重组蜘蛛丝多肽在丝制剂(例如，化妆品和护肤品制剂)中的溶解度和稳定性的可扩展方法，这些方法不使用有害溶剂并且维持期望的全长丝蛋白的性质。


技术实现要素：

9.在一些实施方案中，本文提供了一种制备基于丝的乳液的方法，其包括：通过向包含重组蜘蛛丝多肽粉末和甘油的组合物施加压力和剪切力来混合组合物，从而将组合物转化成挤出物；将所述挤出物的至少一部分悬浮在水性溶剂中，以形成水性挤出物悬浮液；以及将所述水性挤出物悬浮液混合成乳液，以形成所述基于丝的乳液。
10.在一些实施方案中，挤出物是大致上均质的。在一些实施方案中，基于丝的乳液是化妆品或护肤品制剂。
11.在一些实施方案中，本文还提供了一种制备基于丝的固体或凝胶的方法，其包括：通过向包含重组蜘蛛丝多肽粉末和甘油的组合物施加压力和剪切力来混合组合物，从而将组合物转化成挤出物；将所述挤出物悬浮在水性溶剂中，以形成水性挤出物悬浮液；以及干
燥所述水性挤出物悬浮液，以形成基于丝的固体或凝胶。在一些实施方案中，所述方法还包括凝结所述水性挤出物悬浮液，以在所述悬浮液中形成聚集的丝。
12.在一些实施方案中，基于丝的固体或凝胶是膜。在一些实施方案中，基于丝的固体是化妆品或护肤品制剂。
13.根据本发明的一些实施方案，本文还提供了一种制备基于丝的制剂的方法，其包括：提供包含丝蛋白和增塑剂的组合物；向组合物施加压力和剪切力，从而将组合物转化成挤出物；以及将所述挤出物悬浮在水性溶剂中，以形成水性挤出物悬浮液。
14.在一些实施方案中，所述方法还包括干燥所述水性挤出物悬浮液，以形成基于丝的固体或凝胶。在一些实施方案中，所述方法还包括将所述水性挤出物悬浮液混合成乳液，以形成所述基于丝的乳液。在一些实施方案中，所述方法还包括干燥所述基于丝的乳液，以形成基于丝的固体或凝胶。在一些实施方案中，所述方法还包括向所述基于丝的固体或凝胶添加凝结剂或添加剂，以形成更坚固的凝胶或固体。在一些实施方案中，所述方法还包括凝结所述水性挤出物悬浮液，以在所述悬浮液中形成聚集的丝。
15.在一些实施方案中，水性挤出物悬浮液包括凝胶相、胶态相和溶液相。在一些实施方案中，所述方法还包括将所述凝胶相、所述胶态相或所述溶液相从所述水性挤出物悬浮液中分离出来。在一些实施方案中，所述方法还包括干燥所述凝胶相、所述胶态相或所述溶液相，以形成基于丝的固体或凝胶。在一些实施方案中，所述方法还包括将所述胶态相和所述溶液相的混合物从所述水性挤出物悬浮液中分离出来。在一些实施方案中，所述方法还包括干燥所述胶态相和所述溶液相的所述混合物，以形成基于丝的固体或凝胶。
16.在一些实施方案中，丝是重组蜘蛛丝。在一些实施方案中，重组蜘蛛丝包括全长蛋白。在一些实施方案中，基于丝的固体或凝胶是护肤品或化妆品制剂。在一些实施方案中，基于丝的乳液是护肤品或化妆品制剂。
17.在一些实施方案中，增塑剂是甘油。在一些实施方案中，水性溶液是水。在一些实施方案中，凝结剂是甲醇。
18.在一些实施方案中，挤出物处于可流动状态。
19.在一些实施方案中，基于丝的固体或凝胶是无毒的。在一些实施方案中，基于丝的乳液是无毒的。
20.在一些实施方案中，施加的剪切力为至少1.5牛顿米。在一些实施方案中，施加的压力为至少1mpa。
21.在一些实施方案中，所述方法还包括搅拌所述水性挤出物悬浮液。在一些实施方案中，所述方法还包括向所述水性挤出物悬浮液施加热。
22.在一些实施方案中，基于丝的固体或凝胶是膜。在一些实施方案中，膜在与皮肤或水接触或轻轻揉搓后分散。在一些实施方案中，膜在低于37℃但高于23℃的温度下分散成液体。
23.根据一些实施方案，本文还提供了一种制备基于丝的凝胶、胶态或溶液的方法，其包括：通过向包含丝蛋白和增塑剂的组合物施加压力和剪切力来混合组合物，从而将组合物转化成挤出物；将所述挤出物悬浮在水性溶剂中，以形成水性悬浮挤出物；加热和/或搅拌所述水性悬浮挤出物，以形成凝胶相、胶态相和溶液相；以及分离所述相，以得到基于丝的凝胶、胶态或溶液。
24.在一些实施方案中，本文提供一种组合物，其包含：包含重组丝蛋白和增塑剂的挤出物，其中所述挤出物悬浮在水性溶液中。
25.在一些实施方案中，悬浮在所述水性溶液中的挤出物形成胶体溶液。在一些实施方案中，挤出物呈颗粒均匀地分散在所述水性溶液中。在一些实施方案中，所述水性溶液中颗粒的多分散指数为0.1至0.9。在一些实施方案中，所述水性溶液中颗粒的z-平均值为约600至1,000nm。
26.在一些实施方案中，组合物还包含凝结剂。
27.在一些实施方案中，增塑剂是甘油。
28.在一些实施方案中，组合物是膜。在一些实施方案中，膜在室温下是稳定的并且与皮肤或水接触后分散。
29.在一些实施方案中，重组丝蛋白大致上是全长蛋白。在一些实施方案中，重组丝蛋白大致上不在所述组合物中聚集。在一些实施方案中，与粉末形式的重组丝蛋白相比，重组丝蛋白的结晶度下降、类似或增加。
30.根据一些实施方案，本文还提供一种蜘蛛丝化妆品或护肤品产品，其包含有包含丝蛋白和增塑剂的挤出物，其中所述挤出物以凝胶、胶体或溶液相的形式分散在水性溶剂或凝结剂中。
31.在一些实施方案中，挤出物分散在所述水性溶剂和所述凝结剂中。在一些实施方案中，所述蜘蛛丝化妆品或护肤品产品是乳液或水性溶液。
32.根据一些实施方案，本文还提供一种蜘蛛丝化妆品或护肤品产品，其包括固体或半固体，其中所述固体或半固体包含分散的非聚集重组丝蛋白和增塑剂。
33.在一些实施方案中，固体或半固体在与皮肤接触后溶解。在一些实施方案中，固体或半固体是膜。
附图说明
34.前述和其他目标、特征以及优点将由本发明的具体实施方案的以下描述显而易见，如附图中所说明。
35.图1示出根据本发明的各种实施方案在选定热和rpm条件下挤出的p49w21g30熔体组合物的尺寸排阻色谱法数据。
36.图2示出根据本发明的各种实施方案在选定热和rpm条件下挤出的p65w20g15熔体组合物的尺寸排阻色谱法数据。
37.图3示出根据本发明的各种实施方案在选定热和rpm条件下挤出的p71w19g10熔体组合物的尺寸排阻色谱法数据。
38.图4示出根据本发明的各种实施方案在选定热和rpm条件下挤出的p49w21g30熔体组合物在挤出期间的失水量表，如通过热重分析(tga)所测量。所述数据示出在挤出之前起始粒料和在挤出之后在选定条件下挤出的样品中的％含水量。
39.图5示出根据本发明的各种实施方案在选定热和rpm条件下挤出的p65w20g15熔体组合物在挤出期间的失水量表，如通过热重分析(tga)所测量。所述数据示出在挤出之前起始粒料和在挤出之后在选定条件下挤出的样品中的％含水量。
40.图6示出根据本发明的各种实施方案在选定热和rpm条件下挤出的p71w19g10熔体
组合物在挤出期间的失水量表，如通过热重分析(tga)所测量。所述数据示出在挤出之前起始粉末和在挤出之后在选定条件下挤出的样品中的％含水量。
41.图7示出在选定热和rpm条件下挤出的p49w21g30样品的β折叠含量，如通过傅里叶变换红外光谱术(fourier transform infrared spectroscopy，ftir)所测量。将样品与起始蛋白粉末和起始粒料的参考对照相比较。
42.图8示出在选定热和rpm条件下挤出的p65w20g15样品的β折叠含量，如通过傅里叶变换红外光谱术(ftir)所测量。将样品与起始蛋白粉末和起始粒料的参考对照相比较。
43.图9示出在选定热和rpm条件下挤出的p71w19g10样品的β折叠含量，如通过傅里叶变换红外光谱术(ftir)所测量。将样品与起始蛋白粉末和起始粒料的参考对照相比较。
44.图10示出使用偏振光显微镜捕获的在20℃下在10、100、200或300rpm下产生的选定挤出产品的图像。
45.图11示出使用偏振光显微镜捕获的在95℃下在10、100、200或300rpm下产生的选定挤出产品的图像。
46.图12示出根据本发明的各种实施方案在选定热和rpm条件下挤出的p49w21g30挤出物在挤出期间的甘油损失量表，如通过hplc所测量。所述数据示出在挤出之前起始粉末或粒料和在选定条件下挤出之后样品中的％甘油含量。
47.图13示出根据本发明的各种实施方案在选定热和rpm条件下挤出的p65w20g15挤出物在挤出期间的甘油损失量表，如通过hplc所测量。所述数据示出在挤出之前起始粉末或粒料和在选定条件下挤出之后样品中的％甘油含量。
48.图14示出根据本发明的各种实施方案在选定热和rpm条件下挤出的p71w19g10挤出物在挤出期间的甘油损失量表，如通过hplc所测量。所述数据示出在挤出之前起始粉末或粒料和在选定条件下挤出之后样品中的％甘油含量。
49.图15示出以在甘油中的10％丝、17％丝或25％丝，在所示的持续时间内和温度下，使用xplore mc15锥形双螺杆挤出机(xplore tce)制备的丝/甘油挤出物的显微镜视图和宏观视图(插图)。示出甘油中未溶解的丝粉末以供参考。
50.图16示出在90℃下在xplore tse挤出机中循环30秒、4分钟、5分钟、10分钟、20分钟、0.5小时、1小时和1.5小时的挤出物的光学显微镜图像。
51.图17示出挤出物、以不同浓度重悬浮在水中的挤出物以及在室温或90℃下搅拌后重悬浮在水中的挤出物的光学显微镜图像。
52.图17示出挤出物、以不同浓度重悬浮在水中的挤出物以及在室温或90℃下搅拌后重悬浮在水中的挤出物的光学显微镜图像。
53.图18示出以下的宏观视图和微观视图：i)相分离之前悬浮在水中的挤出物溶液；ii)凝胶粒料相，胶态上清液(即，
‘
胶态上清液(colloidal supe)’)；和iii)与胶态上清液分开的胶态相和溶液相。还示出了由以下得到的干膜：i)相分离之前悬浮在水中的挤出物；ii)凝胶粒料；iii)胶态上清液；和iv)溶液相。
54.图19示出根据本发明的一个实施方案，制备丝-甘油乳液膜并将膜应用于测试受试者皮肤的过程。
55.图20示出根据本发明的一个实施方案，制备丝-甘油乳液冻干膜并将膜应用于测试受试者的皮肤的过程。
56.图21示出制备和干燥以下的过程：i)丝-甘油挤出物的悬浮液；和ii)丝甘油浆液(非挤出物)悬浮液。还示出干燥每种悬浮液的结果和各自的代表性成膜潜力。
57.图22示出制备和干燥以下的过程：i)包含丝-甘油挤出物的乳液；和ii)包含丝-甘油浆液(非挤出物)的乳液。还示出干燥每种悬浮液的结果和各自的代表性成膜潜力。
58.图23示出以下的宏观视图和微观视图：i)用水稀释5倍的水性重悬浮挤出物；和ii)用甲醇稀释5倍的水性重悬浮挤出物。
59.图24示出将i)未暴露于甲醇和ii)暴露于甲醇的丝-甘油挤出物干膜应用于皮肤的结果(左)。还示出了相同的膜组合物在皮肤上揉搓的结果(右)。
60.图25a示出本文所述的选定丝挤出物和非挤出物组合物的分析β折叠含量的ftir光谱。图25b示出如通过ftir光谱所确定的这些组合物的相对β折叠含量的定量。图25c示出如通过ftir光谱所确定的这些组合物的相对于甘油的氨基酸含量的定量。
61.图26示出悬浮在水中的20％、15％、10％和5％挤出物的干燥后悬浮液的粘度以及其对应于β折叠含量的相应ftir峰。
62.图27示出如通过尺寸排阻色谱法测量的，如在粉末、粉末上清液、挤出物和挤出物上清液中所测量的，聚集、全长和低分子量蛋白质的蛋白质浓度(重量％)的图。
63.图28示出如通过malvin仪器zetasizer nano所测量的，挤出物上清液中颗粒的大小分布。
64.图29是在4℃下孵育24小时之后，5％丝粉末混合物(左)和5％丝挤出物上清液(右)的溶液的图像。
65.图30示出如通过蒸气压力计(vapometer)针对胶带剥离之前(基线)、胶带剥离之后(剥离后)以及向胶带剥离的皮肤应用i)未处理、ii)在水中的15％甘油(媒介物对照)和iii)5％丝蛋白挤出物混合物(5％挤出物)之后30分钟和2小时的皮肤所测量的经皮水流失的曲线图。
具体实施方式
66.在以下描述中阐述了本发明的多个实施方案的详情。本发明的其他特征、目标和优点从描述来看将是显而易见的。除非本文中另外定义，否则与本发明结合使用的科学和技术术语应具有本领域中的普通技术人员通常所理解的含义。另外，除非上下文另外要求，否则单数术语应包括复数，且复数术语应包括单数。除非上下文另有规定，否则术语“一个”和“一种”包括多个引用。通常，与以下结合使用的命名法和以下技术为本领域中众所周知且常用的那些：本文所述的生物化学、酶学、分子与细胞生物学、微生物学、遗传学和蛋白质与核酸化学以及杂交。
67.定义
68.除非另外指示，否则以下术语应理解成具有以下含义：
69.如本文关于丝蛋白所用，术语“稳定系”是指产物不形成由丝蛋白的自聚集所致的胶凝、变色或浑浊的能力。例如，美国专利公开号2015/0079012(wray等人)涉及使用保湿剂(包括甘油)来增加包含全长丝素蛋白的护肤品产品的货架期稳定性。美国专利公开号9,187,538涉及货架期稳定长达10天的包含全长丝素蛋白的护肤品制剂。这两篇公开以引用的方式整体并入本文。
70.术语“多核苷酸”或“核酸分子”是指长度为至少10个碱基的核苷酸的聚合形式。所述术语包括dna分子(例如，cdna、或基因组dna、或合成dna)和rna分子(例如，mrna或合成rna)，以及含有非天然核苷酸类似物、非天然核苷间键或两者的dna或rna的类似物。核酸可以呈任何拓扑构象。例如，核酸可为单链、双链、三链、四链、部分双链、具支链、发夹型、环状或呈挂锁(padlocked)构象。
71.除非另外指示，且作为本文中以通用格式“seq id no:”描述的所有序列的实例，“包含seq id no:1的核酸”是指如下核酸，其至少一部分具有以下序列：(i)序列seq id no:1，或(ii)与seq id no:1互补的序列。两者之间的选择由上下文决定。例如，如果将核酸用作探针，那么两者之间的选择由探针与所需靶标互补的要求决定。
[0072]“分离的”rna、dna或混合聚合物为如下rna、dna或混合聚合物，其与在其天然宿主细胞中自然伴随天然多核苷酸的其他细胞组分，例如与其天然缔合的核糖体、聚合酶和基因组序列大致上分离。
[0073]“分离的”有机分子(例如丝蛋白)为如下有机分子，其与其所起源的宿主细胞的细胞组分(膜脂、染色体、蛋白质)或培养所述宿主细胞的培养基大致上分离。所述术语不要求生物分子与所有其他化学物质分离，但是某些分离的生物分子可被纯化至接近均质性。
[0074]
术语“重组体”是指如下生物分子(例如基因或蛋白质)，其：(1)已从其天然存在的环境中移出，(2)与在自然界中发现所述基因的多核苷酸的全部或部分不缔合，(3)与在自然界中未与其连接的多核苷酸可操作地连接，或者(4)在自然界中不存在。术语“重组体”可关于克隆的dna分离物、化学合成的多核苷酸类似物或由异源系统生物合成的多核苷酸类似物以及由此类核酸编码的蛋白质和/或mrna使用。
[0075]
在本文中，如果异源序列与内源核酸序列相邻放置，使得所述内源核酸序列的表达发生改变，那么将生物体基因组中所述内源核酸序列(或所述序列的编码蛋白产物)视为“重组体”。在此背景下，异源序列为与内源核酸序列天然不相邻的序列，无论所述异源序列本身为内源的(源自同一宿主细胞或其后代)亦或外源的(源自不同宿主细胞或其后代)。例如，启动子序列可取代(例如，通过同源重组)宿主细胞基因组中的基因的天然启动子，使得所述基因具有经改变的表达模式。所述基因现将变成“重组体”，因为其与自然侧接它的序列中的至少一些序列分离。
[0076]
如果核酸含有基因组中的对应核酸中不自然存在的任何修饰，那么所述核酸同样被视为“重组体”。例如，如果内源编码序列含有人工引入(例如通过人为干预引入)的插入、缺失或点突变，那么所述内源编码序列被视为“重组体”。“重组核酸”还包括在异源位点处整合到宿主细胞染色体中的核酸和作为附加体存在的核酸构建体。
[0077]
如本文所用，术语“肽”是指短多肽，例如，长度通常短于约50个氨基酸且长度更通常短于约30个氨基酸的短多肽。如本文所用的术语包括模拟结构且因此模拟生物功能的类似物和模拟物。
[0078]
术语“多肽”涵盖天然存在和非天然存在的蛋白质及其片段、突变体、衍生物和类似物。多肽可为单体或聚合的。另外，多肽可包含多个不同结构域，每个结构域均具有一种或多种不同活性。
[0079]
术语“分离的蛋白”或“分离的多肽”为以下蛋白或多肽，由于其来源或衍生来源，所述蛋白或多肽：(1)与在其天然状态伴随其的天然缔合组分不缔合，(2)以自然界中未发
group(gcg),university of wisconsin biotechnology center,910university avenue,madison,wis.53705。蛋白分析软件使用分配给各种取代、缺失和其他修饰(包括保守性氨基酸取代)的同源性的量度来匹配相似序列。例如，gcg含有诸如“gap”和“bestfit”的程序，它们可以用默认参数用于确定紧密相关多肽(例如来自于生物体的不同物种的同源多肽)之间或野生型蛋白与其突变蛋白之间的序列同源性或序列同一性。参见例如，gcg第6.1版。
[0086]
当将特定多肽序列与含有来自不同生物体的大量序列的数据库进行比较时，一种有用算法为计算机程序blast(altschul等人,j.mol.biol.215:403-410(1990)；gish和states,nature genet.3:266-272(1993)；madden等人,meth.enzymol.266:131-141(1996)；altschul等人,nucleic acids res.25:3389-3402(1997)；zhang和madden,genome res.7:649-656(1997))，尤其为blastp或tblastn(altschul等人,nucleic acids res.25:3389-3402(1997))。
[0087]
blastp的优选参数为：期望值：10(默认)；过滤器：seg(默认)；空位开口成本(cost to open a gap)：11(默认)；空位延伸成本(cost to open a gap)：1(默认)；最高比对：100(默认)；字长：11(默认)；描述数(no.of descriptions)：100(默认)；罚分矩阵：blowsum62。
[0088]
blastp的优选参数为：期望值：10(默认)；过滤器：seg(默认)；空位开口成本(cost to open a gap)：11(默认)；空位延伸成本(cost to open a gap)：1(默认)；最高比对：100(默认)；字长：11(默认)；描述数(no.of descriptions)：100(默认)；罚分矩阵：blowsum62。针对同源性进行比较的多肽序列的长度通常将为至少约16个氨基酸残基，通常至少约20个残基，更通常至少约24个残基，通常至少约28个残基，且优选地多于约35个残基。当搜索含有来自大量不同生物体的序列的数据库时，比较氨基酸序列是优选的。使用氨基酸序列进行的数据库搜索可通过本领域中已知的除blastp以外的算法进行测量。例如，可以使用fasta(gcg第6.1版中的程序)对多肽序列进行比较。fasta提供在查询序列与搜索序列之间最佳重迭区域的比对和序列同一性百分比。pearson,methods enzymol.183:63-98(1990)(以引用的方式并入本文)。例如，氨基酸序列之间的序列同一性百分比可以使用如gcg第6.1版(以引入的方式并入本文)中提供的fasta以其默认参数(字长为2，pam250评分矩阵)来确定。
[0089]
在整个说明书和权利要求中，词语“包含(comprise)”或变型诸如“包含(comprises)”或“包含(comprising)”将理解为暗示包括所陈述整数或整数组，但不排除任何其他整数或整数组。
[0090]
如本文所用，术语“玻璃化转变”是指物质或组合物从硬质、刚性或“玻璃质”状态转变成更柔韧、“似橡胶的”或“粘性”状态。
[0091]
如本文所用，术语“玻璃化转变温度”是指物质或组合物经历玻璃化转变的温度。
[0092]
如本文所用，术语“熔体转变”是指物质或组合物从似橡胶的状态转变成较无序的液相或可流动状态。
[0093]
如本文所用，术语“熔化温度”是指物质经历熔体转变的温度范围。
[0094]
如本文所用，术语“增塑剂”是指与多肽序列相互作用以预防多肽序列形成三级结构和键并且/或者增加多肽序列的迁移率的任何分子。
[0095]
如本文所用，术语“可流动状态”是指组合物具有大致上与液体相同的特性(即，从似橡胶的状态转变成更液体状态)。
[0096]
虽然下文描述了示例性方法和材料，但与本文描述的方法和材料类似或等同的方法和材料也可在本发明的实践中使用，并且对于本领域的技术人员而言将为显而易见的。本文提及的所有出版物和其他参考文献均以引用的方式整体并入本文。在出现冲突的情况下，将以包括定义在内的本说明书为准。材料、方法和实施例仅具有说明性而不意图具有限制性。
[0097]
重组丝蛋白
[0098]
本公开描述了本发明的实施方案，包括由合成蛋白共聚物(即重组多肽)合成的纤维。合适的蛋白共聚物讨论于2016年8月45日公开的美国专利公开号2016/0222174、2018年4月26日公开的美国专利公开号2018/0111970和2018年3月1日公开的美国专利公开号2018/0057548中，所述公开各自以引用的方式整体并入本文。
[0099]
在一些实施方案中，合成蛋白共聚物由丝状多肽序列制成。在一些实施方案中，丝状多肽序列为1)通过混合和匹配来源于丝多肽序列的重复结构域生成的嵌段共聚物多肽组合物，和/或2)具有足够大尺寸(约40kda)以通过自工业可放大微生物分泌来形成有用模制体的嵌段共聚物多肽的重组表达。由丝重复结构域片段工程化的大(约40kda至约100kda)嵌段共聚物多肽(包括来自蜘蛛丝多肽的几乎所有公开的氨基酸序列的序列)可在本文所述的修饰微生物中表达。在一些实施方案中，丝多肽序列被匹配且设计来生产能够形成模制体的高度表达且分泌的多肽。
[0100]
在一些实施方案中，嵌段共聚物由跨越丝多肽序列空间的丝多肽结构域的组合混合物工程化。在一些实施方案中，嵌段共聚物通过在可扩大生物体(例如，酵母、真菌和革兰氏阳性细菌)中表达且分泌来制成。在一些实施方案中，嵌段共聚物多肽包含0个或更多个n末端结构域(ntd)、1个或更多个重复结构域(rep)以及0个或更多个c末端结构域(ctd)。在实施方案的一些方面中，嵌段共聚物多肽为单一多肽链的》100个氨基酸。在一些实施方案中，嵌段共聚物多肽包含与国际公开号wo/2015/042164，“methods and compositions for synthesizing improved silk fibers”(其以引用的方式整体并入)中公开的嵌段共聚物多肽序列具有至少80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％同一性的结构域。
[0101]
已鉴定若干种类型的天然蜘蛛丝。据信，每种天然纺丝类型的力学性质与所述丝的分子组成紧密相关。参见例如，garb,j.e.等人,untangling spider silk evolution with spidroin terminal domains,bmc evol.biol.,10:243(2010)；bittencourt,d.等人,protein families,natural history and biotechnological aspects of spider silk,genet.mol.res.,11:3(2012)；rising,a.等人,spider silk proteins:recent advances in recombinant production,structure-function relationships and biomedical applications,cell.mol.life sci.,68:2,第169-184页(2011)；以及humenik,m.等人,spider silk:understanding the structure-function relationship of a natural fiber,prog.mol.biol.transl.sci.,103,第131-85页(2011)。例如：
[0102]
葡萄状腺(acsp)丝倾向于具有高韧性，这是适当高强度与适当高延展性结合的结果。acsp丝的特征在于大嵌段(“整体重复”)尺寸，其常常掺有聚丝氨酸和gpx的基序。管状腺(tusp或圆柱形)丝倾向于具有大直径，具有适度强度和高延展性。tusp丝之特征在于其聚丝氨酸和聚苏氨酸含量，以及聚丙氨酸短束。大壶状腺(masp)丝倾向于具有高强度和适
度延展性。masp丝可为两个亚型之一：masp1和masp2。masp1丝的延展性通常小于masp2丝，且特征在于聚丙氨酸、gx和ggx基序。masp2丝的特征在于聚丙氨酸、ggx和gpx基序。小壶状腺(misp)丝倾向于具有适度强度和适度延展性。misp丝的特征在于ggx、ga和poly a基序，且常常含有约100个氨基酸的间隔元件。鞭毛腺(flag)丝倾向于具有极高延展性和适度强度。flag丝的特征通常在于gpg、ggx和短间隔基序。
[0103]
每种丝类型的性质可因物种不同而不同，且具有不同生活方式(例如，定居纺足目(sedentary web spinner)对比漫游猎蛛(vagabond hunter))或进化上更古老的蜘蛛可产生性质与前文描述不同的丝(关于蜘蛛多样性和分类的描述，参见hormiga,g.和griswold,c.e.,systematics,phylogeny,and evolution of orb-weaving spiders,annu.rev.entomol.59,第487-512页(2014)；以及blackedge,t.a.等人,reconstructing web evolution and spider diversification in the molecular era,proc.natl.acad.sci.u.s.a.,106:13,第5229-5234页(2009))。然而，与天然丝蛋白的重复结构域具有序列相似性和/或氨基酸组成相似性的合成嵌段共聚物多肽，可以用于按商业规模生产具有重现由天然丝多肽制成的对应模制体的性质的一致性模制体。
[0104]
在一些实施方案中，可以通过在genbank中搜索相关术语，例如“蛛丝蛋白(spidroin)”、“丝心蛋白(fibroin)”、“masp”来汇编假定丝序列的列表，且可以将那些序列与通过独立测序工作获得的额外序列汇集在一起。然后将序列翻译成氨基酸，过滤重复条目，且手动拆分成各结构域(ntd、rep、ctd)。在一些实施方案中，候选氨基酸序列被反向翻译成被最优化以用于在毕氏(komagataella)酵母中表达的dna序列。将dna序列各自克隆到表达载体中，且将其转化到毕氏酵母中。在一些实施方案中，随后以组合方式组装显示出成功表达和分泌的各种丝结构域，以构筑能够形成模制体的丝分子。
[0105]
丝多肽特征性地由侧接于非重复区域(例如，c末端结构域和n末端结构域)的重复结构域(rep)组成。在一实施方案中，c末端结构域和n末端结构域的长度在75至350个氨基酸之间。重复结构域表现出层次架构，如图1所示。重复结构域包含一系列嵌段(也称为重复单元)。嵌段在整个丝重复结构域中为重复的，有时完美重复，有时不完美重复(构成一个准重复结构域)。嵌段的长度和组成在不同丝类型之间以及在不同物种中有所不同。表1a列出了来自所选物种和丝类型的嵌段序列的实例，以下文献中给出其他实例：rising,a.等人,spider silk proteins:recent advances in recombinant production,structure-function relationships and biomedical applications,cell mol.life sci.,68:2,第169-184页(2011)，以及gatesy,j.等人,extreme diversity,conservation,and convergence of spider silk fibroin sequences,science,291:5513,第2603-2605页(2001)。在一些情况下，嵌段可以按规则模式排列，形成在丝序列的重复结构域中出现多次(通常2至8次)的较大宏观重复体(macro-repeat)。重复结构域或宏观重复体内的重复嵌段，以及重复结构域内的重复宏观重复体，可以由间隔元件分开。在一些实施方案中，嵌段序列包含富含甘氨酸的区域，随后为polya区域。在一些实施方案中，短(约1至10个)氨基酸基序在嵌段内多次出现。出于本发明的目的，可以在不参考环状排列的情况下选择来自不同天然丝多肽的嵌段(即，丝多肽之间在其他方面相似的鉴定嵌段可能因环状排列而不能对齐)。因此，例如，出于本发明的目的，“嵌段”sgagg(seq id no:35)与gsgag(seq id no:36)相同，且与ggsga(seq id no:37)相同；其全部彼此都为环状排列。针对给定丝序列选择
的特定排列可能尤其由方便性(通常以g开始)决定。从ncbi数据库获得的丝序列可以划分为嵌段和非重复区域。
[0106]
表1a：嵌段序列的样品
[0107]
[0108]
[0109]
[0110]
[0111]
[0112][0113]
根据本发明的某些实施方案，来自嵌段和/或宏观重复结构域的纤维形成嵌段共聚物多肽描述于国际公开号wo/2015/042164(以引用的方式并入)中。按照结构域(n末端结构域、重复结构域和c末端结构域)对自蛋白质数据库(例如genbank)或透过从头测序获得
的天然丝序列进行分解。出于合成和组装成纤维或模制体的目的而选择的n末端结构域和c末端结构域序列包括天然氨基酸序列信息和本文所述的其他修饰。重复结构域被分解成重复序列，所述重复序列含有代表性嵌段，所述嵌段根据丝的类型，通常为1至8个，所述嵌段捕获关键性氨基酸信息，同时将编码氨基酸的dna的尺寸减小成容易合成的片段。在一些实施方案中，适当形成的嵌段共聚物多肽包含至少一个含有至少1个重复序列的重复结构域，且视情况侧接n末端结构域和/或c末端结构域。
[0114]
在一些实施方案中，重复结构域包含至少一个重复序列。在一些实施方案中，重复序列为150至300个氨基酸残基。在一些实施方案中，重复序列包含多个嵌段。在一些实施方案中，重复序列包含多个宏观重复体。在一些实施方案中，嵌段或宏观重复体被分割成多个重复序列。
[0115]
在一些实施方案中，重复序列以甘氨酸开始，且不能以苯丙氨酸(f)、酪氨酸(y)、色氨酸(w)、半胱氨酸(c)、组氨酸(h)、天冬酰胺(n)、甲硫氨酸(m)或天冬氨酸(d)结束，以满足dna组装要求。在一些实施方案中，一些重复序列与天然序列相比可以改变。在一些实施方案中，可例如通过向多肽的c末端添加丝氨酸(以避免终止于f、y、w、c、h、n、m或d)来改变重复序列。在一些实施方案中，可通过在不完全嵌段中填充自另一个嵌段的同源序列来修饰重复序列。在一些实施方案中，可通过重排嵌段或宏观重复体的顺序来修饰重复序列。
[0116]
在一些实施方案中，可以选择非重复性n末端结构域和c末端结构域用于合成。在一些实施方案中，n末端结构域可以通过去除，例如，如通过signalp(peterson,t.n.等人,signalp 4.0:discriminating signal peptides from transmembrane regions,nat.methods,8:10,第785-786页(2011)所鉴定的前导信号序列来获得。
[0117]
在一些实施方案中，n末端结构域、重复序列或c末端结构域序列可以来自漏斗网蜘蛛(agelenopsis aperta)、aliatypus gulosus、哥斯大黎加斑马脚(aphonopelma seemanni)、短牙蛛种as217、短牙蛛种as220、十字园蛛(araneus diadematus)、猫脸蜘蛛、大腹圆蛛(araneus ventricosus)、悦目金蛛(argiope amoena)、银色金蛛(argiope argentata)、横纹金蛛(argiope bruennichi)、三带金蛛、atypoides riversi、巴西黄斑粉趾(avicularia juruensis)、加州陷门蛛(bothriocyrtum californicum)、食人魔脸蜘蛛、灰色迪格蛛(diguetia canities)、黑捕鱼蛛、euagrus chisoseus、苗圃网络蜘蛛、乳突棘旗蛛(gasteracantha mammosa)、hypochilus thorelli、kukulcania hibernalis、黑寡妇蜘蛛、megahexura fulva、metepeira grandiosa、金圆网蛛(nephila antipodiana)、棒络新妇蛛、络新妇蛛、马达加斯加新妇(nephila madagascariensis)、斑络新妇(nephila pilipes)、nephilengys cruentata、帕拉威夏双条纹蛛(parawixia bistriata)、绿色猞猁蜘蛛(peucetia viridans)、原始肉食蛛、印度华丽雨林蛛(poecilotheria regalis)、长爪绿色突光蝴蛛或全异妩蛛。
[0118]
在一些实施方案中，丝多肽核苷酸编码序列可以与α交配因子核苷酸编码序列操作性地连接。在一些实施方案中，丝多肽核苷酸编码序列可以与另一种内源或异源分泌信号编码序列操作性地连接。在一些实施方案中，丝多肽核苷酸编码序列可以与3x flag核苷酸编码序列操作性地连接。在一些实施方案中，丝多肽核苷酸编码序列与其他亲和标记诸如6至8个his残基操作性地连接。
[0119]
在一些实施方案中，重组蜘蛛丝多肽基于源自例如来自物种横纹金蛛的masp2的
重组蛛丝蛋白片段序列。在一些实施方案中，合成纤维含有包括两个至二十个重复单元的蛋白分子，其中每个重复单元的分子量大于约20kda。在共聚物的每个重复单元内有超过约60个被组织成许多“准重复单元”的氨基酸残基，通常范围为60至100个氨基酸。在一些实施方案中，本公开中描述的多肽的重复单元与masp2拖丝蛋白序列具有至少95％序列同一性。
[0120]
形成具有良好力学性质的蛋白嵌段共聚物的重复单元可使用一部分丝多肽合成。这些多肽重复单元含有富含丙氨酸的区域和富含甘氨酸的区域，且长度为150个氨基酸或更长。可用作本公开的蛋白嵌段共聚物中的重复序列的一些示例性序列提供于共同拥有的pct公开wo 2015/042164中，其以引用的方式整体并入，且被证实使用毕赤酵母表达系统来表达。
[0121]
在一些实施方案中，蜘蛛丝蛋白包含：出现至少两次的重复单元，所述重复单元包含：多于150个氨基酸残基，且分子量为至少10kda；具有6个或更多个连续氨基酸的富含丙氨酸的区域，其包含至少80％的丙氨酸含量；具有12个或更多个连续氨基酸的富含甘氨酸的区域，其包含至少40％的甘氨酸含量和小于30％的丙氨酸含量；并且其中所述纤维包含至少一种选自由以下组成的组的性质：大于550cn/tex的弹性模量、至少10％的延展性和至少15cn/tex的极限拉伸强度。
[0122]
在一些实施方案中，其中重组蜘蛛丝蛋白包含重复单元，其中每个重复单元与包含2至20个准重复单元的序列具有至少95％序列同一性；每个准重复单元包含{ggy-[gpg-x1]
n1-gps-(a)
n2
}，(seq id no:3)其中对于每个准重复单元；x1独立地选自由sggqq(seq id no:4)、gagqq(seq id no:5)、gqgopy(seq id no:6)、agqq(seq id no:7)和sq组成的组；且n1为4至8，且n2为6至10。重复单元由多个准重复单元组成。
[0123]
在一些实施方案中，3个“长”准重复单元之后为3个“短”准重复单元。如上文所提及，短准重复单元为其中n1＝4或5的那些准重复单元。长准重复单元定义为其中n1＝6、7或8的那些准重复单元。在一些实施方案中，所有短准重复体在重复单元的每个准重复单元内的相同位置处具有相同x1基序。在一些实施方案中，6个准重复单元中不超过3个具有相同x1基序。
[0124]
在额外实施方案中，重复单元由准重复单元组成，所述准重复单元在重复单元内的行中使用相同x1不超过两次。在额外实施方案中，重复单元由准重复单元组成，其中至少1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19或20个准重复单元在重复单元的单个准重复单元中使用相同x1不超过2次。
[0125]
在一些实施方案中，重组蜘蛛丝多肽包含多肽序列seq id no:1(即，18b)。在一些实施方案中，重复单元为包含seq id no:2的多肽。这些序列提供于表1b中：
[0126]
表1b-重组蛋白和重复单元的示例性多肽序列
[0127][0128]
在一些实施方案中，由所述重组蜘蛛丝多肽形成的纤维的结构形成β折叠结构、β转折结构或α螺旋结构。在一些实施方案中，形成的纤维的二级、三级和四级蛋白结构被描述为具有纳米结晶β折叠区域、非晶质β转折区域、非晶质α螺旋区域、嵌入非结晶基质中的随机空间分布的纳米结晶区域或嵌入非结晶基质中的随机取向的纳米结晶区域。虽然不希望受到理论约束，但是蜘蛛丝内蛋白质的结构性质理论上与纤维力学性质相关。纤维中的结晶区域已与纤维的拉伸强度相关，而非晶质区域已与纤维的延伸性相关。主壶腹腺(ma)丝倾向于与鞭毛腺丝相比具有更高的强度和更低的延伸性，且同样ma丝与鞭毛腺丝相比具有更高结晶区域体积分数。此外，基于蜘蛛丝蛋白的结晶和非晶质区域的分子动力学的理论模型支持以下判定，结晶区域已与纤维拉伸强度相关，而非晶质区域已与纤维延伸性相关。另外，理论模制支持二级、三级和四级结构对于rpf的力学性质的重要性。例如，随机、平行及串联空间分布的组装和非晶质区域内缠结链之间和非晶质区域与纳米结晶区域之间的相互作用力的强度都影响所得纤维的理论力学性质。
[0129]
在一些实施方案中，丝蛋白的分子量的范围可为20kda至2000kda、或大于20kda、或大于10kda、或大于5kda、或5至400kda、或5至300kda、或5至200kda、或5至100kda、或5至50kda、或5至500kda、或5至1000kda、或5至2000kda、或10至400kda、或10至300kda、或10至200kda、或10至100kda、或10至50kda、或10至500kda、或10至1000kda、或10至2000kda、或20至400kda、或20至300kda、或20至200kda、或40至300kda、或40至500kda、或20至100kda、或20至50kda、或20至500kda、或20至1000kda、或20至2000kda。
[0130]
重组蜘蛛丝多肽粉末纯度和降解的表征
[0131]
基于由蛋白形成的二级结构和三级结构的强度和稳定性，不同重组蜘蛛丝多肽具有不同生理化学性质诸如熔化温度和玻璃化转变温度。丝多肽形成单体形式的β折叠结构。在其他单体存在下，丝多肽形成β折叠结构的三维晶格。β折叠结构与多肽序列的非晶质区
域分离且与其穿插。
[0132]
β折叠结构在高温下极端稳定，β折叠的熔化温度为约257℃，如通过快速扫描量热法测量。参见cebe等人,beating the heat
–
fast scanning melts silk beta sheet crystals,nature scientific reports 3:1130(2013)。由于β折叠结构被认为在高于丝多肽的玻璃化转变温度下保持完整，所以假设在重组丝多肽的玻璃转变温度下可见的结构转化是由于β折叠之间的非晶质区域的迁移率增加。
[0133]
增塑剂通过增加非晶质区域的迁移率且潜在破坏β折叠形成来降低丝蛋白的玻璃化转变温度和熔化温度。出于此目的使用的合适的增塑剂包括但不限于水和多元醇(多元醇类)诸如甘油、三甘油、六甘油和十甘油。其他合适的增塑剂包括但不限于：二甲基异山梨糖醇；己二酸；二甲氨基丙胺和辛酸/癸酸的酰胺；乙酰胺；及其任何组合。
[0134]
由于丝多肽的亲水性部分可结合空气中作为湿度存在的环境水，水将几乎一直存在，结合的环境水可使丝多肽成为可塑。在一些实施方案中，合适的增塑剂可为单独存在或与水或其他增塑剂组合存在的甘油。上文讨论了其他合适的增塑剂。
[0135]
另外，在重组蜘蛛丝多肽通过发酵产生且作为重组蜘蛛丝多肽粉末自其回收的情况下，在重组蜘蛛丝多肽粉末中可能存在用作增塑剂或以其他方式抑制三级结构形成的杂质。例如，残余脂质和糖可充当增塑剂且因此通过干预三级结构的形成来影响蛋白的玻璃化转变温度。
[0136]
各种良好确立的方法可用于评估重组蜘蛛丝多肽粉末或组合物的纯度和相对组成。尺寸排阻色谱法基于分子的相对尺寸分离每个分子且可用于分析全长聚合物和单体形成的重组蜘蛛丝多肽的相对量以及重组蜘蛛丝多肽粉末中高分子量、低分子量和中等分子量杂质的量。类似地，快速高效液相色谱法可用于测量溶液中存在的各种化合物，诸如单体形式的重组蜘蛛丝多肽。离子交换液相色谱法可用于评估各种痕量分子在溶液中的浓度，包括杂质诸如脂质和糖。各种分子的其他色谱和量化方法诸如质谱法为本领域中良好确立的。
[0137]
根据实施方案，重组蜘蛛丝多肽可具有基于呈单体形式的重组蜘蛛丝多肽相对于重组蜘蛛丝多肽粉末的其他组分按重量计的量来计算的纯度。在各种情况下，根据重组蜘蛛丝多肽的类型和用于回收、分离且后加工重组蜘蛛丝多肽粉末的技术，纯度的范围可为50重量％至90重量％。
[0138]
尺寸排阻色谱法和反相高效液相色谱法可用于测量全长重组蜘蛛丝多肽，这使得其成为用于通过比较组合物中的全长蜘蛛丝多肽在加工之前和之后的量来确定加工步骤是否降解重组蜘蛛丝多肽的有用技术。在本发明的各种实施方案中，在处理之前和之后存在于组合物中的全长重组蜘蛛丝多肽的量可经历最小降解。降解量的范围可为0.001重量％至10重量％、或0.01重量％至6重量％，例如小于10重量％或8重量％或6重量％、或小于5重量％、小于3重量％或小于1重量％。
[0139]
测量玻璃化转变温度(tg)、二级和三级结构
[0140]
在一些实施方案中，使用差示扫描量热法确定重组蜘蛛丝多肽和/或含有所述重组蜘蛛丝多肽的纤维的玻璃化转变和/或熔化转变温度。在具体实施方案中，使用调节的差示扫描量热法测量玻璃化转变和/或熔化转变温度。
[0141]
根据重组蜘蛛丝多肽的实施方案和类型，玻璃化转变和/或熔化转变温度可具有
各种值范围。然而，测量的玻璃化转变和/或熔化转变温度远低于通常对于呈固体形式的重组蜘蛛丝多肽观测到的温度，这可指示杂质或其他增塑剂的存在。
[0142]
另外，傅里叶变换红外(ftir)光谱术数据可与流变学数据组合以提供重组丝粉末和/或含有所述重组丝粉末的组合物中的三级结构的直接表征。ftir可用于定量丝多肽和/或包含丝多肽的组合物中的二级结构，如下文题为“傅里叶变换红外(ftir)光谱术”之部分中所讨论。
[0143]
根据所述实施方案，ftir可用于定量存在于重组蜘蛛丝多肽粉末和/或含有所述重组蜘蛛丝多肽粉末的组合物中的β折叠结构。另外，在一些实施方案中，ftir可用于定量存在于重组蜘蛛丝多肽粉末中的杂质诸如糖和脂质。然而，不同蛋白预加工方法中所用的各种离液剂和增溶剂可减少重组蜘蛛丝多肽粉末或含有所述重组蜘蛛丝多肽粉末的组合物中的三级结构的数目。因此，在将重组蜘蛛丝多肽粉末模制或纺丝成纤维之前和之后，重组蜘蛛丝多肽粉末中的β折叠结构的量之间可无对应性。类似地，在将其模制或纺丝成纤维之前和之后，粉末的玻璃化转变温度之间几乎无对应性。
[0144]
傅里叶变换红外(ftir)光谱可用于评估存在于多肽粉末和/或纤维中的蛋白的三级结构。具体地，ftir光谱可用于确定存在于纤维中的β折叠的量，所述纤维经历不同纺丝和后加工条件。因此，ftir光谱可用于基于不同技术确定β折叠结构的相对量。或者，ftir光谱可与天然昆虫丝相比较。
[0145]
根据实施方案，在不同波数下的ftir光谱可用于评估存在于纤维中的不同三级结构。在各种实施方案中，对应于酰胺i和酰胺ii条带的波数可用于评估各种蛋白结构，诸如转折、β折叠、α螺旋和侧链。对应于所述结构的波数为本领域中众所周知的。
[0146]
在大部分实施方案中，在对应于β折叠的波数下的ftir光谱将用于评估多肽粉末和/或纤维中的β折叠结构的量。在具体实施方案中，在982-949cm-1
(ch2摇摆振动(a)n)、1695-1690cm-1
(酰胺i)、1620-1625cm-1
(酰胺i)、1440-1445cm-1
(不对称ch3弯曲)和/或1508cm-1
(酰胺ii)下的ftir光谱用于确定所存在的β折叠的量。根据实施方案，可测量不同波数和范围以确定所存在的β折叠的量。在一些实施方案中，使用在982-949cm-1
下的ftir光谱以便消除来自对应峰的干扰。获得所述波数下的光谱的示例性方法详细讨论于boudet-audet等人,identification and classification of silks using infrared spectroscopy,journal of experimental biology,218:3138-3149(2015)，其整体以引用的方式并入本文。
[0147]
类似地，各种表征重组丝粉末中的杂质的方法可与流变学和/或ftir数据组合，以分析杂质的存在与二级结构和/或三级结构的形成之间的关系。
[0148]
重组蜘蛛丝熔体组合物
[0149]
本发明的目标在于根据本文所述的方法制成能够转化成熔化或可流动状态(即，能够转化成重组蜘蛛丝熔体组合物)的各种重组蜘蛛丝组合物。在各种实施方案中，组合物中重组蜘蛛丝多肽粉末和增塑剂的浓度可基于重组蜘蛛丝多肽粉末的性质(例如，重组蜘蛛丝多肽粉末的纯度)、所用增塑剂的类型和所需的纤维性质来改变。在一些实施方案中，浓度可基于流变学数据诸如来自毛细管流变仪的数据来调节。
[0150]
根据实施方案，重组蜘蛛丝组合物中重组蜘蛛丝多肽粉末按重量计的合适浓度的范围为：1至25重量％、1至30重量％、至70重量％、10至60重量％、15至50重量％、18至45重
量％或20至41重量％。
[0151]
在将甘油用作增塑剂的情况下，重组蜘蛛丝组合物中甘油按重量计的合适浓度的范围为：1至90重量％、10至90重量％、10至50重量％、10至40重量％、15至40重量％、10至30重量％或15至30重量％。
[0152]
在将水用作增塑剂的情况下，重组蜘蛛丝组合物中水按重量计的合适的浓度的范围为：5至80重量％、15至70重量％、20至60重量％、25至50重量％、19至43重量％或19至27重量％。在将水与另一种增塑剂组合使用时，其可存在的范围为5至50重量％、15至43重量％或19至27重量％。
[0153]
在一些实施方案中，水可根据所使用的处理和/或模头尺寸在挤出机和/或冷却过程期间蒸发。在一些实施方案中，基于总水量，模制后的失水量的范围可为1至50重量％、3至40重量％、5至30重量％、7至20重量％、8至18重量％或10至15重量％。通常损失将小于15％，在一些情况下小于10％，例如1至10重量％。蒸发可为故意的或由于所施加的处理。蒸发程度可容易例如通过选择操作温度、流速和所施加的压力来控制，如本领域中将理解的。
[0154]
在一些实施方案中，合适的增塑剂可包括多元醇(例如，甘油)、水、乳酸、抗坏血酸、磷酸、乙二醇、丙二醇、三乙醇胺、酸性乙酸酯(acid acetate)、丙-1,3-二醇或其任何组合。
[0155]
在各种实施方案中，增塑剂的量可根据重组蜘蛛丝多肽粉末的纯度和相对组成而有所变化。例如，较高纯度粉末可具有较少杂质，诸如可用作增塑剂的低分子量化合物，且因此要求添加更高重量百分比的增塑剂。
[0156]
不意图受理论限制，在本发明的各种实施方案中，诱导重组蜘蛛丝组合物转变成可流动状态(例如，诱导重组蜘蛛丝熔体组合物)在包括单体形式的重组蜘蛛丝多肽为有利的情况下可用作任何制剂中的预加工步骤。更具体地，诱导重组蜘蛛丝熔体组合物可在期望预防单体重组蜘蛛丝多肽聚集成其结晶聚合形式或期望在加工后期阶段控制重组蜘蛛丝多肽转变成其结晶聚合物形式的应用中使用。
[0157]
根据本发明的一些实施方案，重组蜘蛛丝组合物透过施加剪力和/或压力(通常为两者)转化成熔化或可流动状态。用于生成剪力和压力的组合的合适装置包括但不限于：单螺杆挤出机、双螺杆挤出机、熔体流挤出机和毛细管流变仪。
[0158]
在一些实施方案中，使用双螺杆挤出机来提供必需压力和剪力以将重组蜘蛛丝组合物转化成熔化或可流动组合物。在一些实施方案中，双螺杆挤出机被配置成提供以下范围的剪力：1.5牛顿米(nm)至13牛顿米、2牛顿米至10牛顿米、2牛顿米至8牛顿米或2牛顿米至6牛顿米。在一些实施方案中，由双螺杆挤出机提供的剪力部分取决于双螺杆挤出机的每分钟转数。在各种实施方案和配置中，双螺杆挤出机的每分钟转数(rpm)的范围可为10rpm至1,000rpm。在各种实施方案中，双螺杆挤出机被配置成提供范围为1mpa至300mpa的压力以及剪力。
[0159]
在任选的实施方案中，双螺杆挤出机被配置成在将重组蜘蛛丝组合物转化成重组蜘蛛丝熔体组合物之前和/或之后将热施加至重组蜘蛛丝组合物。在一些实施方案中，双螺杆挤出机的筒(即，双螺杆将组合物混合的圆筒)经历加热。在其他实施方案中，双螺杆挤出机的邻近喷丝头(即，挤出重组蜘蛛丝熔体组合物所通过的喷丝孔)的部分经历加热。替代地，不施加热，熔体/可流动状态整体透过双螺杆挤出机中由施加至重组蜘蛛丝组合物的剪
切力所生成的热诱导。例如，在一些实施方案中，获得熔体/可流动状态所施加的热的量将类似于等于周围室温(例如，约大于20℃)。
[0160]
在各种实施方案中，将使加热重组蜘蛛丝熔体组合物的温度最小化，以便最小化或完整预防重组蜘蛛丝多肽的降解。在具体实施方案中，将重组蜘蛛丝熔体加热至低于120℃、低于100℃、低于80℃、低于60℃、低于40℃或低于20℃的温度。在加工期间，熔体的温度常常在10℃至120℃、10℃至100℃、15℃至80℃、15℃至60℃、18℃至40℃或20
±
2℃的范围内。
[0161]
在其他实施方案中，其他装置可用于提供将重组蜘蛛丝组合物转化成熔化或可流动状态所必需的压力和剪力。如上文所讨论，还可使用毛细管流变仪来提供将重组蜘蛛丝组合物转化成可流动或熔化状态所必需的剪力和压力。
[0162]
在一些实施方案中，在重组蜘蛛丝组合物呈熔化或可流动状态之后和/或在挤出熔化或可流动重组蜘蛛丝熔体组合物之前，任选地加热重组蜘蛛丝组合物。在需要加热时，可能因为重组蜘蛛丝组合物具有高玻璃化转变温度，所以用于提供剪力和压力以将重组蜘蛛丝组合物转化成熔化或可流动状态之的装置可直接或间接偶接至加热的挤出装置。在具体实施方案中，双螺杆挤出机被偶接(直接或间接)至加热的挤出装置。根据加热的挤出装置的实施方案和配置，加热的挤出装置可维持在以下范围的温度下：20至120℃、80至110℃、85至100℃、85至95℃和/或90至95℃。
[0163]
挤出的重组蜘蛛丝熔体组合物在本文中称为“重组蜘蛛丝挤出物”。根据重组蜘蛛丝挤出物的应用，挤出挤出物的喷丝头的直径可有所变化。例如，在将重组蜘蛛丝挤出物挤出到模具中以形成模制制品的实施方案中，喷丝头的直径可大于200mm、大于150mm、大于100mm、大于50mm，例如范围为100mm至500mm、150mm至400mm或200mm至300mm。如下文所论述，在一些实施方案中，重组蜘蛛丝挤出物可被加工成粒料，所述粒料可通过使所述粒料再次经历足以将蜘蛛丝挤出物转化成重组蜘蛛丝熔体组合物的剪力和压力来重新加工。在重组蜘蛛丝挤出物被加工成粒料的实施方案中，喷丝头的直径可大于2mm、大于1.5mm或大于1mm，例如直径的范围可为1mm至5mm、1.5mm至4mm或2mm至3mm。
[0164]
在本发明的大部分实施方案中，重组蜘蛛丝熔体组合物和重组蜘蛛丝挤出物将为大致上均匀的，意指如例如通过重悬浮挤出物的光学显微镜或uv/vis所检查，材料不具有任何包含物或沉淀物。在一些实施方案中，可使用光学显微镜来测量双折射率，其可用作将重组蜘蛛丝对齐到三维晶格中的替代物。双折射率为折射率取决于光的偏振和传播的材料的光学性质。具体地，如通过双折射率测量的高轴向有序度可与高拉伸强度相关。在一些实施方案中，重组蜘蛛丝熔体挤出物将具有最小双折射率。
[0165]
根据本发明，均匀的可流动状态可透过仅施加剪力和压力来诱导，但是任选地可施加热。在未施加热或在任选的热的情况下，已发现单独剪力和压力的组合提供在重组蜘蛛丝熔体组合物和重组蜘蛛丝挤出物中的重组蜘蛛丝多肽的加工期间并未降解的组合物。这是期望且有利的，因为在挤出物组合物中保留全长重组蜘蛛丝多肽产生最优化材料性质，诸如结晶度，从而产生更高品质产品。在本发明的实施方案中，自施加剪力和压力(以及视情况地热)实现的重组蜘蛛丝熔体挤出物具有最小或可忽略的降解。
[0166]
重组蜘蛛丝多肽的降解量可使用各种技术测量。如上文所讨论，重组蜘蛛丝多肽的降解量可使用尺寸排阻色谱法测量以测量所存在的全长重组蜘蛛丝多肽的量。在各种实
施方案中，在组合物形成为模制体之后，组合物以小于6.0重量％的量降解。在另一实施方案中，在模制之后，组合物以小于4.0重量％、小于3.0重量％、小于2.0重量％或小于1.0重量％的量降解(使得降解量的范围可为0.001重量％至10重量％、8重量％、6重量％、4重量％、3重量％、2重量％、或1重量％，或0.01重量％至6重量％、4重量％、3重量％、2重量％或1重量％)。在另一实施方案中，挤出物和/或熔体组合物中的重组蜘蛛丝蛋白大致上不降解。
[0167]
将挤出物配混成化妆品制剂
[0168]
在各种实施方案中，重组蜘蛛丝挤出物将被配混成蜘蛛丝化妆品或护肤品产品(例如，应用于皮肤或头发的溶液)。具体地，重组蜘蛛丝熔体组合物可用作化妆产品或护肤产品的基料，在所述产品中，重组蜘蛛丝多肽以单体或少结晶的形式存在于基料中。不意图受理论限制，在诸如甘油的增塑剂的存在下使重组蜘蛛丝多肽经历剪切力和压力使重组蜘蛛丝多肽变成其中重组蜘蛛丝多肽展开且与甘油形成相互作用的“开放形式重组蜘蛛丝多肽”。由于与甘油的相互作用，这种“开放形式重组蜘蛛丝多肽”形成较少的分子间和分子内β-折叠相互作用。具体地，防止了开放形式重组蜘蛛丝多肽形成分子间相互作用以形成不可逆的三维晶格。
[0169]
不期望受理论的限制，在护肤品制剂中配混开放式(open-form)重组蜘蛛丝多肽实现了重组蜘蛛丝多肽在与皮肤接触之后或通过各种其他化学反应而受控制地聚集成其结晶聚合物形式。类似地，使开放式重组蜘蛛丝多肽维持其较少结晶形式可以通过防止蜘蛛丝多肽的自聚集来增加重组蜘蛛丝多肽在化妆品或护肤品产品中的稳定性。如下文所述，在各种实施方案中，重组蜘蛛丝挤出物可以形成半固体或凝胶样结构，其可在相对低的熔化温度(tm)下分散。在将重组蜘蛛丝挤出物配混成护肤品制剂的各种实施方案中，重组蜘蛛丝挤出物可以形成可逆的三维结构，诸如凝胶或膜，其在皮肤表面上熔化成可分散的液体。
[0170]
在各种实施方案中，重组蜘蛛丝挤出物可悬浮在水中(“水性悬浮挤出物”)，以形成凝胶或基料，其可掺入(即，配混)在化妆品或护肤品制剂中。根据实施方案，水性悬浮挤出物中重组蜘蛛丝挤出物对水的量可以是变化的，如同重组蜘蛛丝挤出物中重组蜘蛛丝多肽粉末与甘油的相对比率那样。在一些实施方案中，挤出物组合将包含10-33重量％重组丝多肽粉末和67-90重量％甘油。在一些实施方案中，将使用不同于甘油的增塑剂。在一些实施方案中，将重组蜘蛛丝挤出物悬浮在水中，以得到水性悬浮挤出物，其为1-40％重组蜘蛛丝挤出物和60-99％水。在一个具体的实施方案中，将挤出物组合物悬浮在水中，以得到水性悬浮挤出物，其为10重量％重组丝多肽粉末、30重量％甘油和60重量％水。在一个具体的实施方案中，将挤出物悬浮在水中，以得到水性悬浮挤出物，其为6重量％重组丝多肽粉末、18重量％甘油和76重量％水。
[0171]
根据实施方案，可以在将水性悬浮挤出物重悬浮在水中时任选地进行加热和搅拌。在一些实施方案中，加热和搅拌水性悬浮挤出物可导致水性悬浮挤出物中重组蜘蛛丝多肽的相转化。具体地，加热和搅拌水性悬浮挤出物导致三个不同的相，其通过离心进行评估：1)离心后与上清液不同的凝胶相；2)离心后可从上清液中过滤出的胶态相；以及3)从上清液中过滤出胶态相后留下的溶液相。可以使用加热、搅拌和离心的各种组合，前提是不能使水性悬浮挤出物长时间受热，以防止重组蜘蛛丝多肽的降解。在一个具体的实施方案中，
将挤出物在90℃下温和搅拌5分钟并在16,000rcf下离心30分钟。
[0172]
在一些实施方案中，可以将水性悬浮挤出物的各种相(即，胶态相、凝胶相和溶液)或水性悬浮挤出物掺入化妆品或护肤品制剂中，以提供开放式重组蜘蛛丝蛋白的来源。根据实施方案，在掺入到护肤品制剂中之前，可以将水性悬浮挤出物在加热或不加热的情况下进行搅拌。任选地，可以通过离心和/或过滤将水性悬浮挤出物分离成上文所讨论的各相。根据实施方案，护肤品制剂可以是乳液(例如，霜膏或精华素)或主要是水性的溶液(例如，凝胶)。在某些实施方案中，可以将重组蜘蛛丝挤出物掺入到上文所讨论的任何化妆品或护肤品制剂中，而无需水性重悬浮。在这些组合物中，可使用匀化器或类似设备，以确保重组蜘蛛丝挤出物在组合物中均匀分布。
[0173]
在一些实施方案中，胶体相(即，胶体悬浮液)包含有包含重组蜘蛛丝蛋白的各种大小的颗粒。在一些实施方案中，颗粒大小的直径范围为1nm至10,000nm、10nm至5,000nm或20nm至3000nm。在一些实施方案中，胶体悬浮液中大多数颗粒在50nm至2,000nm的范围内。在一些实施方案中，胶体悬浮液的平均颗粒直径为约350nm。在一些实施方案中，平均颗粒直径为300nm至400nm、200nm至500nm或100nm至1,000nm。在一些实施方案中，如通过malvern仪器zetasizer nano所测量，胶体悬浮液的多分散指数为约0.5。在一些实施方案中，多分散指数为0.4至0.6、0.3至0.7、0.2至0.8或0.1至1.0。在一些实施方案中，多分散指数大于0.05、大于0.1、大于0.2、大于0.3或大于0.4。在一些实施方案中，胶体悬浮液中的颗粒分布包括两个或更多个峰。
[0174]
在一些实施方案中，可以对水性悬浮挤出物进行加热和搅拌，然后将其浇注到平坦表面上并干燥成膜。在一些实施方案中，可以将水性悬浮挤出物掺入到乳液中，然后将其浇注到平坦表面上并干燥成膜。根据实施方案，可以使用各种不同的干燥条件。合适的干燥条件包括在60℃、真空或非真空下干燥。在使用真空的实施方案中，15hg是合适的真空量。其他干燥方法在本领域中是公认的。
[0175]
在各种实施方案中，包含单独水性悬浮挤出物和在乳液中的膜都具有低熔化温度。在各种实施方案中，包含单独水性悬浮挤出物和在乳液中的膜的熔化温度低于体温(约34-36℃)并且在接触皮肤时熔化。在期望受理论的限制，开放式重组蜘蛛丝多肽形成足以制成半固体结构(即，膜)的分子间相互作用，然而此结构在接触皮肤时是可逆的并且可以在皮肤上分散后重新形成。如下文所讨论，重组蜘蛛丝多肽粉末和甘油的浆液，然后悬浮在水性溶液中，在干燥后不形成膜，而是形成与悬浮之前相同的浆液。在各种实施方案中，如通过ftir所测量，与重组蜘蛛丝多肽粉末或重组蜘蛛丝挤出物相比，膜的结晶度降低。
[0176]
在另一具体的实施方案中，可以将水性悬浮挤出物或挤出物掺入(例如，匀化)成乳液，然后将其浇注到平坦表面上并冻干，以得到多孔膜。根据实施方案，可以使用各种技术进行冻干，包括在-80℃下将膜冷冻30分钟。其他冻干技术对于本领域的技术人员来说是众所周知的。在各种实施方案中，包含单独水性悬浮挤出物和在乳液中的冻干多孔膜的熔化温度低于体温(约34-36℃)并且在接触皮肤时熔化。
[0177]
在各种实施方案中，上述膜可用作外用护肤剂。这种膜可以直接应用至皮肤并且可以重新水化，以形成结合到皮肤中的可分散粘性物质。如下文所讨论，可以将各种润肤剂、保湿剂、活性剂和其他化妆品助剂掺入膜中。这种膜可以直接应用至皮肤并且由于与皮肤接触或在将面膜轻轻揉搓到皮肤中之后吸附至皮肤。在一些实施方案中，可以将重悬浮
在水性溶液中的挤出物应用至面部，然后经由雾暴露至凝结剂(诸如丙二醇)，以形成可胶凝的面膜。
[0178]
根据实施方案，浇注的膜可以是平坦膜(即，不具有表面变化性)，可以浇注在并入微结构的模具上。在一个具体的实施方案中，将膜浇注在并入微针结构以刺伤皮肤表面并帮助活性剂的递送的模具上。
[0179]
在一个另选的实施方案中，可以将水性悬浮挤出物添加至用作护肤品产品的乳液中。可以将乳液应用至皮肤，然后使其在干燥后在皮肤表面上形成膜。如下文所讨论，可以将各种润肤剂、保湿剂、活性剂和其他化妆品助剂掺入乳液中。
[0180]
构成乳液和膜的组合物
[0181]
上文所讨论的乳液和膜可以含有各种保湿剂、润肤剂、封闭剂、活性剂和化妆品助剂，这取决于实施方案和制剂的所需功效。
[0182]
如本文所用的术语“保湿剂”是指与水分子形成键的吸湿性物质。合适的保湿剂包括但不限于甘油、丙二醇、聚乙二醇、戊二醇、银耳提取物、山梨醇、二氰胺、乳酸钠、透明质酸、芦荟提取物、α-羟基酸和吡咯烷酮羧酸盐(napca)。本文所用的术语“润肤剂”是指通过填补皮肤表面的裂缝而提供皮肤柔软或柔顺外观的化合物。合适的润肤剂包括但不限于乳木果油、可可脂、角鲨烯、角鲨烷、辛酸辛酯、芝麻油、葡萄籽油、含有油酸的天然油(例如，甜杏仁油、摩洛哥坚果油、橄榄油、酪梨油)、含有γ-亚油酸的天然油(例如，月见草油、琉璃苣油)、含有亚油酸的天然油(例如，红花油、葵花油)或其任何组合。术语“封闭剂”是指在皮肤表面形成屏障以保持水分的化合物。在一些情况下，润肤剂或保湿剂可以是封闭剂。其他合适的封闭剂可以包括但不限于蜂蜡、巴西棕榈蜡、神经酰胺、植物蜡、卵磷脂、尿囊素。不受理论的限制，本文呈现的重组蜘蛛丝组合物的成膜能力使其成为形成水分保持屏障的封闭剂，因为重组蜘蛛丝多肽起到吸引水分子的作用，同时还充当保湿剂。
[0183]
在一些实施方案中，本文所述的乳液和膜在皮肤表面上形成屏障，防止/减少受损皮肤的经皮水流失。在一些实施方案中，在皮肤表面应用所述屏障后，如通过蒸气压力计所测量的经皮水流失小于10。在一些实施方案中，与未处理的受损皮肤相比，经皮水流失减少多于25％、多于30％、多于35％、多于40％、多于45％、多于50％、多于55％、多于60％、多于65％、多于70％或多于75％。
[0184]
术语“活性剂”是指在护肤品制剂或防晒剂中具有已知有益效果的任何化合物。各种活性剂可以包括但不限于乙酸(即，维生素c)、α羟基酸、β羟基酸、氧化锌、二氧化钛、视黄醇、烟酰胺、其他重组蛋白(全长序列或水解成亚序列或“肽”)、铜肽、姜黄素类化合物、乙醇酸、氢醌、曲酸、l-抗坏血酸、α硫辛酸、壬二酸、乳酸、阿魏酸、扁桃酸、二甲氨基乙醇(dmae)、白藜芦醇、含有抗氧化剂的天然提取物(例如，绿茶提取物、松树提取物)、咖啡因、α熊果苷、辅酶q-10和水杨酸。术语“化妆品助剂”是指用于得到具有商业上期望的性质的化妆品产品的各种其他剂，包括但不限于表面活性剂、乳化剂、防腐剂和增稠剂。
[0185]
凝结剂
[0186]
在一些实施方案中，将本文所生产的基于丝的组合物暴露于凝结剂。这可以改变组合物的性质，以促进基于丝的组合物中丝的受控聚集。在一些实施方案中，将基于丝的组合物浸没在凝固剂中。在一些实施方案中，将基于丝的组合物暴露于凝固剂雾或蒸气中。在一个实施方案中，水性挤出物组合物包含凝结剂或将其与凝结剂一起浸没或与之混合。在
一些实施方案中，将基于丝的固体或半固体(诸如膜)浸没于或暴露于含有凝结剂的蒸气中。在一些实施方案中，将甲醇用作有效凝结剂。
[0187]
在一些实施方案中，可将醇用作凝结剂，诸如异丙醇、乙醇或甲醇。在一些实施方案中，将60％、70％、80％、90％或100％醇用作凝结剂。在一些实施方案中，可以将盐用作凝结剂，诸如硫酸铵、氯化钠、硫酸钠或其他在20至60℃温度下有效的蛋白质沉淀盐。
[0188]
在一些实施方案中，可将水、酸、溶剂和盐中的一种或多种的组合用作凝结剂，包括但不限于以下几类化学品：布仑斯惕-劳里酸(acid)、路易斯酸、二元氢化物酸、有机酸、金属阳离子酸、有机溶剂、无机溶剂、碱金属盐和碱土金属盐。在一些实施方案中，酸包括稀盐酸、稀硫酸、甲酸或乙酸。在一些实施方案中，溶剂包括乙醇、甲醇、异丙醇、正丁醇、乙酸乙酯、丙二醇或乙二醇。在一些实施方案中，盐包括licl、kc1、bec12、mgc12、cac12、nacl、zncl2、fecl3、硫酸铵、硫酸钠、乙酸钠以及其他硝酸盐、硫酸盐或磷酸盐。在一些实施方案中，凝结剂的ph为2.5至7.5。
[0189]
实施例
[0190]
实施例1：重组18b多肽粉末的纯度
[0191]
通过各种批次大规模发酵产生重组蜘蛛丝，即包含flag标签的18b多肽序列(seq id no:1)，回收且干燥成粉末(“18b粉末”)。使用反相高效液相色谱法(“rp-hplc”)测量粉末中18b多肽单体按重量计的量。使用5m硫氰酸胍(gdscn)试剂溶解样品且将其注入到agilent poroshell 300sb c3 2.1x75mm 5μm管柱中以基于疏水性分离各成分。检测模态为肽键在215nm下的uv吸光度(360nm参考)。18b-flag单体的样品浓度通过与18b-flag粉末标准物相比较来确定，所述18b-flag单体浓度先前已使用尺寸排阻色谱法(sec-hplc)测量
[0192]
发现样品粉末包括57.964质量％的18b单体。
[0193]
实施例2：丝粉末挤出物混合物
[0194]
丝挤出物混合物形成如下：使用家用香料研磨器混合实施例1的重组丝粉末。将一定比率的水和甘油添加到重组丝粉末(“18b粉末”)中，以生成具有不同的蛋白粉末与增塑剂之比的重组蜘蛛丝组合物，如下表2中列出。
[0195]
使用xceptional instruments双螺杆挤出机(tse)(项目编号tt-ze5-msms-3ht)混合下表2中列出的多批10至100克重组蜘蛛丝组合物(即“制剂”)，所述双螺杆挤出机用于所有tse实验。不锈钢(s316)挤出机筒具有3个各自长度为约5cm的加热区。所用螺杆为长度为180mm且直径为9mm的一对标准不锈钢(s316)共旋转螺杆且(l/d比率为20:1)。螺杆的螺距为9mm。
[0196]
对于下文所列出的p49w21g30和p65w20g15制剂，首先将重组蜘蛛丝组合物挤出成粒料，在以下实验中通过重新挤出所述粒料来重新加工所述粒料。为了制成粒料，使用金属漏斗将包含18b/水/甘油混合物的重组蜘蛛丝组合物引入到tse中并使用捣固装置推动其与双螺杆连续接触若干分钟，同时在300rpm下以约90℃至95℃的温度跨越所有三个筒区域(包括起始筒区域、中间筒区域和最后筒区域)运行tse。通过0.5mm模头挤出在熔化状态下(即，作为重组蜘蛛丝熔体组合物)的材料，所述模头的喷丝孔与螺杆轴成180
°
角以形成重组蜘蛛丝挤出物。
[0197]
0.5mm重组蜘蛛丝挤出物以长度约》10米的连续弹性“面条”形式自模头出现。通过将5至10g量的对应挤出物组合物置于厨房香料研磨器中且使其经历5秒脉冲达总计6次脉
冲(总计30秒)来生成粒料。检查所述粒料以确保其长度不超过5mm，其中粒料的平均长度为约2.5mm。
[0198]
对于下文列出的p71w19g10制剂，在实施例2中所述的条件下预先混合18b/水/甘油重组蜘蛛丝混合物(即，未首先挤出为粒料)，以形成重组蜘蛛丝挤出物。
[0199]
表2-按重量计的重组蜘蛛丝制剂组合物
[0200]
制剂18b粉末重量％水重量％甘油重量％p49w21g3049％21％30％p65w20g1565％20％15％p71w19g1071％19％10％
[0201]
实施例3：生成具有微量降解的重组丝挤出物-p49w21g30
[0202]
为了评估在多种不同条件下的降解，使实施例2中所列出的重组蜘蛛丝制剂在挤出期间经历各种温度且经历各种量的压力和剪力。具体地，改变双螺杆挤出粒料的每分钟转数以提供可变量的扭矩和剪力。下文包括用于将重组蜘蛛丝制剂转化成熔体状态且挤出不同样品的各种温度和rpm组合。
[0203]
使表1中列出的p49w21g30和p65w20g15制剂的挤出粒料再次经历在各种rpm和温度下使用xceptional instruments tse进行的挤出。用于操作xceptional instruments tse的其他参数与上文关于实施例2所述的参数相同。
[0204]
如实施例2所述，还在各种rpm和温度下使用xceptional instruments tse挤出p71w19g10制剂。用于操作xceptional instruments tse的其他参数与上文关于实施例2所述的参数相同。
[0205]
使用尺寸排阻色谱法(sec)如下收集表征相对量的高分子量、低分子量和中等分子量杂质、单体18b和聚集物18b的数据：将18b粉末溶解于5m硫氰酸胍中且将其注入到yarra sec-3000sec-hplc管柱中以基于分子量分离各成分。使用折射率作为检测模态。定量18b聚集物、18b单体、低分子量(1-8kda)杂质、中等分子量杂质(8-50kda)和高分子量杂质(110-150kda)。将相关组成报告为质量％和面积％。使用bsa作为普通蛋白标准物，假设所有蛋白的》90％证实在彼此约7％内的dn/dc值(折射率的响应因子)。使用聚(环氧乙烷)作为保留时间标准物，且使用bsa校准物作为检查标准物以确保所述方法的一致性能。
[0206]
下表3至5列出在各种rpm和温度下产生的挤出物的各种sec分析。第五管柱包括在起始粒料和挤出物(p49w21g30和p65w20g15)中报告的18b单体的差异(面积％)和在起始粉末和挤出物(p71w19g10)中报告的18b单体的差异(面积％)。图1至3详细描述于下文中且包括分别对应于表3至5的图表。由所述情况可以看出，在测试的所有温度和rpm下降解最小，指示加工条件的灵活性和对使用挤出方法进行加工的一般稳健性。
[0207]
表3-对于p49w21g30的sec分析
[0208][0209]
表4-对于p65w20g15的sec分析
[0210]
[0211][0212]
表5-对于p71w19g10的sec分析
[0213][0214]
图1示出在20℃、40℃、60℃、80℃、95℃或120℃的挤出条件下以上表3中所列出的p49w21g30样品的sec数据，其中使用10、100、200或300rpm的操作参数获得各温度的挤出物。18b单体(黑色条)、中等分子量杂质(灰色条)和低分子量杂质(交叉阴影线条)示出为面积％。
[0215]
图2示出在20℃、40℃、60℃、95℃或140℃的挤出条件下以上表4中所列出的p65w20g15样品的sec数据，其中使用10、100、200或300rpm的操作参数获得各温度的挤出物。18b单体(黑色条)、中等分子量杂质(灰色条)和低分子量杂质(交叉阴影线条)示出为面积％。
[0216]
图3示出在90℃或120℃的挤出条件下以上表5中所列出的p71w19g10样品的sec数据，其中使用10、100、200或300rpm的操作参数获得各温度的挤出物。18b单体(黑色条)、中等分子量杂质(灰色条)和低分子量杂质(交叉阴影线条)示出为面积％。
[0217]
实施例4：热重分析-p49w21g30
[0218]
为了分析在挤出期间的失水量，通过tga(热重分析)使用ta品牌tga q500仪器分析在挤出前的重组蜘蛛丝组合物和在挤出后的重组蜘蛛丝挤出物的水含量。对于p49w21g30和p65w20g15样品，使用用于实施例3所述的挤出实验的粒料的水含量作为测量失水量的参考样品。对于p71w19g10样品，使用用于实施例3所述的挤出实验的重组蜘蛛丝组合物的水含量作为测量失水量的参考样品。
[0219]
对于每种样品，分析包含上文列出的制剂的10mg+/-1mg粉末或粒料。为了测量水
含量，“在空气中”运行样品，与“在氮气中”相比。使用配备的自动取样器将样品连续引入到tga炉中。使用ta品牌软件程序组将温度编程以便以20℃/分钟的速率从室温开始增加，直至其达到110℃。然后将样品在所述温度下保持45分钟。然后从炉移出样品，且用空气冲洗所述炉15分钟，之后开始下一次运行。
[0220]
以下表6至8列出参考样品(即，起始粒料或粉末)和挤出样品的各种测量值。图4至6包括表6至8中分别包括的数据的图。由这个数据可以看出，在挤出期间失水量较低，且正处于挤出过程的可接受限度内，通常，失水量在2％至18％的范围内。
[0221]
表6-p49w21g30中的失水量
[0222][0223][0224]
表7-p65w20g15中的失水量
[0225][0226]
表8-p71w19g10中的失水量
[0227][0228][0229]
图4示出在20℃、40℃、95℃及120℃的挤出条件下生成的以上表6中列出的样品的tga数据，其中使用10、100、200和300rpm操作参数获得各温度的挤出物。图4还示出用于生成所述样品的起始粒料的参考样品的tga数据。所述数据示出跨越所有处理的样品的水含量％，其中当与起始粒料相比较时失水量的范围为约1％至13％。
[0230]
图5示出在20℃、40℃、60℃和140℃的挤出条件下生成的以上表7中列出的样品的tga数据，其中使用10、100、200和300rpm操作参数获得各温度的挤出物。图5还示出用于生成所述样品的起始粒料的参考样品的tga数据。所述数据示出跨越所有处理的样品的水含量％，其中当与起始粒料相比较时失水量的范围为约1％至8％。
[0231]
图6示出在90℃和120℃的挤出条件下生成的以上表8中列出的样品的tga数据，其中使用10、100、200和300rpm操作参数获得各温度的挤出物。图5还示出用于生成所述样品的起始粉末的参考样品的tga数据。所述数据示出跨越所有处理的样品的水含量％，其中当与起始粉末相比较时失水量的范围为约1.5％至4％。
[0232]
实施例5：使用傅里叶变换红外光谱术进行β折叠含量分析
[0233]
为了评估挤出物中二级结构和三级结构的形成，通过ftir(傅里叶变换红外光谱术)测量β折叠含量。使用配备有钻石衰减总反射附件、后有主要选择s(垂直)偏振光的线栅
偏光镜的bruker alpha光谱仪对挤出物进行ftir。包括重组多肽粉末和前体纤维作为对照。为了定量分子对准，在4000至600cm-1
的4cm-1
分辨率下以32次扫描收集每个取向(相对于极化电场呈0及90
°
)的三光谱。
[0234]
基于以下步骤计算对应于982-949cm-1
的峰的平均值。在无条带的情况下通过减去1900与1800cm-1
之间的平均值来抵消吸光度值。然后通过除去对应于各向同性(未取向)侧链振动条带的1350与1315cm-1
之间的平均值来使光谱归一化。将β折叠含量度量视为982与949cm-1
之间的取积分吸光度值的平均值。
[0235]
将重组蜘蛛丝挤出物的β折叠(即，“样品β折叠”)含量与以下相比较：i)用于生成重组蜘蛛丝组合物的起始重组蜘蛛丝多肽粉末(即，“参考预水合粉末”)中的β折叠含量，以及ii)起始粒料(p49w21g30和p65w20g15)(即，“参考粒料”)中的β折叠含量。以下表9至11列出了参考样品和在下表所列出的条件下产生的挤出物的测量值。图7至9包括表9至11中所示出的数据的图表。如可看出，从起始重组丝多肽粉末至重组蜘蛛丝挤出物的材料的β折叠含量不存在显著改变，指示所述方法能够使非晶质蛋白结构域极化且迁移而不会破坏β折叠，若使用溶剂加工也将为如此情况。
[0236]
表9-p49w21g30中的β折叠形成
[0237][0238]
表10-p65w20g15中的β折叠形成
[0239][0240]
表11-p71w19g10中的β折叠形成
[0241][0242]
图7示出在20℃、40℃、60℃、80℃、95℃或120℃的挤出条件下生成的以上表9中所列出的样品的ftir数据，其中使用10、100、200或300rpm的操作参数获得各温度的挤出物。从949-982求出所述数据且所述数据与起始粒料相比未显示明确趋势。
[0243]
图8示出在20℃、40℃、60℃、95℃或140℃的挤出条件下生成的以上表10中所列出的样品的ftir数据，其中使用10、100、200或300rpm的操作参数获得各温度的挤出物。从949-982条带求出所述数据且所述数据与起始粒料相比未显示明确趋势。
[0244]
图9示出在90℃或120℃的挤出条件下生成的以上表11中所列出的样品的ftir数据，其中使用10、100、200或300rpm的操作参数获得各温度的挤出物。从949-982求出所述数据以避免因水的存在造成的假影，且所述数据与起始粒料相比未显示明确趋势。
[0245]
实施例6：偏振光显微镜-p49w21g30
[0246]
使用偏振光显微镜(pl)检查各种挤出物的光滑度和均匀度。使用leica dm750p偏振光显微镜、使用4x pl物镜获得光和偏振光(pl)图像。将显微镜偶接至互补基于pc的图像分析leica application suite,las v4.9。沿着标准显微镜载玻片的长轴小心放置长约20至30mm的tse挤出物且水平放置于(东西向；即0
°
)显微镜孔上方。最初将样品边缘置于焦点，随后总体聚焦所述样品。最初在白光下查看所述样品，通过照射控制按钮控制，且使用所包括的适当标尺捕获图像。在所有情况下，将las v4.9软件的自动亮度特征关闭。
[0247]
接着，通过将分析器/勃氏镜模块的下臂翻转至右侧(“a”位置/分析器内)来接合所述模块，同时确保将分析器/勃氏镜模块的上臂翻转至左侧(“o”位置/勃氏镜外)。所述设置允许以“交叉偏振模式”进行分析，所述模式为穿过偏光器和分析器的光的被允许振动方向以90
°
取向的光学对齐状态。
[0248]
为了控制光强度值背景波动，最初查看所有样品，且使用照射控制按钮减小背景的亮度，直至其正好达到完全黑暗。然后在图像捕获序列期间用目镜光阻附件覆盖每个目镜以防止周围光穿过。使用las v4.9软件包以0
°
和45
°
取向捕获图像。通过使用此显微镜所配备的圆形旋转台将玻璃侧旋转至45
°
角来获得45
°
图像。
[0249]
图10和图11为使用偏振光显微镜捕获的示例性样品的图像。所述图像显示具有低熔体破裂的平滑纤维可使用所要求的过程获得。因此，条件明确适合于熔体流动和挤出。另外，在许多条件下，观测到定性双折射率，与轴向对齐一样。
[0250]
图10示出由样品p49w21g30-1、p49w21g30-2、p49w21g30-3和p49w21g30-4产生的图片，所有样品都在20℃下以不同rpms产生。在这些条件下，挤出物为具有低熔体破裂的平滑物。偏振光显微镜根据条件(检查45
°
差异)显示优选轴向对齐，其中100rpm产生最大轴向对齐。
[0251]
图11示出由样品p49w21g30-17、p49w21g30-18、p49w21g30-19和p49w21g30-20产生的图片，所有样品都在95℃下以不同rpms产生。挤出物示出适度熔体破裂/表面缺陷。偏振光显微镜检显示轴向对齐从10-100rpm的增加。当在0和45
°
下检查时，从100-300rpm，样品示出彼此类似的差别。
[0252]
实施例7：甘油含量的代谢物分析
[0253]
为了确定在挤出期间从重组蜘蛛丝组合物的甘油损失，使用配备有phenomenex security guard carbo h+保护管柱的benson polymeric 150x7.8mm h+7110-0hplc管柱，使用0.004m硫酸的流动相来分析甘油含量。最初运行甘油校准物以进行定量。为了测量基于18b的样品中的甘油的量，在挤出之前(即呈粒料或粉末)和之后测量存在于组合物中的甘油。对于各样品，将25mg粉末或粒料溶解于1ml 0.004m硫酸中且超声处理1h。然后涡旋所述样品且将其置于hplc小瓶中以用于每个条件/处理的后续运行。
[0254]
下表12至14列出在下文列出的条件下产生的挤出物的各种测量值。图12至图14包括相同样品的图。由所述图可看出，组合物中的甘油含量跨越所测试条件范围为稳定的，如通过测试期间的最小损失证明。
[0255]
表12-挤出物中的甘油损失-p49w21g30
[0256][0257]
表13-挤出物中的甘油损失-p65w20g15
[0258][0259]
[0260]
表14-挤出物中的甘油损失-p71w19g10
[0261][0262]
*异常结果在测试仪器的误差范围内
[0263]
图12示出在20℃、40℃、60℃、80℃、95℃和120℃的挤出条件下生成的以上表12中所列出的样品的代谢物数据，其中使用10、100、200及300rpm的操作参数获得每个温度的挤出物。所有处理中的甘油损失都为可忽略的。
[0264]
图13示出在20℃、40℃、60℃、95℃和140℃的挤出条件下生成的以上表13中所列出的样品的代谢物数据，其中使用10、100、200和300rpm的操作参数获得每个温度的挤出物。所有处理中的甘油损失都为可忽略的。
[0265]
图14示出在90℃和120℃的挤出条件下生成的上表14中所列出的样品的代谢物数据，其中使用10、100、200或300rpm的操作参数获得各温度的挤出物。所有处理中的甘油损失都为可忽略的。
[0266]
实施例8：丝甘油挤出物的显微镜分析
[0267]
为了研究在剪切力和压力下的循环持续时间对挤出物中重组蜘蛛丝形态的影响，将类似于实施例1中所述的重组蜘蛛丝多肽粉末与甘油混合并且在xplore mc 15锥形双螺杆挤出机(xplore tse)中以90℃的温度进行不同持续时间的循环。
[0268]
容重制剂包含10％丝和90％甘油(“10％丝”)；17％丝和83％甘油(“17％丝”)；以及25％丝和75％甘油(“25％丝”)，使其在xplore tse中以90℃进行循环，持续0.5小时、0.5小时和2小时的相应持续时间，并从xplore tse挤出。使用leica 2700m光学显微镜检查所得挤出物的重组蜘蛛丝的形态，以及溶解重组蜘蛛丝、未溶解重组蜘蛛丝和重组蜘蛛丝粉末的一系列视觉参考。图15示出由上述混合物和方法得到的挤出物，以及未溶解粉末参考(即，挤出前甘油和丝粉末的混合物)。如图15所示，基于与形态学参考的比较，10％丝挤出物看起来是未溶解的，但基于与使用已知的未溶解粉末的标准发展的形态学参考比较，17％丝挤出物和25％丝挤出物看起来是溶解的。
[0269]
还将25％丝制剂在xplore tse中以90℃循环30秒、4分钟、5分钟、10分钟、20分钟、0.5小时、1小时和1.5小时，并挤出使用leica 2700m光镜检查各种循环的挤出物的由循环延长所致的任何形态学变化。每种挤出物的光学显微镜检查的图像示于图16。基于光学显微镜检查，没有观察到基于循环延长的形态差异。
[0270]
使用与实施例1的组成类似的不同重组蜘蛛丝蛋白粉末批次的各种25％丝制剂在挤出后使用上文关于实施例3概括的方法分析蛋白质降解。这些结果列于表15中。如表15所示，在90℃循环时观察到最小降解，但降解随着循环持续时间而增加。
[0271]
表15-粉末和挤出物中的18b聚集物和单体
[0272][0273][0274]
评估了蜘蛛丝蛋白挤出物的溶解度随挤出期间循环持续时间的变化。具体地，将25％重组蜘蛛丝多肽粉末和75％的甘油混合物在上述双螺杆挤出机中循环30秒、4分钟、5分钟、10分钟、20分钟、30分钟、60分钟和90分钟。将所产生的每种挤出物重悬浮在80％水和20％挤出物的混合物中并使用光学显微镜进行检查。如图16所示，溶解度随时间推移而增加，但30分钟后不显著增加。
[0275]
实施例9：重组蜘蛛丝挤出物的相分离
[0276]
为了研究重组蜘蛛丝挤出物在水性溶液中的性质，将实施例8中描述的以250rpm循环30分钟的25％重组蜘蛛丝粉末和75％甘油挤出物悬浮在各种体积的去离子水中并在室温(21℃)下于水中通过搅拌轻轻打散。在一些情况下，然后将挤出物和水悬浮液在90℃下加热10分钟，同时搅拌水中的挤出物。图17示出挤出物、重悬浮在水中的挤出物以及在室温或90℃下搅拌后的挤出物如实施例8中所述使用光学显微镜的形态分析。具体地，60％水和40％丝挤出物的容重悬浮液产生了10％重组丝蛋白粉末、30％甘油和60％水的悬浮液。将此悬浮液在室温下轻轻搅拌30分钟或在90℃下轻轻搅拌10分钟。76％水和24％丝挤出物的容重悬浮液产生了6％重组蜘蛛丝蛋白粉末、18％甘油和76％水的悬浮液。将此悬浮液在90℃下搅拌10分钟。
[0277]
加热后，将包含6％蜘蛛丝蛋白粉末、18％甘油和76％水的水性挤出物悬浮液离心，以诱导相分离成3个不同的相：凝胶相、胶体相和溶液相。首先，如图18所示，在室温下以16,000rcf将挤出物和水悬浮液离心30分钟，得到在管底部形成粒料的粘稠凝胶相以及形成不会随时间推移而沉降的不透明上清液的胶态上清液相(包括溶液相和胶态相)。通过在16,000rcf和4℃下将胶态上清相离心30分钟以获得澄清上清液来获得溶液相。将水性挤出物悬浮液、凝胶相、胶体上清液相和溶液相各自使用光学显微镜进行成像。由这些相中的每一个形成了干燥的膜。每个相的宏观视图、光学显微镜下的图像和由每个相得到的干燥的膜的图像示于图18。
[0278]
实施例10：成膜
[0279]
为了探索重组蜘蛛丝挤出物的成膜性质，将水性悬浮挤出物制备各种膜。
[0280]
使用通过使用实施例8中所述的过程制成的重组蜘蛛丝挤出物形成“丝-甘油膜”。
具体地，将25重量％重组蜘蛛丝多肽粉末和75重量％甘油的混合物在双螺杆挤出机中以90℃和250rpm循环30分钟，以得到重组蜘蛛丝挤出物。接下来，通过得到20重量％重组蜘蛛丝挤出物在80重量％去离子水中的悬浮液制成水性悬浮挤出物。将挤出物的悬浮液在21℃下轻轻搅拌。然后将水性悬浮挤出物暴露于高达90℃持续15分钟。然后将加热的水性悬浮挤出物浇注到平坦表面上并在60℃、15inhg的真空下干燥。
[0281]
使用通过使用实施例8中所述的过程制成的重组蜘蛛丝挤出物形成“丝-甘油乳液膜”。具体地，将25重量％重组蜘蛛丝多肽粉末和75重量％甘油的混合物在双螺杆挤出机中以90℃和250rpm循环30分钟，以得到重组蜘蛛丝挤出物。将重组蜘蛛丝挤出物重悬浮在水中，搅拌并掺入具有以下成分的乳液中：水、甘油、戊二烯、乙二醇、丝蛋白、神经酰胺ap、神经酰胺eop、神经酰胺np、胶原蛋白(sodium hydraluronate)、月桂酰乳酰乳酸钠(sodium lauroyl lactylate，sll)、胆固醇、黄原胶、小核菌胶(sclerotium gum)、卵磷脂、普鲁兰多糖(pullulan)、卡波姆、己烯、乙二醇、乙基己基甘油、辛二醇、edta二钠和苯氧基乙醇。
[0282]
然后将乳液浇注到平坦表面上并在60℃下干燥4小时。
[0283]
使用通过使用实施例8中所述的过程制成的重组蜘蛛丝挤出物形成“丝-甘油乳液冻干膜”。具体地，将25重量％重组蜘蛛丝多肽粉末和75重量％甘油的混合物在双螺杆挤出机中以90℃和250rpm循环30分钟，以得到重组蜘蛛丝挤出物。将重组蜘蛛丝挤出物掺入具有以下成分的乳液中：水、甘油、戊二烯、乙二醇、丝蛋白、神经酰胺ap、神经酰胺eop、神经酰胺np、胶原蛋白、月桂酰乳酰乳酸钠、胆固醇、黄原胶、小核菌胶、卵磷脂、普鲁兰多糖、卡波姆、己烯、乙二醇、乙基己基甘油、辛二醇、edta二钠和苯氧基乙醇。然后将乳液浇注到平坦表面上并放入labconco冷冻干燥器中且以0.008毫巴在-106℃下进行4小时，直到水升华掉。冻干得到“海绵状”或多孔混合物。
[0284]
通过应用至测试受试者皮肤来测试丝-甘油膜、丝-甘油乳液膜和丝-甘油乳液冻干膜中的每一种。在与皮肤接触和用水时，薄膜形成吸附到皮肤上的可分散液体。图19示出上述制备干燥丝-甘油乳液膜并应用于测试受试者皮肤的过程。图20示出涉及制备丝-甘油乳液冻干膜并应用于测试受试者皮肤的步骤。
[0285]
实施例11：重组蜘蛛丝挤出物与非挤出丝-甘油混合物的比较
[0286]
与非挤出丝与甘油的混合物进行比较，对重组蜘蛛丝挤出物的成膜能力进行了研究。作为第一步，使用上文在实施例8中描述的方法，制成包含25重量％重组蜘蛛丝多肽粉末和75重量％甘油的重组蜘蛛丝挤出物。具体地，将25重量％重组蜘蛛丝多肽粉末和75重量％甘油的混合物在双螺杆挤出机中以90℃和250rpm循环30分钟，以得到重组蜘蛛丝挤出物。通过形成10重量％重组蜘蛛丝挤出物在90重量％去离子水中的组合物来制成水性悬浮挤出物。将水性悬浮挤出物加热至90℃，然后使其在平坦的表面上干燥。如图21所示，干燥的混合物形成固体薄膜，其可以从它所浇注的表面分层。
[0287]
为了比较，通过将重组蜘蛛丝多肽粉末在甘油中混合以形成粘稠浆液来制成包含25重量％重组蜘蛛丝多肽粉末和75重量％甘油的“浆液”混合物。将浆液混合物悬浮在包含90％去离子水和10％浆液混合物的水性溶液中。然后将浆液混合物的悬浮液加热至90℃，然后使其在平坦表面上干燥，以研究浆液混合物是否形成膜。如图21所示，在干燥浆液混合物的水性悬浮液后，观察到与水性悬浮液之前的浆液混合物类似的粘稠浆液。因此，形成挤出物的步骤对混合物的成膜性质是有益的。
[0288]
为了进一步研究混合物的成膜性质，将25％丝/75％甘油挤出物和25％丝/75％甘油浆液(非挤出物)各自添加到包含以下成分的乳液中：水、甘油、戊二烯、乙二醇、丝蛋白、神经酰胺ap、神经酰胺eop、神经酰胺np、胶原蛋白、月桂酰乳酰乳酸钠(sll)、胆固醇、黄原胶、小核菌胶、卵磷脂、普鲁兰多糖、卡波姆、己烯、乙二醇、乙基己基甘油、辛二醇、edta二钠和苯氧基乙醇。然后将两种制剂在60℃下于平坦表面上干燥4小时，以观察在干燥后是否能观察到成膜。如图22所示，包含乳液和重组蜘蛛丝挤出物的制剂在干燥后形成膜。然而，在干燥包含乳液和重组蜘蛛丝多肽粉末的制剂时，没有观察到膜。因此，挤出物形成对乳液混合物的成膜性质是有利的。
[0289]
实施例12：甲醇中的丝挤出物
[0290]
在此实验中，通过将25重量％粉末与75重量％甘油混合并通过双螺杆挤出机在90℃下以250rpm加工30分钟来制备挤出物。然后通过在室温下轻轻混合来将挤出物以5倍稀释度重悬浮在水中。将此混合物分成两个等分试样。一个等分试样用水进一步稀释5倍，并且第二个等分试样用甲醇稀释5倍。如图23所示，如通过视觉和显微镜检查所确定，用水稀释的样品没有经历相变。用甲醇稀释的样品经历了相变，混合物在视觉上变得更不透明并且通过显微镜观察到了聚集。此结果突出表明，虽然挤出物材料和粉末具有类似的ftir光谱图(包括甲醇处理之前和之后类似的b折叠含量)，但挤出物的独特之处在于甲醇处理诱导聚集。
[0291]
再次制备悬浮在水中的挤出物，并如上文所述分离成两个等分试样。将每个等分试样浇注在平坦表面称量盘上，并在环境室温和湿度下干燥过夜。这得到从每个等分试样的膜材料。将一张膜不作处理，并且将另一张在封闭的室内暴露于甲醇蒸气过夜。然后将膜分层并放在皮肤上。未处理的膜在轻压和剪切时很容易揉搓到皮肤中。甲醇处理的膜在力学上更完整。在对甲醇处理的膜施加压力和剪切力时，此膜在皮肤上破裂并滚动。在持续的压力和剪切力的情况下，破裂的膜碎片最终被揉搓到皮肤中。ftir光谱显示这两种膜之间的β折叠含量没有差异，但是β折叠含量与甘油的相对比率略有下降。这表明，甲醇取代了与丝蛋白结合的甘油并且实现了更多的分子间缠结。较高分子间缠结解释了膜纹理的差异。
[0292]
实施例13：挤出物和非挤出物丝组合物的ftir分析
[0293]
使用ftir分析来研究重组蜘蛛在以下条件下的性质：
[0294]
·
甘油：100％甘油样品
[0295]
·
粉末：100％粉末样品
[0296]
·
粉末+甘油：将粉末悬浮在甘油中(25重量％粉末、75重量％甘油)
[0297]
·
粉末+甘油》甲醇退火：将粉末悬浮在甘油中(25重量％粉末、75重量％甘油)，然后浸没于甲醇中持续三小时。三小时后，将甲醇干燥
[0298]
·
挤出物：将25重量％粉末、75重量％甘油混合并且通过双螺杆挤出机在90℃下以250rpm加工30分钟
[0299]
·
挤出物》重悬浮干燥：通过在室温下轻轻混合来将挤出物材料以5倍稀释度重悬浮在水中。然后将重悬浮挤出物在环境温度和湿度下干燥过夜
[0300]
·
挤出物》甲醇退火：将挤出物材料浸没在甲醇中三小时。三小时后，将甲醇干燥
[0301]
·
挤出物》重悬浮干燥》甲醇退火：将挤出物-重悬浮材料浸没在甲醇中三小时。三小时后，将甲醇干燥
[0302]
分析了每一个的ftir光谱的β折叠含量，并且报告为1620-1625cm-1
处的β折叠含量与1637-1700cm-1
处总蛋白含量的相对量。
[0303]
光谱示出于图25a，并且相对β折叠哈量的定量示出于图25b，包括统计分析。对于统计分析，绿色菱形的顶部和底部表示95％置信区间。菱形重叠标记以线的形式出现在组平均值的上方和下方，并且计算为组平均值一个菱形中的重叠标记与另一个菱形的重叠标记相比更接近那个菱形的平均值，指示这两组在给定置信水平下没有差异。
[0304]
在此分析中，挤出物样品(挤出物、挤出物》再悬浮干燥以及挤出物》再悬浮干燥》甲醇退火)与粉末+甘油样品相比都没有统计学差异。这指示，将粉末变成挤出物的过程不影响β折叠基序。相反，需要一些其他机制来解释粉末与挤出物之间的相变。通过比较甲醇处理的样品，进一步强调了这一点。甲醇是常见的丝凝结剂，其将丝晶体区域从非晶质构型转变成β折叠构型。在未处理和甲醇处理的样品之间没有测量到β折叠含量的差异，这进一步强调了挤出过程将粉末转变成挤出物的机制不是由β折叠破坏所决定的。虽然ftir光谱显示这两种薄膜之间的β折叠含量没有差异，但氨基酸含量(即，酰胺i条带)与甘油的相对比率略有下降(图25c)。
[0305]
还使用ftir分析来研究干燥后重组蜘蛛丝挤出物在水性悬浮液中的性质，以确定水性悬浮挤出物中水的量是否影响溶解度。将25％重组蜘蛛丝多肽粉末和75％甘油的蜘蛛丝挤出物悬浮在各种水性溶液中，以实现重组蜘蛛丝多肽的最终重量为5％、10％、15％和20％。然后将水性悬浮挤出物干燥，并且使用上述方法评估ftir。图26描绘干燥的水性悬浮挤出物的粘度和ftir峰。如图26所示，观察到干燥的水性悬浮挤出物的粘度有明显差异。然而，在不同的水性悬浮挤出物中，对应于β折叠含量的ftir峰是类似的，指示β折叠形成的量不随水性悬浮挤出物中水的量而变化。
[0306]
实施例14：在挤出物上清液中的重组丝胶态悬浮液
[0307]
此实施例的目的是定量描述本发明的材料性质以及它们与粉末形式的重组丝有什么不同。当将挤出物悬浮在水性溶剂中时，挤出物变成胶态悬浮液，如通过颗粒定径所确定。这与粉末完全不同，当将粉末悬浮在水性溶剂中时，其不显著地分配到水相中，如通过尺寸排除色谱法(sec)所证实。
[0308]
通过在水中混合挤出物并将混合物离心以得到包含胶态悬浮液的上清液来制备重组丝的胶态悬浮液。通过尺寸排阻色谱法(sec)分析挤出物上清液中的蛋白含量，并将其与丝粉末、丝粉末上清液和挤出物中的蛋白含量相比较。测量了胶态悬浮液中颗粒的大小分布，并将其与200nm大小标准物、甘油对照以及使用libr溶解的丝相比较。下文提供了样品制备和测定结果的细节。
[0309]
丝挤出物上清液
[0310]
通过将挤出物(75％甘油和25％丝)以20重量％(15％甘油和5％丝)悬浮在水中，用手交替振荡并涡旋约5分钟，直到固体完全消散，来制备挤出物上清液。将混合物在室温下孵育30分钟。将混合物在16,000rcf下离心30分钟以除去固体。收集上清液，并将其称为挤出物上清液。
[0311]
丝粉末上清液
[0312]
通过将如实施例1中所制备的丝粉末以5重量％悬浮在水中并在室温下孵育30分
钟来制备粉末上清液。将混合物在16,000rcf下离心30分钟以除去丝粉末固体。收集上清液，并将其称为粉末上清液。
[0313]
libr丝溶解
[0314]
为了提供高度溶解的丝样品作为对照，将18b丝粉末以1g粉末对4ml libr溶液悬浮在9.3m libr水性溶液中。将此溶液在60℃下孵育四小时。将溶解的丝装入3,500截留分子量的透析盒中，并对4l di水透析48小时，换水6次。然后将透析的丝溶液以16,000rcf离心30分钟以除去任何沉淀的丝。然后如下文所提供的，针对颗粒定径对剩余的高度溶解的丝样品进行测定。
[0315]
蛋白质谱
[0316]
通过sec测量丝粉末、丝粉末上清液、丝挤出物和丝挤出物上清液的蛋白质谱。结果示出于图27并提供于表16中。粉末、挤出物和挤出物上清液样品具有类似的蛋白质谱。因此，进入挤出物上清液级分的丝材料的蛋白质组成与粉末和挤出物类似。换句话说，特定聚集物、全长分子或低分子量(lmw)级分都不优先进入挤出物上清液。另外，粉末上清液含有不可检测的水平的蛋白质，指示粉末中的蛋白质没有溶解到上清液中。此外，挤出物上清液中的蛋白质重量百分比含量为5％，与挤出物和粉末相同，指示与起始混合物浓度相比，形成胶体的那部分丝没有减少。
[0317]
表16-如通过sec所测量的丝组合物的蛋白质谱
[0318] 聚集物重量％全长重量％lmw重量％总计重量％粉末0.561.7952.2354.59粉末上清液0.00000.00挤出物0.652.3651.924.94上清液0.642.152.0754.87
[0319]
颗粒定径
[0320]
在malvern仪器zetasizer nano中进行颗粒定径。将聚苯乙烯聚合物200nm标准物以250倍溶解在水中。将所有样品在去di水中从起始溶液稀释250倍(丝起始含量为5重量％，甘油起始含量为15重量％)。样品以单次运行，并以一式三份进行测量。报告的数据是以纳米为单位的z-平均值，附有多分散指数(pdi)(图28和表17)。接近于零平均颗粒大小的多分散指数值为单一群体，并且接近于1平均颗粒大小的值为多个群体。
[0321]
由于sec不能在溶解与未溶解的丝之间进行区分，所以使用颗粒定径来阐明挤出物上清液中分子组装体的性质(即，确定分子是否聚集成颗粒以及颗粒的大小)。
[0322]
可以预知，甘油和libr对照组不表现出峰。这些是完全可溶的溶液并且不应表现出峰。挤出物上清液表现出两个峰和一个肩部区域(图28)。峰值对应于38nm和642nm直径，肩部约为150nm直径。鉴于胶体被定义为“颗粒的直径在1纳米与1000纳米之间的范围内，仍能够保持在溶液中均匀分布的混合物”，此数据指示水中的悬浮挤出物出不溶解的凝胶相之外还形成了胶态相。
[0323]
粉末和挤出物混合物的目视检查进一步支持了此结果(图29)。5％丝粉末混合物在4℃下孵育24小时后沉降。5％丝挤出物上清液(即，凝胶相已被离心出来，这种混合物是5重量％丝和15重量％甘油)在4℃下孵育30天后不沉降。
[0324]
表17-如通过zetasizer nano所测量的丝溶液中的颗粒大小分布
[0325][0326]
实施例15：屏障修复测定
[0327]
使用5％丝蛋白挤出物混合物(进入混合物中的挤出物是75％甘油和25％丝蛋白，所得混合物是15％甘油和5％丝蛋白)测试了六名受试者(年龄38.2岁；5名女性，1名男性)的皮肤屏障修复。将前胳膊内侧画出三个部分。通过蒸气压力计测量经皮水流失(tewl)。用包装胶带来胶带剥离皮肤，直到tewl值达到20与25之间。应用产品并且在30分钟和2小时再次测量tewl。研究中包括媒介物对照(水中的15％甘油)和未处理部位。
[0328]
5％挤出物样品表现出相比于对照最快速的修复以及比对照更快地恢复到基线(图30)。