与分子连接的细胞外囊泡及其用途的制作方法

与分子连接的细胞外囊泡及其用途
1.相关申请的交叉引用
2.本pct申请要求2019年8月14日提交的美国临时申请号62/886,941和2019年9月3日提交的美国临时申请号62/895,398的优先权权益，所述美国临时申请各自以引用的方式整体并入本文。
3.对通过efs-web以电子方式提交的序列表的引用
4.在本技术中提交的以电子方式提交的序列表(名称：4000.057pc02_seqlisting_st25.txt，大小：765,394字节；并且创建日期：2020年8月14日)的内容以引用的方式整体并入本文中。
技术领域
5.本公开提供了细胞外囊泡(ev)，例如外泌体，所述细胞外囊泡包含通过锚定部分与所述细胞外囊泡(例如，外泌体)共价连接的至少一种生物活性分子，所述细胞外囊泡可用作预防或治疗癌症和其它疾病的剂。


背景技术：

6.许多生物活性化合物具有具治疗意义的有效生物活性。然而，这些化合物通常在非靶器官中表现出毒性。限制非靶组织暴露的一种方式是将小分子化学缀合至基于亲和力的试剂(如抗体)，这可将治疗性化合物引导至特定细胞类型(dosio,f.等人,toxins(basel)3(7):848-883(2011))，但这种方法受限于可连接至抗体的目标化合物分子的数量(通常每个抗体2-6个分子)以及特异性地结合至靶向的、相关的患病/效应细胞而不结合至非靶细胞的抗体的可用性/存在。这两个问题分别通过降低效力和增加全身毒性而限制抗体-药物缀合物(adc)的使用。因此，需要具有比adc更高有效载荷的递送系统，所述递送系统能够选择性地靶向特定组织或器官，同时限制对治疗性化合物的总体全身暴露。
7.ev(例如，外泌体)是细胞间通讯的重要介质。它们也是许多疾病(如癌症)的诊断和预后中的重要生物标志物。作为药物递送载体，ev(例如，外泌体)在许多治疗领域作为新的治疗方式提供相对于传统药物递送方法(例如肽免疫、dna疫苗)的许多优点。然而，尽管有其优点，但许多ev(例如，外泌体)的临床功效有限。例如，树突细胞来源的外泌体(dex)在ii期临床试验中在不能手术的非小细胞肺癌(nsclc)患者中作为一线化学疗法后的维持免疫疗法进行了研究。然而，所述试验因未达到主要终点(化学疗法停止后4个月时至少50％的患者具有无进展存活(pfs))而终止。besse,b.,等人,oncoimmunology 5(4):e1071008(2015)。
8.因此，需要新的和更有效的工程化ev(例如，外泌体)以更好地实现基于ev技术的治疗用途和其它应用。


技术实现要素：

9.本公开涉及一种细胞外囊泡(ev)，所述细胞外囊泡包含通过锚定部分(am)与所述
ev共价连接的生物活性分子(bam)，其中所述锚定部分包含：
10.[am]-[接头]n-[bam]
ꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀ
式(i)
[0011]
其中n是任何整数。在一些方面中，n是介于0与10之间的任何整数。
[0012]
在其它方面中，所述锚定部分包含固醇、gm1、脂质(例如，磷脂或脂肪酸)、维生素、小分子、肽或它们的组合。例如，所述锚定部分包含至少6个碳原子、至少7个碳原子、至少8个碳原子、至少9个碳原子、至少10个碳原子、至少11个碳原子、至少12个碳原子、至少13个碳原子、至少14个碳原子、至少15个碳原子、至少16个碳原子、至少17个碳原子、至少18个碳原子、至少19个碳原子、至少20个碳原子、至少25个碳原子、至少30个碳原子、至少35个碳原子、至少40个碳原子、至少45个碳原子、至少50个碳原子、至少55个碳原子、至少至少60个碳原子、至少65个碳原子、至少70个碳原子、至少75个碳原子、至少80个碳原子、至少85个碳原子或至少90个碳原子。
[0013]
在其它方面中，所述锚定部分包含固醇、类固醇、藿烷类、羟基类固醇、开环类固醇、它们的类似物或它们的任何组合。在一些其它方面中，所述锚定部分包含麦角固醇、7-脱氢胆固醇、胆固醇、24s-羟基胆固醇、羊毛固醇、环阿屯醇、岩藻固醇、大褐马尾藻固醇、菜油固醇、β-谷固醇、谷甾烷醇、粪固醇、燕麦固醇、豆固醇或它们的任何组合。
[0014]
在一些方面中，所述锚定部分是具有以下结构的胆固醇：
[0015][0016]
在一些方面中，所述锚定部分具有结构
[0017][0018]
[0019]
在一些方面中，所述锚定部分包含类固醇，所述类固醇是二氢睾酮、熊果醇、龙舌蓝皂苷配基、薯蓣皂苷配基、黄体酮、皮质醇或它们的任何组合。
[0020]
在一些方面中，所述锚定部分包含脂质。在其它方面中，所述锚定部分包含c
2-c
60
链。在一些方面中，所述锚定部分包含c
4-c
40
、c
2-c
38
、c
2-c
36
、c
2-c
34
、c
2-c
32
、c
2-c
30
、c
4-c
30
、c
2-c
28
、c
4-c
28
、c
2-c
26
、c
4-c
26
、c
2-c
24
、c
4-c
24
、c
6-c
24
、c
8-c
24
、c
10-c
24
、c
2-c
22
、c
4-c
22
、c
6-c
22
、c
8-c
22
、c
10-c
22
、c
2-c
20
、c
4-c
20
、c
6-c
20
、c
8-c
20
、c
10-c
20
、c
2-c
18
、c
4-c
18
、c
6-c
18
、c
8-c
18
、c
10-c
18
、c
12-c
18
、c
14-c
18
、c
16-c
18
、c
2-c
16
、c
4-c
16
、c
6-c
16
、c
8-c
16
、c
10-c
16
、c
12-c
16
、c
14-c
16
、c
2-c
15
、c
4-c
15
、c
6-c
15
、c
8-c
15
、c
9-c
15
、c
10-c
15
、c
11-c
15
、c
12-c
15
、c
13-c
15
、c
2-c
14
、c
4-c
14
、c
6-c
14
、c
8-c
14
、c
9-c
14
、c
10-c
14
、c
11-c
14
、c
12-c
14
、c
2-c
13
、c
4-c
13
、c
6-c
13
、c
7-c
13
、c
8-c
13
、c
9-c
13
、c
10-c
13
、c
10-c
13
、c
11-c
13
、c
2-c
12
、c
4-c
12
、c
6-c
12
、c
7-c
12
、c
8-c
12
、c
9-c
12
、c
10-c
12
、c
2-c
11
、c
4-c
11
、c
6-c
11
、c
7-c
11
、c
8-c
11
、c
9-c
11
、c
2-c
10
、c
4-c
10
、c
2-c9、c
4-c9、c
2-c8、c
2-c7、c
4-c7、c
2-c6或c
4-c6链。
[0021]
在一些方面中，所述锚定部分包含直链脂肪酸、支链脂肪酸、不饱和脂肪酸、单不饱和脂肪酸、多不饱和脂肪酸、羟基脂肪酸、多元羧酸或它们的任何组合。在一些方面中，所述锚定部分包含直链脂肪酸，所述直链脂肪酸是丁酸、己酸、辛酸、癸酸、月桂酸、肉豆蔻酸、棕榈酸、硬脂酸、花生酸、山嵛酸、二十四烷酸、二十六烷酸、二十八烷酸、三十烷酸和正三十二烷酸，以及具有奇数个碳原子的那些，如丙酸、正戊酸、庚酸、壬酸、十一烷酸、十三烷酸、十五烷酸、十七烷酸、十九烷酸、二十一烷酸、二十三烷酸、二十五烷酸、二十七烷酸或它们的任何组合。
[0022]
在一些方面中，所述锚定部分包含支链脂肪酸，所述支链脂肪酸是异丁酸、异己酸、异辛酸、异癸酸、异月桂酸、11-甲基十二烷酸、异肉豆蔻酸、13-甲基-十四烷酸、异棕榈酸、15-甲基-十六烷酸、异硬脂酸、17-甲基十八烷酸、异花生酸、19-甲基-二十烷酸、α-乙基-己酸、α-己基癸酸、α-庚基十一烷酸、2-癸基十四烷酸、2-十一烷基十四烷酸、2-癸基十五烷酸、2-十一烷基十五烷酸、fine oxocol 1800酸(nissan chemical industries,ltd.的产品)，以异丁基封端的反异脂肪酸，如6-甲基-辛酸、8-甲基-癸酸、10-甲基-十二烷酸、12-甲基-十四烷酸、14-甲基-十六烷酸、16-甲基-十八烷酸、18-甲基-二十烷酸、20-甲基-二十二烷酸、22-甲基-二十四烷酸、24-甲基-二十六烷酸和26-甲基二十八烷酸或它们的任何组合。
[0023]
在一些方面中，所述锚定部分包含不饱和脂肪酸，所述不饱和脂肪酸是4-癸烯酸、癸烯酸、4-十二碳烯酸、5-十二碳烯酸、月桂烯酸、4-十四碳烯酸、5-十四碳烯酸、9-十四碳烯酸、棕榈油酸、6-十八碳烯酸、油酸、9-十八碳烯酸、11-十八碳烯酸、9-二十碳烯酸、顺式-11-二十碳烯酸、鲸蜡油酸、13-二十二碳烯酸、15-二十四碳烯酸,17-二十六碳烯酸、6,9,12,15-十六碳四烯酸、亚油酸、亚麻酸、α-桐酸、β-桐酸、石榴酸、6,9,12,15-十八碳四烯酸、杷荏酸、5,8,11,14-二十碳四烯酸、5,8,11,14,17-二十碳五烯酸、7,10,13,16,19-二十二碳五烯酸、4,7,10,13,16,19-二十二碳六烯酸或它们的任何组合。在一些方面中，所述锚定部分包含羟基脂肪酸，所述羟基脂肪酸是α-羟基月桂酸、α-羟基肉豆蔻酸、α-羟基棕榈酸、α-羟基硬脂酸、ω-羟基月桂酸、α-羟基花生酸、9-羟基-12-十八碳烯酸、蓖麻油酸、α-羟基山嵛酸、9-羟基-反式-10,12-十八碳二烯酸、粗糠柴酸(kamolenic acid)、番红醇酸、9,10-二羟基硬脂酸、12-羟基硬脂酸或它们的组合。在一些方面中，所述锚定部分包含多元羧酸，所述多元羧酸是草酸、丙二酸、琥珀酸、戊二酸、己二酸、庚二酸、辛二酸、壬二酸、癸二酸、d,
l-苹果酸或它们的任何组合。
[0024]
在一些方面中，所述锚定部分包含磷脂。在一些方面中，所述磷脂是磷脂酰胆碱、磷脂酰乙醇胺、磷脂酰甘油、磷脂酰丝氨酸、磷脂酸、2溶血磷脂酰胆碱、鞘磷脂或它们的任何组合。在一些方面中，所述磷脂是磷脂酰乙醇胺，所述磷脂酰乙醇胺是二月桂酰基磷脂酰乙醇胺、二肉豆蔻酰基磷脂酰乙醇胺、二棕榈酰基磷脂酰乙醇胺、二硬脂酰基磷脂酰乙醇胺、二油酰基磷脂酰乙醇胺、1-棕榈酰基-2-油烯基磷脂酰乙醇胺、1-油烯基-2-棕榈酰基磷脂酰乙醇胺、二芥酰基磷脂酰乙醇胺或它们的任何组合。在一些方面中，所述磷脂是磷脂酰甘油，所述磷脂酰甘油是二月桂酰基磷脂酰甘油、二肉豆蔻酰基磷脂酰甘油、二棕榈酰基磷脂酰甘油、二硬脂酰基磷脂酰甘油、二油酰基磷脂酰甘油、1-棕榈酰基-2-油烯基-磷脂酰甘油、1-油烯基-2-棕榈酰基-磷脂酰甘油、二芥酰基磷脂酰甘油或它们的任何组合。在一些方面中，所述磷脂是磷脂酰丝氨酸，所述磷脂酰丝氨酸是二月桂酰基磷脂酰丝氨酸、二肉豆蔻酰基磷脂酰丝氨酸、二棕榈酰基磷脂酰丝氨酸、二硬脂酰基磷脂酰丝氨酸、二油酰基磷脂酰丝氨酸、1-棕榈酰基-2-油烯基-磷脂酰丝氨酸、1-油烯基-2-棕榈酰基-磷脂酰丝氨酸、二芥酰基磷脂酰丝氨酸或它们的任何组合。在一些方面中，所述磷脂是磷脂酸，所述磷脂酸是二月桂酰基磷脂酸、二肉豆蔻酰基磷脂酸、二棕榈酰基磷脂酸、二硬脂酰基磷脂酸、二油酰基磷脂酸、1-棕榈酰基-2-油烯基磷脂酸、1-油烯基-2-棕榈酰基-磷脂酸、二芥酰基磷脂酸或它们的任何组合。在一些方面中，所述磷脂是磷脂酰肌醇，所述磷脂酰肌醇是二月桂酰基磷脂酰肌醇、二肉豆蔻酰基磷脂酰肌醇、二棕榈酰基磷脂酰肌醇、二硬脂酰基磷脂酰肌醇、二油酰基磷脂酰肌醇、1-棕榈酰基-2-油烯基-磷脂酰肌醇、1-油烯基-2-棕榈酰基-磷脂酰肌醇、二芥酰基磷脂酰肌醇或它们的任何组合。在一些方面中，所述磷脂是对称磷脂，所述对称磷脂是1,2二丙酰基sn-甘油基3磷酸胆碱(03:0pc)；1,2二丁酰基sn甘油基3磷酸胆碱(04:0pc)；1,2二戊酰基sn甘油基3磷酸胆碱(05:0pc)；1,2二己酰基sn甘油基3磷酸胆碱(06:0pc)；1,2二庚酰基sn甘油基3磷酸胆碱(07:0pc)；1,2二辛酰基sn甘油基3磷酸胆碱(08:0pc)；1,2二壬酰基sn甘油基3磷酸胆碱(09:0pc)；1,2二癸酰基sn甘油基3磷酸胆碱(10:0pc)；1,2双十一烷酰基sn甘油基3磷酸胆碱(11:0pc，dupc)；1,2二月桂酰基sn甘油基3磷酸胆碱(12:0pc)；1,2双十三烷酰基sn甘油基3磷酸胆碱(13:0pc)；1,2二肉豆蔻酰基sn甘油基3磷酸胆碱(14:0pc,dmpc)；1,2双十五烷酰基sn甘油基3磷酸胆碱(15:0pc)；1,2二棕榈酰基sn甘油基3磷酸胆碱(16:0pc，dppc)；1,2二植烷酰基sn甘油基3磷酸胆碱(4me 16:0pc)；1,2双十七烷酰基sn甘油基3磷酸胆碱(17:0pc)；1,2二硬脂酰基sn甘油基3磷酸胆碱(18:0pc，dspc)；1,2双十九烷酰基sn甘油基3磷酸胆碱(19:0pc)；1,2双二十烷酰基sn甘油基3磷酸胆碱(20:0pc)；1,2双二十一烷酰基sn甘油基3磷酸胆碱(21:0pc)；1,2二山嵛酰基sn甘油基3磷酸胆碱(22:0pc)；1,2双二十三烷酰基sn甘油基3磷酸胆碱(23:0pc)；1,2双二十四烷酰基sn甘油基3磷酸胆碱(24:0pc)；1,2二肉豆蔻脑酰基sn甘油基3磷酸胆碱(14:1(δ9-顺式)pc)；1,2二反肉豆蔻脑酰基sn甘油基3磷酸胆碱(14:1(δ9-反式)pc)；1,2二棕榈油酰基sn甘油基3磷酸胆碱(16:1(δ9-顺式)pc)；1,2二反棕榈油酰基sn甘油基3磷酸胆碱(16:1(δ9-反式)pc)；1,2二异岩芹酰基sn甘油基3磷酸胆碱(18:1(δ6-顺式)pc)；1,2二油酰基sn甘油基3磷酸胆碱(18:1(δ9-顺式)pc，dopc)；1,2二反油酰基sn甘油基3磷酸胆碱(18:1(δ9-反式)pc)；1,2二亚油酰基sn甘油基3磷酸胆碱(18:2(顺式)pc，dlpc)；1,2二亚麻酰基sn甘油基3磷酸胆碱(18:3(顺式)pc，dlnpc)；1,2双二十碳烯酰基sn甘油基3磷酸胆
碱(20:1(顺式)pc)；1,2二花生四烯酰基sn甘油基3磷酸胆碱(20:4(顺式)pc，dapc)；1,2二瓢儿菜基sn甘油基3磷酸胆碱(22:1(顺式)pc)；1,2双二十二碳六烯酰基sn甘油基3磷酸胆碱(22:6(顺式)pc，dhapc)；1,2二神经酰基sn甘油基3磷酸胆碱(24:1(顺式)pc)；1,2二己酰基sn甘油基3磷酸乙醇胺(06:0pe)；1,2二辛酰基sn甘油基3磷酸乙醇胺(08:0pe)；1,2二癸酰基sn甘油基3磷酸乙醇胺(10:0pe)；1,2二月桂酰基sn甘油基3磷酸乙醇胺(12:0pe)；1,2二肉豆蔻酰基sn甘油基3磷酸乙醇胺(14:0pe)；1,2双十五烷酰基sn甘油基3磷酸乙醇胺(15:0pe)；1,2二棕榈酰基sn甘油基3磷酸乙醇胺(16:0pe)；1,2二植烷酰基sn甘油基3磷酸乙醇胺(4me 16:0pe)；1,2双十七烷酰基sn甘油基3磷酸乙醇胺(17:0pe)；1,2二硬脂酰基sn甘油基3磷酸乙醇胺(18:0pe，dspe)；1,2二棕榈油酰基sn甘油基3磷酸乙醇胺(16:1pe)；1,2二油酰基sn甘油基3磷酸乙醇胺(18:1(δ9-顺式)pe，dope)；1,2二反油酰基sn甘油基3磷酸乙醇胺(18:1(δ9-反式)pe)；1,2二亚油酰基sn甘油基3磷酸乙醇胺(18:2pe，dlpe)；1,2二亚麻酰基sn甘油基3磷酸乙醇胺(18:3pe，dlnpe)；1,2二花生四烯酰基sn甘油基3磷酸乙醇胺(20:4pe，dape)；1,2双二十二碳六烯酰基sn甘油基3磷酸乙醇胺(22:6pe，dhape)；1,2二o十八碳烯基sn甘油基3磷酸胆碱(18:0二醚pc)；1,2二油酰基sn甘油基3磷酸外消旋(1甘油)钠盐(dopg)或它们的任何组合。
[0025]
在一些方面中，所述磷脂是不对称磷脂，所述不对称磷脂是1肉豆蔻酰基2棕榈酰基sn甘油基3磷酸胆碱(14:0-16:0pc，mppc)；1肉豆蔻酰基2硬脂酰基sn甘油基3磷酸胆碱(14:0-18:0pc，mspc)；1棕榈酰基2乙酰基sn甘油基3磷酸胆碱(16:0-02:0pc)；1棕榈酰基2肉豆蔻酰基sn甘油基3磷酸胆碱(16:0-14:0pc，pmpc)；1棕榈酰基2硬脂酰基sn甘油基3磷酸胆碱(16:0-18:0pc，pspc)；1棕榈酰基2油酰基sn甘油基3磷酸胆碱(16:0-18:1pc，popc)；1棕榈酰基2亚油酰基sn甘油基3磷酸胆碱(16:0-18:2pc，plpc)；1棕榈酰基2花生四烯酰基sn甘油基3磷酸胆碱(16:0-20:4pc)；1棕榈酰基2二十二碳六烯酰基sn甘油基3磷酸胆碱(14:0-22:6pc)；1硬脂酰基2肉豆蔻酰基sn甘油基3磷酸胆碱(18:0-14:0pc，smpc)；1硬脂酰基2棕榈酰基sn甘油基3磷酸胆碱(18:0-16:0pc，sppc)；1硬脂酰基2油酰基sn甘油基3磷酸胆碱(18:0-18:1pc，sopc)；1硬脂酰基2亚油酰基sn甘油基3磷酸胆碱(18:0-18:2pc)；1硬脂酰基2花生四烯酰基sn甘油基3磷酸胆碱(18:0-20:4pc)；1硬脂酰基2二十二碳六烯酰基sn甘油基3磷酸胆碱(18:0-22:6pc)；1油酰基2肉豆蔻酰基sn甘油基3磷酸胆碱(18:1-14:0pc，ompc)；1油酰基2棕榈酰基sn甘油基3磷酸胆碱(18:1-16:0pc，oppc)；1油酰基2硬脂酰基sn甘油基3磷酸胆碱(18:1-18:0pc，ospc)；1棕榈酰基2油酰基sn甘油基3磷酸乙醇胺(16:0-18:1pe，pope)；1棕榈酰基2亚油酰基sn甘油基3磷酸乙醇胺(16:0-18:2pe)；1棕榈酰基2花生四烯酰基sn甘油基3磷酸乙醇胺(16:0-20:4pe)；1棕榈酰基2二十二碳六烯酰基sn甘油基3磷酸乙醇胺(16:0-22:6pe)；1硬脂酰基2油酰基sn甘油基3磷酸乙醇胺(18:0-18:1pe)；1硬脂酰基2亚油酰基sn甘油基3磷酸乙醇胺(18:0-18:2pe)；1硬脂酰基2花生四烯酰基sn甘油基3磷酸乙醇胺(18:0-20:4pe)；1硬脂酰基2二十二碳六烯酰基sn甘油基3磷酸乙醇胺(18:0-22:6pe)；1油酰基2胆固醇基半琥珀酰基sn甘油基3磷酸胆碱(ochemspc)或它们的任何组合。
[0026]
在一些方面中，所述磷脂是溶血脂质。在一些方面中，所述磷脂是溶血性甘油磷脂、溶血性鞘糖脂、溶血性磷脂酰胆碱、溶血性磷脂酰乙醇胺、溶血性磷脂酰肌醇、溶血性磷脂酰丝氨酸或它们的任何组合。在一些方面中，所述磷脂是1己酰基2羟基sn甘油基3磷酸胆
碱(06:0 lyso pc)；1庚酰基2羟基sn甘油基3磷酸胆碱(07:0 lyso pc)；1辛酰基2羟基sn甘油基3磷酸胆碱(08:0 lyso pc)；1壬酰基2羟基sn甘油基3磷酸胆碱(09:0 lyso pc)；1癸酰基2羟基sn甘油基3磷酸胆碱(10:0 lyso pc)；1十一烷酰基2羟基sn甘油基3磷酸胆碱(11:0lyso pc)；1月桂酰基2羟基sn甘油基3磷酸胆碱(12:0 lyso pc)；1十三烷酰基2羟基sn甘油基3磷酸胆碱(13:0 lyso pc)；1肉豆蔻酰基2羟基sn甘油基3磷酸胆碱(14:0 lyso pc)；1十五烷酰基2羟基sn甘油基3磷酸胆碱(15:0 lyso pc)；1棕榈酰基2羟基sn甘油基3磷酸胆碱(16:0 lyso pc)；1十七烷酰基2羟基sn甘油基3磷酸胆碱(17:0 lyso pc)；1硬脂酰基2羟基sn甘油基3磷酸胆碱(18:0 lyso pc)；1油酰基2羟基sn甘油基3磷酸胆碱(18:1 lyso pc)；1十九烷酰基2羟基sn甘油基3磷酸胆碱(19:0 lyso pc)；1二十烷酰基2羟基sn甘油基3磷酸胆碱(20:0 lyso pc)；1山嵛酰基2羟基sn甘油基3磷酸胆碱(22:0 lyso pc)；1二十四烷酰基2羟基sn甘油基3磷酸胆碱(24:0lyso pc)；1二十六烷酰基2羟基sn甘油基3磷酸胆碱(26:0 lyso pc)；1肉豆蔻酰基2羟基sn甘油基3磷酸乙醇胺(14:0 lyso pe)；1棕榈酰基2羟基sn甘油基3磷酸乙醇胺(16:0 lyso pe)；1硬脂酰基2羟基sn甘油基3磷酸乙醇胺(18:0 lyso pe)；1油酰基2羟基sn甘油基3磷酸乙醇胺(18:1 lyso pe)；1十六烷基sn甘油基3磷酸胆碱(c16 lyso pc)；或它们的任何组合。
[0027]
在一些方面中，所述锚定部分包含维生素。在一些方面中，所述锚定部分包含维生素d、维生素k、维生素e或它们的任何组合。在一些方面中，所述锚定部分还包含在所述生物活性分子与所述锚定部分之间的接头。
[0028]
在一些方面中，所述接头包括不可裂解接头。在一些方面中，所述不可裂解接头包含聚乙二醇(peg)、甘油、烷基、琥珀酰亚胺、马来酰亚胺或它们的任何组合。在一些方面中，所述不可裂解接头包含特征在于式r3-(o-ch
2-ch2)
n-或r3-(0-ch
2-ch2)
n-o-的聚乙二醇(peg)，其中r3是氢、甲基或乙基，并且n是介于2与200之间的整数。在一些方面中，所述不可裂解接头包含二甘醇、三甘醇、四甘醇(teg)、六甘醇(heg)、五甘醇或它们的任何组合。
[0029]
在一些方面中，所述接头包含具有式((r3—o—(ch2—choh—c h2o)n—)的聚甘油(pg)，其中r3是氢、甲基或乙基，并且n是介于3与200之间的整数。在一些方面中，所述接头包含二甘油、三甘油、四甘油(tg)、五甘油、六甘油(hg)或它们的任何组合。
[0030]
在一些方面中，所述接头包含烷基。在一些方面中，所述接头包含烯基、炔基、芳基烷基、芳基烯基、芳基炔基、杂芳基烷基、杂芳基烯基、杂芳基炔基、杂环基烷基、杂环基烯基、杂环基炔基、芳基、杂芳基、杂环基、环烷基、环烯基、烷基芳基烷基、烷基芳基烯基、烷基芳基炔基、烯基芳基烷基、烯基reyl烯基、烯基芳基炔基、炔基芳基烷基、炔基芳基烯基、炔基芳基炔基、烷基杂芳基烷基、烷基杂芳基烷基、烷基杂芳基烯基、烷基杂芳基炔基、烯基杂芳基烷基、烯基杂芳基烯基、烯基杂芳基炔基、炔基杂芳基烷基、炔基杂芳基烯基、炔基杂芳基炔基、烷基杂环基烷基、烷基杂环基烯基、烷基杂环基炔基、烯基杂环基烷基、烯基杂环基烯基、烯基杂环基炔基或它们的任何组合。
[0031]
在一些方面中，所述接头包括可裂解接头。在一些方面中，所述可裂解接头是氧化还原可裂解接头、活性氧类可裂解接头、ph依赖性可裂解接头、酶可裂解接头、蛋白酶可裂解接头、酯酶可裂解接头、磷酸酶可裂解接头、光活化可裂解接头、自分解性接头或它们的任何组合。在一些方面中，所述可裂解接头是自分解性接头。在一些方面中，所述可裂解接头是肉桂基、萘基、联苯基、杂环、同源芳族基团、香豆素、呋喃、噻吩、噻唑、噁唑、异噁唑、吡
咯、吡唑、吡啶、咪唑酮、三唑或它们的任何组合。
[0032]
在一些方面中，所述接头具有式：
[0033]-a
a-y
y-[0034]
其中每个
–
a-独立地是氨基酸单元，a独立地是1至12的整数；-y-是间隔子单元，并且y是0、1或2。在一些方面中，所述-a
a-是二肽、三肽、四肽、五肽或六肽。在一些方面中，a是2并且
–aa-选自由以下组成的组：缬氨酸-丙氨酸、缬氨酸-瓜氨酸、苯丙氨酸-赖氨酸、n-甲基缬氨酸-瓜氨酸、环己基丙氨酸-赖氨酸和β-丙氨酸-赖氨酸。在一些方面中，所述
–aa-是缬氨酸-丙氨酸或缬氨酸-瓜氨酸。在一些方面中，y是1。在一些方面中，
–
y-是自分解性间隔子。在一些方面中，
–yy-具有式(v)：
[0035][0036]
其中每个r2独立地是c
1-8
烷基、-o-(c
1-8
烷基)、卤素、硝基或氰基；并且m是0至4的整数。在一些方面中，m是0、1或2。在一些方面中，m是0。
[0037]
在一些方面中，所述可裂解接头是缬氨酸-丙氨酸-氨基甲酸对氨基苄酯或缬氨酸-瓜氨酸-氨基甲酸对氨基苄酯。在一些方面中，
–
y-是非自分解性间隔子。在一些方面中，所述非自分解性间隔子是
–
gly-或
–
gly-gly-。
[0038]
在一些方面中，所述锚定部分包含：
[0039][0040]
在一些方面中，所述ev包含选自seq id no:301-324、401-567、其片段或其组合的锚定部分，以及选自表1和表2的接头组合的接头。
[0041]
在一些方面中，所述锚定部分包含支架蛋白。在一些方面中，所述ev还包含支架部分。在一些方面中，所述锚定部分和/或所述支架部分是支架x。在一些方面中，所述支架x选自由以下组成的组：前列腺素f2受体负调控因子(ptgfrn蛋白)；basigin(bsg蛋白)；免疫球蛋白超家族成员2(igsf2蛋白)；免疫球蛋白超家族成员3(igsf3蛋白)；免疫球蛋白超家族成员8(igsf8蛋白)；整联蛋白β-1(itgb1蛋白)；整联蛋白α-4(itga4蛋白)；4f2细胞表面抗原重链(slc3a2蛋白)；一类atp转运蛋白(atp1a1、atp1a2、atp1a3、atp1a4、atp1b3、atp2b1、atp2b2、atp2b3、atp2b4蛋白)；它们的功能片段；以及它们的任何组合。在一些方面中，所述支架x是ptgfrn蛋白或其功能片段。在一些方面中，所述支架x包含如seq id no:301-324中
列出的氨基酸序列、其片段以及它们的组合。
[0042]
在一些方面中，所述锚定部分和/或所述支架部分是支架y。在一些方面中，所述支架y是能够将所述生物活性分子锚定在所述细胞外囊泡的腔表面上和/或所述细胞外囊泡的外表面上的支架蛋白。在一些方面中，所述支架y选自由以下组成的组：富含肉豆蔻酰化丙氨酸的蛋白激酶c底物(marcks蛋白)、富含肉豆蔻酰化丙氨酸的蛋白激酶c底物样1(marcksl1蛋白)、脑酸溶性蛋白1(basp1蛋白)、它们的功能片段以及它们的任何组合。在一些方面中，所述支架y是basp1蛋白或其功能片段。在一些方面中，所述支架x包含如seq id no:401-567中列出的氨基酸序列、其片段以及它们的组合。
[0043]
在一些方面中，所述生物活性分子与所述ev的外表面上的锚定部分和/或支架部分连接。在一些方面中，所述生物活性分子与所述ev的腔表面上的锚定部分和/或支架部分连接。在一些方面中，所述生物活性分子是多肽、肽、多核苷酸(dna和/或rna)、化学化合物或它们的任何组合。在一些方面中，所述生物活性分子是化学化合物。在一些方面中，所述化学化合物是小分子。在一些方面中，所述生物活性分子包括反义寡核苷酸(aso)、sirna、mirna、shrna、核酸或它们的任何组合。在一些方面中，所述生物活性分子包括肽、蛋白质、抗体或其抗原结合片段或它们的任何组合。在一些方面中，所述其抗原结合片段包括scfv、(scfv)2、fab、fab'、f(ab')2、f(ab1)2、fv、dab和fd片段、双功能抗体、抗体相关多肽或它们的任何片段。在一些方面中，所述生物活性分子包括aso。在一些方面中，所述aso靶向转录物，所述转录物是stat6转录物、cebp/β转录物、stat3转录物、kras转录物、nras转录物、nlpr3转录物、pmp22转录物或它们的任何组合。在一些方面中，所述stat6转录物包含seq id no:11或seq id no:13。在一些方面中，所述stat6 aso包含选自由以下组成的组的序列：seq id no:601至seq id no:703。在一些方面中，所述cebp/β转录物包含seq id no:21或seq id no:23。在一些方面中，所述cebp/βaso包含选自由以下组成的组的序列：seq id no:704至seq id no:806。在一些方面中，所述stat3转录物包含seq id no:41或seq id no:43。在一些方面中，所述stat3 aso包含选自由以下组成的组的序列：seq id no:889至seq id no:988。在一些方面中，所述nras转录物包含seq id no:51或seq id no:53。在一些方面中，所述nras aso包含选自由以下组成的组的序列：seq id no:989至seq id no:1088。在一些方面中，所述nlpr3转录物包含seq id no:1或seq id no:3。在一些方面中，所述aso包含选自由以下组成的组的序列：seq id no:101至seq id no:200。在一些方面中，所述kras转录物是kras突变体转录物。在一些方面中，所述kras突变体是kras g12d。在一些方面中，所述kras转录物包含seq id no:31或seq id no:33。在一些方面中，所述aso包含选自由以下组成的组的序列：seq id no:807至seq id no:888。在一些方面中，所述pmp22转录物包含seq id no:58。在一些方面中，所述aso包含选自由以下组成的组的序列：seq id no:62-95和201-270。
[0044]
在一些方面中，所述ev是外泌体。
[0045]
在一些方面中，本公开涉及一种药物组合物，所述药物组合物包含细胞外囊泡和药学上可接受的载体。
[0046]
在一些方面中，本公开涉及一种将生物活性分子缀合至ev的方法，所述方法包括将锚定部分连接至所述ev；一种药盒，所述药盒包括所述ev和使用说明书。
[0047]
在一些方面中，本公开涉及一种治疗或预防有需要的受试者的疾病或病症的方
法，所述方法包括向所述受试者施用所述ev。在一些方面中，所述疾病或病症是癌症、炎症性病症、神经变性病症、中枢神经疾病或代谢疾病。在一些方面中，所述ev静脉内、腹膜内、经鼻、经口、肌内、皮下、胃肠外或肿瘤内施用。
附图说明
[0048]
图1a示出列出靶向nlpr3转录物的各种aso序列的表。所述表包括以下信息(从左至右)：(i)仅针对aso序列指定的seq id编号，(ii)nlpr3基因组序列(seq id no:1)上的目标起始和终止位置，(iii)nlpr3 mrna序列(seq id no:2)上的目标起始和终止位置，(iv)不含任何特定设计或化学结构的aso序列，和(v)具有化学结构的aso序列。aso是从5’至3’。化学结构中的符号是如下：nb表示lna；dn表示dna；5mdc表示5-甲基-dc；nm表示moe；并且s表示硫代磷酸酯。
[0049]
图1b示出列出本文所述的各种stat6 aso序列以及在mrna序列中每一者的互补序列的位置的表。aso是从5’至3’。化学结构中的符号是如下：nb表示lna；dn表示dna；5mdc表示5-甲基-dc；nm表示moe；并且s表示硫代磷酸酯。
[0050]
图1c示出列出本文所述的各种cebp/βaso序列以及在mrna序列中每一者的互补序列的位置的表。aso是从5’至3’。化学结构中的符号是如下：nb表示lna；dn表示dna；5mdc表示5-甲基-dc；nm表示moe；并且s表示硫代磷酸酯。
[0051]
图1d示出列出本文所述的各种stat3 aso序列以及在mrna序列中每一者的互补序列的位置的表。aso是从5’至3’。化学结构中的符号是如下：nb表示lna；dn表示dna；5mdc表示5-甲基-dc；nm表示moe；并且s表示硫代磷酸酯。
[0052]
图1e示出列出本文所述的各种nras aso序列以及在mrna序列中每一者的互补序列的位置的表。aso是从5’至3’。化学结构中的符号是如下：nb表示lna；dn表示dna；5mdc表示5-甲基-dc；nm表示moe；并且s表示硫代磷酸酯。
[0053]
图1f示出列出本文所述的各种kras aso序列以及在前体mrna(seq id no:30)或mrna序列(seq id no:32)中每一者的互补序列的位置的表。aso是从5’至3’。化学结构中的符号是如下：nb表示lna；dn表示dna；5mdc表示5-甲基-dc；nm表示moe；并且s表示硫代磷酸酯。
[0054]
图2a-2c是单核细胞(图2a)、m0巨噬细胞(图2b)和小鼠bmdm(图2c)中的il-1β产生的图形表示。通过用lps处理3小时和atp处理3小时，每种样品类型中的nlrp3途径被活化。然后用递增浓度的mcc950(logμm)处理样品，如所指示，并测量il-1β水平(pg/ml)。
[0055]
图3a是说明用于小鼠的腹膜内lps激发的给药和样品收集时间表的时间线。图3b是在施用递增量的mcc950后小鼠血清中的血清il-1β水平的图形表示。
[0056]
图4a-4d是如通过荧光(mfi)检测并针对pbs对照归一化的cy5水平的图形表示。如所指示，在从血液(图4a)、肝脏(图4b)、脾脏(图4c)和肿瘤(ct26；图4d)分离的各种细胞类型中，cy5用作包含cy5aso的外泌体(“exo aso”；左)或游离aso(右)的摄取的标志物。水平线表示平均mfi。图4e-4j是各自从两个供体取得的骨髓组织样品的荧光图像，示出与pbs阴性对照(图4i-4j)相比，包含cy5-报告基因aso的外泌体(图4e-4f)或游离aso(图4g-4h)的摄取。
[0057]
图5a-5b是在用stat6 exo aso、stat6游离aso或乱序exo aso(阴性对照)处理后，
极化巨噬细胞中stat6(图5a)和cd163(图5b)的归一化基因表达(％)的图形表示，如所指示(图5a-5b)。
[0058]
图5c-5d是在用stat6 exo aso、stat6游离aso或乱序exo aso(阴性对照)处理后，极化巨噬细胞中stat6(图5c)和cd163(图5d)的归一化基因表达(％)的图形表示，如所指示(图5c-5d)。
[0059]
图6a-6j是如所指示，在未处理的或用乱序exo aso、stat6-exo-aso、stat-6游离aso、cebp/β-exo-aso或cebp/β游离aso处理的原代人巨噬细胞中，tgfβ1(图6a)、cd163(图6b)、stat5b(图6c)、stat6(图6d)、cebp/β(图6e)、il12β(图6f)、aif1(图6g)、myc(图6h)、hla dqa(图6i)和cd74(mif)(图6a)的表达的图形表示。
[0060]
图7a-7f是用于分离cd11b
+
细胞的流式细胞术的结果的图形表示。图7a-7c示出处理前(图7a)、在用阴性对照(乱序exo aso；图7b)处理后或用exo-aso(图7c)处理后的cd45表达。图7d-7f示出处理前(图7d)、在用阴性对照(乱序exo aso；图7e)处理后或用exo-aso(图7f)处理后的cd11b表达。
[0061]
图8a-8c是在暴露于乱序exo-aso(图8a-8c)、stat6游离aso(图8a和8c)、cebp/β游离aso(图8b)、stat6-exo-aso(图8a和8c)或cebp/β-exo-aso(图8b-8c)后，与非富集细胞相比，在cd11b富集的细胞中stat6(图8a)、cebp/β(图8b)和arg1(图8c)的表达的图形表示。
[0062]
图9a-9l是如所指示，在用乱序exo aso、stat6-exo-aso、stat-6游离aso或cebp/β-exo-aso处理的cd11b富集的细胞中stat6(图9a)、cebp/β(图9b)、tgfβ1(图9c)、stat3(图9d)、sirp-α(图9e)、cd47(图9f)、nos2(图9g)、arg1(图9h)、cd206(图9i)、cd274(图9j)、nlrp3(图9k)、csf1r(图9l)、cd36(图9m)、stab1(图9n)、il13(图9o)、pi3kg(图9p)、ly6c(图9q)、ly6g(图9r)、ifnβ1(图9s)、ifnγ(图9t)、ifnα1(图9u)和il6rα(图9v)的表达的图形表示。
[0063]
图10a和10c是如所指示，在用il-13/tgfβ处理极化、随后用stat6 exo aso、stat6游离aso或乱序exo aso(阴性对照)处理的原代人m2巨噬细胞中stat6(图10a)和tgfβ1(图10c)的归一化基因表达(％)的图形表示。
[0064]
图10b和10d是如所指示，在用il-13/tgfβ处理极化、随后用cebp/βexo aso、cebp/β游离aso或乱序exo aso(阴性对照)处理的原代人m2巨噬细胞中cebp/β(图10b)和tgfβ1(图10d)的归一化基因表达(％)的图形表示。
[0065]
图11是在向初次接受实验的小鼠或用博莱霉素处理以诱发肺纤维化的小鼠(“bleo”)经鼻施用阴性对照(-c)或exo-aso-cy5(“in”)后，肺td2中如通过cy5水平所证明的外泌体摄取的图形表示。
[0066]
图12a-12h是荧光原位杂交以检测正常肺组织和诱发的纤维化肺组织的外泌体摄取的图像。
[0067]
图13a-13h是原位杂交以检测正常肺组织和诱发的纤维化肺组织的外泌体摄取的图像。
[0068]
图13i是示出原位杂交图像中的饱和水平的图形表示，指示正常组织和纤维化组织中的外泌体摄取的水平。
[0069]
图14a-14f是荧光原位杂交以检测hepa1-6小鼠中肺组织的外泌体摄取的图像。
[0070]
图15a-15f是原位杂交以检测hepa1-6小鼠中肺组织的外泌体摄取的图像。
[0071]
图16a-16j示出使用nras aso的各种ic50实验的结果。
[0072]
图17a-17n示出使用stat3 aso的各种ic50实验的结果。
[0073]
图18示出描绘stat3 aso实验的结果的图，其示出总体mrna耗减。
[0074]
图19示出描绘nras aso实验的结果的图，其示出总体mrna耗减。
[0075]
图20示出使用stat3 exo-aso和stat3游离aso，接种后的肿瘤体积反应曲线。
[0076]
图21示出使用stat3、exo-aso、stat3游离aso和stat3游离aso 2x的stat3基因表达谱反应。
[0077]
图22示出在暴露于pbs、乱序exo-aso、stat3 exo-aso moe和stat3游离aso moe后，浸润mdsc/cd45(cd11b高f40/80高/cd45)的百分比。
[0078]
图23示出在暴露于pbs、乱序exo-aso、stat3 exo-aso moe和stat3游离aso moe后，浸润mdsc/总mdsc(ly6g高cd11b高/ia/ie低)的百分比。
[0079]
图24示出用pbs、乱序exo-aso、stat3 exo-aso和stat3游离aso处理后的归一化mrna计数。
[0080]
图25呈现表，所述表示出每个工程化外泌体所负载的aso分子的量受接头结构影响。还示出所用构建体的结构。
[0081]
图26呈现表，所述表示出每个天然外泌体所负载的aso分子的量受接头结构影响。还示出所用构建体的结构。
[0082]
图27a-27c示出exo-aso的效力受aso接头结构影响。构建体c1-c9、t1-t9和l1-l3的结构是图25中描述的那些。图27a示出具有胆固醇-c6脂质锚的构建体的效力。图27b示出具有生育酚-c8(l1)或生育酚棕榈酸酯-c6(l2和l3)脂质锚的构建体的效力。图27c示出具有胆固醇-teg脂质锚的构建体的效力。
[0083]
图28是示出靶向pmp22的aso分子的序列的表。
[0084]
图29是示出靶向pmp22的aso分子的另外序列的表。
具体实施方式
[0085]
本公开涉及细胞外囊泡(ev)(例如，外泌体)，所述细胞外囊泡包含通过锚定部分与所述ev(例如，外泌体)共价连接的至少一种生物活性分子；以及所述细胞外囊泡的用途。在本公开中示出了各个方面的非限制性实例。
[0086]
在更详细地描述本公开之前，应当理解，本发明不限于所描述的特定组合物或方法步骤，因此此类组合物或方法步骤当然可变化。如本领域的技术人员在阅读本公开之后将显而易见，本文所描述和说明的各个个别方面具有离散组分和特征，所述离散组分和特征可在不脱离本发明的范围或精神的情况下容易地与其它若干方面中的任一者的特征分离或组合。任何叙述的方法均可以叙述的事件的顺序或以在逻辑上可能的任何其它顺序进行。
[0087]
本文提供的标题不限制本公开的各个方面，所述方面可通过参考整个说明书限定。还应理解，本文使用的术语仅出于描述特定方面的目的，并且并不意图是限制性的，因为本公开的范围将仅受所附权利要求限制。
[0088]
因此，通过整体参考说明书，更充分地定义了紧接着在下文中定义的术语。
[0089]
i.定义
[0090]
为了能够更容易地理解本说明书，首先定义某些术语。另外的定义在整个详细描述中阐述。
[0091]
应注意，术语“一个/种(a或an)”实体是指一个/种或多个/种所述实体；例如，“一个核苷酸序列”应理解为表示一个或多个核苷酸序列。因此，术语“一个/种(a或an)”、“一个/种或多个/种”和“至少一个/种”在本文中可互换地使用。应进一步注意，权利要求可拟订成不包括任何任选的要素。因此，此陈述意图用作与权利要求要素的描述联合使用此类排他性术语如“单独地”、“仅仅”等或使用“否定(negative)”限制的在先基础。
[0092]
此外，本文使用的“和/或”应被视为具体地公开两个指定特征或组分中的每个与或不与另一个一起存在。因此，如在诸如“a和/或b”的短语中使用的术语“和/或”旨在包括“a和b”、“a或b”、“a”(单独的)和“b”(单独的)。同样，如在诸如“a、b和/或c”的短语中使用术语“和/或”旨在包括以下方面的每一方面：a、b和c；a、b或c；a或c；a或b；b或c；a和c；a和b；b和c；a(单独的)；b(单独的)；和c(单独的)。
[0093]
应当理解，本文无论在何处用措辞“包含/包括(comprising)”来描述方面，都还提供了以“由
……
组成”和/或“基本上由
……
组成”描述的其它类似方面。
[0094]
除非另有定义，否则本文使用的所有技术和科学术语具有与本公开相关的领域的普通技术人员通常理解的相同的含义。例如，the co ncise dictionary of biomedicine and molecular biology,juo,pei-sh ow，第2版，2002,crc press；the dictionary of cell and molec ular biology，第3版，1999,academic press；和the oxford dictio nary of biochemistry and molecular biology,revised,2000,oxfor d university press为技术人员提供了本公开中使用的许多术语的通用词典。
[0095]
单位、前缀和符号以它们的国际单位制(syst
è
me international de unites)(si)认可的形式表示。数值范围包括定义范围的数值。在列举值范围的情况下，应当理解，还具体公开了所述范围的所列举的上限与下限之间的每个中间整数值及其每个分数，以及此类值之间的每个子范围。任何范围的上限和下限可独立地包括在所述范围内或从所述范围中排除，并且包括两个限值中的任一个、两个限值都不包括或两个限制都包括在内的每个范围也涵盖在本公开中。因此，本文所列举的范围应理解为所述范围内所有值(包括所列举端点)的简写。例如，1至10的范围被理解为包括来自由1、2、3、4、5、6、7、8、9和10组成的组中的任何数值、数值组合或子范围。
[0096]
在明确列举值的情况下，应当理解，与所列举的值大致相同的数量或量的值也在本公开的范围内。在公开了组合的情况下，所述组合的要素的每个子组合也具体地公开并且在本公开的范围内。相反，在单独公开不同要素或要素组的情况下，还公开了所述要素或要素组的组合。在本公开的任何要素被公开为具有多个替代方案的情况下，特此还公开了其中每个替代方案单独地或与其它替代方案组合被排除在外的本公开的实施例；本公开的多于一个要素可具有此类排除，并且特此公开了具有此类排除的要素的所有组合。
[0097]
核苷酸以其普遍接受的单字母代码提及。除非另有说明，否则核苷酸序列从左至右以5’至3’方向书写。核苷酸在本文中以其由iupac-iub生物化学命名委员会推荐的众所周知的单字母符号提及。因此，a代表腺嘌呤，c代表胞嘧啶，g代表鸟嘌呤，t代表胸腺嘧啶，u代表尿嘧啶。
[0098]
氨基酸序列从左至右以氨基至羧基的取向书写。氨基酸在本文中通过其通常已知
的三字母符号或通过由iupac-iub生物化学命名委员会所推荐的单字母符号提及。
[0099]
术语“约”在本文中用于意指近似、大致、约或在
……
左右。当术语“约”与数值范围结合使用时，它通过使边界延伸高于和低于所述数值来修饰所述范围。一般来说，术语“约”可通过例如向上或向下(升高或降低)10％的变化修饰高于或低于所述值的数值。
[0100]
术语“施用(administration)”、“施用(administering)”及其语法变体是指通过药学上可接受的途径将组合物如本公开的ev(例如，外泌体)引入受试者。通过任何合适的途径将组合物如本公开的ev(例如，外泌体)引入受试者，所述途径包括肿瘤内、经口、经肺、鼻内、胃肠外(静脉内、动脉内、肌内、腹膜内或皮下)、经直肠、淋巴管内、鞘内、眼周或局部途径。施用包括自我施用和由另外的人施用。合适的施用途径允许组合物或剂执行其预期功能。例如，如果合适的途径是静脉内途径，则通过将组合物或剂引入受试者的静脉来施用组合物。
[0101]
如本文所用，术语“激动剂”是指结合至受体并活化受体以产生生物反应的分子。受体可被内源性或外源性激动剂活化。内源性激动剂的非限制性实例包括激素、神经递质和环状二核苷酸。外源性激动剂的非限制性实例包括药物、小分子和环状二核苷酸。激动剂可以是完全激动剂、部分激动剂或反向激动剂。
[0102]
术语“氨基酸取代”是指用另一氨基酸残基置换亲本或参考序列(例如，野生型序列)中存在的氨基酸残基。氨基酸可在亲本或参考序列(例如，野生型多肽序列)中例如经由化学肽合成或通过本领域中已知的重组方法被取代。因此，提及“位置x处的取代”是指位置x处存在的氨基酸被替代氨基酸残基取代。在一些方面中，取代模式可根据图式any描述，其中a是对应于位置n处天然或原始存在的氨基酸的单字母代码，并且y是取代氨基酸残基。在其它方面中，取代模式可根据图式an(yz)描述，其中a是对应于取代位置n处天然或原始存在的氨基酸的氨基酸残基的单字母代码，并且y和z是可替代a的替代取代氨基酸残基。
[0103]
如本文所用，术语“拮抗剂”是指阻断或抑制激动剂介导的反应的分子，而不是在与受体结合时自身引发生物反应的分子。许多拮抗剂通过与受体上结构限定的结合位点处的内源性配体或底物竞争来实现其效力。拮抗剂的非限制性实例包括α阻断剂、β阻断剂和钙通道阻断剂。拮抗剂可以是竞争性拮抗剂、非竞争性拮抗剂或无竞争性拮抗剂。
[0104]
如本文所用，术语“抗体”涵盖免疫球蛋白(无论是天然产生的还是部分或完全合成产生的)及其片段。所述术语还覆盖具有与免疫球蛋白结合结构域同源的结合结构域的任何蛋白质。“抗体”还包括多肽，所述多肽包含来自免疫球蛋白基因或其片段的特异性结合和识别抗原的框架区。术语抗体的使用意在包括完全抗体、多克隆抗体、单克隆抗体和重组抗体、它们的片段，并且还包括单链抗体、人源化抗体、鼠抗体、嵌合单克隆抗体、小鼠-人单克隆抗体、小鼠-灵长类动物单克隆抗体、灵长类动物-人单克隆抗体、抗独特型抗体、抗体片段(诸如，例如scfv、(scfv)2、fab、fab'和f(ab')2、f(ab1)2、fv、dab和fd片段)、双功能抗体和抗体相关多肽。抗体包括双特异性抗体和多特异性抗体，只要它们表现出所需的生物活性或功能即可。在本公开的一些方面中，生物活性分子是抗体或包含其抗原结合片段的分子。
[0105]
术语“抗体-药物缀合物”和“adc”可互换使用，并且是指与一种或多种治疗剂(有时在本文中称为剂、药物或活性药物成分)例如共价连接的抗体。在本公开的一些方面中，生物活性分子是抗体-药物缀合物。c1-8
烷基或芳基。
[0115]
术语“c
3-8
碳环基(carbocyclo)”是指其中碳环的一个或多个氢原子被键替代的上文定义的c
3-8
碳环基团。
[0116]
术语“c
3-8
杂环”是指芳族或非芳族c
3-8
碳环，其中一至四个环碳原子独立地被选自由o、s和n组成的组的杂原子替代。c
3-8
杂环的代表性实例包括但不限于苯并呋喃基、苯并噻吩、吲哚基、苯并吡唑基、香豆素基、异喹啉基、吡咯基、噻吩基、呋喃基、噻唑基、咪唑基、吡唑基、三唑基、喹啉基、嘧啶基、吡啶基、吡啶酮基、吡嗪基、哒嗪基、异噻唑基、异噁唑基和四唑基。c
3-8
杂环可以是未取代的或被包括但不限于以下的至多七个基团取代：-c
1-8
烷基、-o-(c
1-8
烷基)、-芳基、-c(o)r'、-oc(o)r'、-c(o)or'、-c(o)nh2、-c(o)nhr'、-c(o)n(r')
2-、-nhc(o)r'、-s(o)2r'、-s(o)r'、-oh、-卤素、-n3、-nh2、-nh(r')、-n(r')2和
–
cn，其中每个r'独立地是h、-c
1-8
烷基或芳基。
[0117]
术语“c
3-8
杂环基(heterocyclo)”是指其中杂环基团的一个氢原子被键替代的上文定义的c
3-8
杂环基团。c
3-8
杂环基可以是未取代的或被包括但不限于以下的至多六个基团取代：-c
1-8
烷基、-o-(c
1-8
烷基)、-芳基、-c(o)r'、-oc(o)r'、-c(o)or'、-c(o)nh2、-c(o)nhr'、-c(o)n(r')
2-、-nhc(o)r'、-s(o)2r'、-s(o)r'、-oh、-卤素、-n3、-nh2、-nh(r')、-n(r')2和
–
cn，其中每个r'独立地是h、-c
1-8
烷基或芳基。
[0118]“保守氨基酸取代”是其中氨基酸残基被具有相似侧链的氨基酸残基替代的一种氨基酸取代。本领域已经定义了具有相似侧链的氨基酸残基家族，包括碱性侧链(例如，赖氨酸、精氨酸、组氨酸)、酸性侧链(例如，天冬氨酸、谷氨酸)、不带电荷的极性侧链(例如，甘氨酸、天冬酰胺、谷氨酰胺、丝氨酸、苏氨酸、酪氨酸、半胱氨酸)、非极性侧链(例如，丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、脯氨酸、苯丙氨酸、甲硫氨酸、色氨酸)、β-支链侧链(例如，苏氨酸、缬氨酸、异亮氨酸)和芳香族侧链(例如，酪氨酸、苯丙氨酸、色氨酸、组氨酸)。因此，如果多肽中的氨基酸被来自同一侧链家族的另一种氨基酸替代，则所述取代被认为是保守的。在另一个方面中，氨基酸串可被在侧链家族成员的顺序和/或组成上不同的结构相似的串保守地替代。
[0119]
如本文所使用，术语“保守的”是指分别在所比较的两个或更多个序列的相同位置上未发生改变的多核苷酸序列或多肽序列的核苷酸或氨基酸残基。相对保守的核苷酸或氨基酸是在较为相关的序列之间比出现于序列的其它地方的核苷酸或氨基酸保守的那些核苷酸或氨基酸。
[0120]
在一些方面中，如果两个或更多个序列彼此100％同一，则它们被称为“完全保守的”。在一些方面中，如果两个或更多个序列彼此至少70％同一、至少80％同一、至少90％同一或至少95％同一，则它们被称为“高度保守的”。在一些方面中，如果两个或更多个序列彼此约70％同一、约80％同一、约90％同一、约95％、约98％或约99％同一，则它们被称为“高度保守的”。在一些方面中，如果两个或更多个序列彼此至少30％同一、至少40％同一、至少50％同一、至少60％同一、至少70％同一、至少80％同一、至少90％同一或至少95％同一，则它们被称为“保守的”。在一些方面中，如果两个或更多个序列彼此约30％同一、约40％同一、约50％同一、约60％同一、约70％同一、约80％同一、约90％同一、约95％同一、约98％同一或约99％同一，则它们被称为“保守的”。序列的保守可适用于多核苷酸或多肽的整个长度或者可适用于其部分、区或特征。
[0121]
如本文所用，术语“常规ev蛋白”是指先前已知富含ev的蛋白质。
[0122]
如本文所用，术语“常规外泌体蛋白”是指先前已知富集于外泌体中的蛋白质，所述蛋白质包括但不限于cd9、cd63、cd81、pdgfr、gpi锚蛋白、乳凝集素lamp2和lamp2b、它们的片段、或与它们结合的肽。
[0123]
如本文所用的术语“衍生物”是指已进行化学修饰以引入反应性马来酰亚胺基团或易于与马来酰亚胺基团反应的硫醇基团的ev(例如，外泌体)组分(例如蛋白质，如支架x和/或支架y、脂质或碳水化合物)或生物活性分子(例如，多肽、多核苷酸、脂质、碳水化合物、抗体或其片段、protac等)。例如，用包含(i)例如与游离氨基反应的基团和(ii)马来酰亚胺基团的双官能试剂修饰的抗体可产生抗体衍生物，所述抗体衍生物包含可与ev(例如，外泌体)上的支架x蛋白中的游离硫醇基团反应的反应性马来酰亚胺基团。相反，ev(例如，外泌体)上的支架x可用包含(i)例如与游离氨基反应的基团和(ii)马来酰亚胺基团的双官能试剂修饰，从而产生支架x衍生物，所述支架x衍生物包含可与生物活性分子(例如抗体)中的游离硫醇基团反应的反应性马来酰亚胺基团。
[0124]
术语“赋形剂”和“载体”可互换施用并且是指添加至药物组合物中以进一步促进化合物施用的惰性物质。
[0125]
如本文所用，术语“细胞外囊泡”、“ev”及其语法变体可互换使用，并且是指包含包封内部空间的膜的细胞来源的囊泡。细胞外囊泡包括直径小于其所源自的细胞的直径的所有膜结合的囊泡(例如，外泌体、纳米囊泡)。在一些方面中，细胞外囊泡的直径在20nm至1000nm的范围内，并且可包含在内部空间(即，腔)内、展示在细胞外囊泡的外表面上和/或跨膜的各种大分子有效载荷。在一些方面中，有效载荷可包括核酸、蛋白质、碳水化合物、脂质、小分子和/或它们的组合。在某些方面中，细胞外囊泡包含支架部分。举例而言并且非限制性地，细胞外囊泡包括凋亡小体、细胞片段、通过直接或间接操纵(例如，通过连续挤出或用碱性溶液进行的处理)而来源于细胞的囊泡、含有小囊的胞器和由活细胞产生(例如，通过直接质膜出芽(plasma membrane budding)或晚期内体与质膜的融合)的囊泡。细胞外囊泡可源自活的或死的生物体、外植组织或器官、原核或真核细胞和/或培养的细胞。在一些方面中，细胞外囊泡由表达一种或多种转基因产物的细胞产生。
[0126]
如本文所用，术语“外泌体”是指直径介于20-300nm之间(例如，介于40-200nm之间)的细胞外囊泡。外泌体包含包封内部空间(即，腔)的膜，并且在一些方面中，可通过直接质膜出芽或通过晚期内体与质膜的融合而从细胞(例如，生产细胞)生产。在某些方面中，外泌体包含支架部分。如下文所描述，外泌体可来源于生产细胞，并且基于其大小、密度、生物化学参数或它们的组合从生产细胞中分离。在一些方面中，本公开的外泌体由表达一种或多种转基因产物的细胞产生。
[0127]
在一些方面中，通过经由锚定部分将至少一种生物活性分子(例如，诸如抗体或adc的蛋白质、诸如反义寡核苷酸的rna或dna、小分子药物、毒素)共价连接至本公开的ev(例如外泌体，例如纳米囊泡)来对所述ev(例如外泌体，例如纳米囊泡)进行工程化。
[0128]
在一些方面中，本公开的ev(例如外泌体或纳米囊泡)可包含在内部空间(即，腔)内、展示在ev的外(external/exterior)表面或内(腔)表面上和/或跨膜的各种大分子有效载荷。在一些方面中，有效载荷可包括例如核酸、蛋白质、碳水化合物、脂质、小分子和/或它们的组合。在某些方面中，ev(例如，外泌体)包含支架部分(例如，支架x)。细胞外囊泡(例
如，外泌体)可源自活的或死的生物体、外植组织或器官、原核或真核细胞和/或培养的细胞。在一些方面中，ev(例如，外泌体)由表达一种或多种转基因产物的细胞产生。在其它方面中，本公开的ev是但不限于纳米囊泡、微粒体、微囊泡、细胞外体或凋亡小体。
[0129]
如本文所用，术语蛋白质(例如，生物活性分子如治疗性蛋白质，或支架蛋白如支架x或支架y)的“片段”是指蛋白质的氨基酸序列，所述氨基酸序列比天然存在的序列短，与天然存在的蛋白质相比，蛋白质的n和/或c末端缺失或任何部分缺失。
[0130]
如本文所用，术语“功能片段”是指保留蛋白质功能的蛋白质片段。因此，在一些方面中，支架蛋白(例如，支架x蛋白)的功能片段保留通过马来酰亚胺部分将生物活性分子锚定在ev(例如，外泌体)的腔表面上或外表面上的能力。类似地，在某些方面中，支架y蛋白的功能片段保留将部分锚定在ev(例如，外泌体)的腔表面上的能力。
[0131]
片段是否是功能片段可通过任何本领域已知的测定ev(例如，外泌体)的蛋白质含量的方法来评估，所述方法包括蛋白质印迹、facs分析和片段与自发荧光蛋白(如例如gfp)的融合。在某些方面中，支架x蛋白的功能片段保留了天然存在的支架x蛋白的例如至少约50％、至少约60％、至少约70％、至少约80％、至少约90％或至少约100％的通过马来酰亚胺部分将生物活性分子锚定在ev(例如，外泌体)的腔表面上或外表面上的能力。
[0132]
如本文所用，通过支架蛋白将生物活性分子“锚定”在本公开的ev(例如，外泌体)的腔表面或外表面上是指将生物活性分子共价连接至支架分子的分别位于ev(例如，外泌体)的腔表面或外表面上的部分。
[0133]
在某些方面中，支架y蛋白的功能片段保留了天然存在的支架y蛋白的例如至少约50％、至少约60％、至少约70％、至少约80％、至少约90％或至少约100％的将部分锚定在ev(例如，外泌体)的腔表面上的能力。
[0134]
如本文所使用，术语“同源性”是指聚合物分子之间，例如核酸分子(例如，dna分子和/或rna分子)之间和/或多肽分子之间的总体相关性。一般来说，术语“同源性”意味着两个分子之间的进化关系。因此，同源的两个分子将具有共同的进化祖先。在本公开的上下文中，术语同源性涵盖同一性和相似性两者。
[0135]
在一些方面中，如果聚合物分子中至少25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％或99％的单体是相同的(完全相同的单体)或相似的(保守取代)，则认为所述分子是彼此“同源的”。术语“同源的”必定是指至少两个序列(多核苷酸序列或多肽序列)之间的比较。
[0136]
在本公开的上下文中，取代(即使当它们被称为氨基酸取代时)在核酸水平下进行，即用替代氨基酸残基取代氨基酸残基通过用编码第二氨基酸的密码子取代编码第一氨基酸的密码子来进行。
[0137]
如本文所用，术语“同一性”是指聚合物分子之间，例如多肽分子或多核苷酸分子(例如dna分子和/或rna分子)之间的总体单体保守性。没有任何额外限定符的术语“同一的”，例如蛋白质a与蛋白质b同一，意味着序列是100％同一的(100％序列同一性)。将两个序列描述为例如“70％同一”等同于将它们描述为具有例如“70％序列同一性”。
[0138]
两个多肽序列的同一性百分比的计算例如可通过出于最佳比较目的比对两个序列来进行(例如，为了最佳比对可将空位引入第一和第二多肽序列之一或两者中并且出于比较目的可忽视不相同的序列)。在某些方面中，出于比较目的比对的序列的长度是参考序
列的长度的至少30％、至少40％、至少50％、至少60％、至少70％、至少80％、至少90％、至少95％或100％。然后比较相应氨基酸位置的氨基酸。
[0139]
当第一序列中的位置被与第二序列中的相应位置相同的氨基酸占据时，则分子在所述位置处是相同的。两个序列之间的同一性百分比是将为了两个序列的最优比对而需要引入的空位的数目和每个空位隙的长度考虑在内，由所述序列共有的相同位置的数目的函数。两个序列之间的序列比较和同一性百分比的确定可使用数学算法来完成。
[0140]
合适的软件程序可从各种来源获得，并且用于蛋白质和核苷酸序列的比对。用于确定序列同一性百分比的一种合适的程序是bl2seq，其为可从美国政府国家生物技术信息中心blast网址(blast.ncbi.nlm.nih.gov)获得的blast程序套件的一部分。bl2seq使用blastn或blastp算法进行两个序列之间的比较。blastn用于比较核酸序列，而blastp用于比较氨基酸序列。其它合适的程序是例如needle、stretcher、water或matcher，其为生物信息学程序的emboss套件的一部分，并且也可从欧洲生物信息学研究所(ebi)在www.ebi.ac.uk/tools/psa获得。
[0141]
序列比对可使用本领域中已知的方法如mafft、clustal(clustalw、clustal x或clustal omega)、muscle等来进行。
[0142]
与多核苷酸或多肽参考序列比对的单个多核苷酸或多肽靶序列内的不同区域可各自具有其自己的序列同一性百分比。应注意，序列同一性百分比值四舍五入至最接近的十分位。例如，80.11、80.12、80.13和80.14向下舍入到80.1，而80.15、80.16、80.17、80.18和80.19向上舍入到80.2。还应注意，长度值将始终是整数。
[0143]
在某些方面中，第一氨基酸序列(或核酸序列)与第二氨基酸序列(或核酸序列)的同一性百分比(％id)被计算为％id＝100x(y/z)，其中y是在第一序列和第二序列的比对中评分为相同匹配的氨基酸残基(或核碱基)的数目(如通过目视检查或特定序列比对程序所比对)，并且z是第二序列中的残基总数。如果第一序列的长度长于第二序列，则第一序列与第二序列的同一性百分比将高于第二序列与第一序列的同一性百分比。
[0144]
本领域技术人员将理解，用于计算序列同一性百分比的序列比对的生成不限于仅由一级序列数据驱动的二进制序列-序列比较。还应理解，序列比对可通过将序列数据与来自异构源的数据如结构数据(例如，晶体学蛋白质结构)、功能数据(例如，突变的位置)或系统发育数据整合而产生。整合异构数据以生成多重序列比对的合适程序是可在www.tcoffee.org获得且可替代地可例如从ebi获得的t-coffee。还应理解，用于计算百分比序列同一性的最终比对可自动地或人工地加以验证。
[0145]
如本文所用，术语“免疫调节剂”是指作用于与ev(例如，外泌体)接触的靶标(例如，靶细胞)并调控免疫系统的剂。可被引入ev(例如，外泌体)和/或生产细胞中的免疫调节剂的非限制性实例包括诸如检查点抑制剂的调节剂、检查点抑制剂的配体、细胞因子、其衍生物或它们的任何组合的剂。免疫调节剂还可包括激动剂、拮抗剂、抗体、抗原结合片段、多核苷酸(如sirna、mirna、lncrna、mrna或dna)或小分子。在本公开的一些方面中，生物活性分子是免疫调节剂。
[0146]
如本文所用，“免疫反应”是指脊椎动物体内针对外来因子或异常例如癌细胞的生物反应，所述反应保护生物体免受这些因子和由它们引起的疾病。免疫反应由免疫系统的一种或多种细胞(例如，t淋巴细胞、b淋巴细胞、自然杀伤(nk)细胞、巨噬细胞、嗜酸性粒细
胞、肥大细胞、树突细胞或嗜中性粒细胞)和由这些细胞中的任一者或肝脏产生的可溶性大分子(包括抗体、细胞因子和补体)的作用，所述作用导致侵入病原体、感染病原体的细胞或组织、癌细胞或其它异常细胞、或者在自身免疫性或病理性炎症的情况下正常人细胞或组织的选择性靶向、结合、损伤、破坏和/或从脊椎动物体内清除。免疫反应(immune reaction)包括例如t细胞，例如效应t细胞、th细胞、cd4+细胞、cd8+t细胞或treg细胞的活化或抑制，或免疫系统的任何其它细胞(例如nk细胞)的活化或抑制。因此，免疫反应可包括体液免疫反应(例如，由b细胞介导)、细胞免疫反应(例如，由t细胞介导)或体液免疫反应和细胞免疫反应两者。在本公开的一些方面中，生物活性分子是能够引发免疫反应的分子。
[0147]
在一些方面中，免疫反应是“抑制性”免疫反应。抑制性免疫反应是阻断或减少刺激物(例如抗原)的效应的免疫反应。在某些方面中，抑制性免疫反应包括产生针对刺激物的抑制性抗体。在一些方面中，免疫反应是“刺激性”免疫反应。刺激性免疫反应是导致产生可破坏和清除靶抗原(例如，肿瘤抗原或病毒)的效应细胞(例如，细胞毒性t淋巴细胞)的免疫反应。
[0148]
如本文所用的术语“免疫缀合物”是指包含结合分子(例如，抗体)和化学缀合至所述结合分子的一个或多个部分(例如，治疗或诊断部分)的化合物。一般而言，免疫缀合物由以下通式定义：a-(l-m)n，其中a是结合分子(例如，抗体)，l是任选的接头，并且m是异源部分，所述异源部分可以是例如治疗剂、可检测标记等，并且n是整数。在一些方面中，多个异源部分可化学缀合至同一结合分子(例如抗体)中的不同连接点。在其它方面中，多个异源部分可级联并连接至结合分子(例如抗体)中的连接点。在一些方面中，多个异源部分(相同或不同)可与结合分子(例如抗体)缀合。
[0149]
免疫缀合物还可通过所述通式以相反顺序来定义。在一些方面中，免疫缀合物是“抗体-药物缀合物”(“adc”)。在本公开的上下文中，术语“免疫缀合物”不限于化学或酶促缀合物分子。如本公开中使用的术语“免疫缀合物”还包括遗传融合。在本公开的一些方面中，生物活性分子是免疫缀合物。
[0150]
如本文所用，术语“分离的”、“纯化的”、“提取的”及其语法变体可互换使用并且是指已进行一个或多个纯化过程(例如所需ev(例如，外泌体)制剂的选择或富集)的所需ev(例如，多个已知或未知量和/或浓度的ev)的制剂状态。在一些方面中，如本文所用的分离或纯化是从含有生产细胞的样品中除去、部分除去(例如，一部分)ev(例如，外泌体)的过程。在一些方面中，分离的ev(例如，外泌体)组合物没有可检测的不希望的活性，或者可替代地，不希望的活性的水平或量处于或低于可接受的水平或量。在其它方面中，分离的ev(例如，外泌体)组合物的所需ev(例如，外泌体)的量和/或浓度处于或高于可接受的量和/或浓度。在其它方面中，与从其中获得组合物的起始材料(例如，生产细胞制剂)相比，分离的ev(例如，外泌体)组合物得到富集。这种富集可以是与起始材料相比，富集至少约10％、至少约20％、至少约30％、至少约40％、至少约50％、至少约60％、至少约70％、至少约80％、至少约90％、至少约95％、至少约96％、至少约97％、至少约98％、至少约99％、至少约99.9％、至少约99.99％、至少约99.999％、至少约99.9999％或大于99.9999％。在一些方面中，分离的ev(例如，外泌体)制剂基本上不含残留生物产物。在一些方面中，分离的ev(例如，外泌体)制剂100％不含、至少约99％不含、至少约98％不含、至少约97％不含、至少约96％不含、至少约95％不含、至少约94％不含、至少约93％不含、至少约92％不含、至少约
91％不含或至少约90％不含任何污染性生物物质。残留生物产物可包括非生物物质(包括化学物质)或不想要的核酸、蛋白质、脂质或代谢物。基本上不含残留生物产物也可意味着ev(例如，外泌体)组合物不含可检测的生产细胞，并且仅ev(例如，外泌体)是可检测的。
[0151]
术语“连接的”、“融合的”及其语法变体可互换使用，并且是指分别与第二部分(例如，第二氨基酸序列或核苷酸序列)共价或非共价连接的第一部分(例如，第一氨基酸序列或核苷酸序列)。第一部分可直接连接至第二部分或与第二部分并置，或者可替代地插入部分可将第一部分共价连接至第二部分。术语“连接(linked)”不仅意指第一部分与第二部分在c末端或n末端的融合，而且包括将整个第一部分(或第二部分)插入第二部分(或第一部分，对应地)中的任何两个点(例如，氨基酸)中。在一个方面中，第一部分通过肽键或接头与第二部分连接。第一部分可通过磷酸二酯键或接头与第二部分连接。接头可以是肽或多肽(对于多肽链)或核苷酸或核苷酸链(对于核苷酸链)或任何化学部分(对于多肽或多核苷酸链或任何化学分子)。术语“连接”也用连字符(-)表示。在一些方面中，ev(例如，外泌体)上的支架x蛋白可通过马来酰亚胺部分与生物活性分子连接或融合。
[0152]
如本文所用，术语“腔工程化ev”是指以下ev(例如，外泌体)：ev(例如，外泌体)的膜或腔的腔表面在其组成方面进行了修饰，以使得工程化ev(例如，外泌体)的腔表面或腔不同于修饰前ev(例如，外泌体)或天然存在的ev(例如，外泌体)的腔表面或腔。
[0153]
工程化可直接在腔(即，ev内的空隙)中或在ev(例如，外泌体)的膜中，特别是在ev的腔表面中进行，以使得ev(例如，外泌体)的腔和/或腔表面被改变。例如，将膜在其蛋白质、脂质、小分子、碳水化合物等的组成方面进行修饰，以使得ev(例如，外泌体)的腔表面得到修饰。类似地，可修饰腔中的内容物。可通过化学、物理或生物学方法或通过由先前通过化学、物理或生物学方法进行修饰的细胞产生来改变组成。具体地，可通过遗传工程化或通过由先前通过遗传工程化进行修饰的细胞产生来改变组成。在一些方面中，腔工程化ev(例如，腔工程化外泌体)包含外源性蛋白质(即，ev(例如，外泌体)不天然表达的蛋白质)或其片段或变体，所述外源性蛋白质或其片段或变体可暴露于ev(例如，外泌体)的腔表面或腔上，或者可以是暴露于ev(例如，外泌体)的内层上的部分的锚定点(连接)。在其它方面中，腔工程化ev(例如，腔工程化外泌体)包含天然ev(例如，外泌体)蛋白质(例如，支架x或支架y)或其片段或变体的更高表达，所述蛋白质或其片段或变体可暴露于ev(例如，外泌体)的腔，或者可以是暴露于ev(例如，外泌体)的腔表面上的部分的锚定点(连接)。
[0154]
如本文所用，术语“大分子”是指核酸、蛋白质、脂质、碳水化合物、代谢物或它们的组合。
[0155]
如本文所用，术语“大分子”是指核酸、蛋白质、脂质、碳水化合物、代谢物或它们的组合。
[0156]
术语“经修饰的”当在本文所述的ev(例如，外泌体)的背景中使用时，是指ev(例如外泌体和/或其生产细胞)的改变或工程化，以使得经修饰的ev(例如，外泌体)不同于天然存在的ev(例如，外泌体)。在一些方面中，本文所述的经修饰的ev(例如，外泌体)包含与天然存在的ev(例如，外泌体)的膜相比，在蛋白质、脂质、小分子、碳水化合物等的组成方面不同的膜。例如，所述膜包含更高密度或数量的天然ev(例如，外泌体)蛋白质和/或膜包含不天然存在于ev(例如，外泌体)中的蛋白质。在某些方面中，对膜的此类修饰改变ev(例如，外泌体)(例如，本文所述的表面工程化ev和外泌体)的外表面。在某些方面中，对膜的此类修
饰改变ev(例如，外泌体)(例如，本文所述的腔工程化ev和外泌体)的腔表面。
[0157]
如本文所用，术语“经修饰的蛋白质”或“蛋白质修饰”是指与蛋白质的非突变氨基酸序列具有至少15％同一性的蛋白质。蛋白质的修饰包括蛋白质的片段或变体。蛋白质的修饰还可包括对蛋白质的片段或变体的化学或物理修饰。
[0158]
如本文所用，术语“调节”、“修饰”及其语法变体当应用于特定浓度、水平、表达、功能或行为时，通常是指通过增加或降低，例如直接地或间接地促进/刺激/上调或干扰/抑制/下调特定浓度、水平、表达、功能或行为进行改变的能力，诸如，例如以充当拮抗剂或激动剂。在一些情况下，调节剂可相对于对照、或相对于通常可预期的平均活性水平、或相对于对照活性水平，增加和/或降低特定浓度、水平、活性或功能。
[0159]
如本文所用，术语“纳米囊泡”是指直径介于20-250nm之间(例如，介于30-150nm之间)的细胞外囊泡，并且通过直接或间接操纵由细胞(例如，生产细胞)产生，以使得在无操纵的情况下所述细胞将不产生纳米囊泡。为了产生纳米囊泡而对细胞进行的适当操纵包括但不限于连续挤出、用碱性溶液进行的处理、超声处理或它们的组合。在一些方面中，纳米囊泡的产生可导致生产细胞的破坏。在一些方面中，本文所述的纳米囊泡群体基本上不含通过从质膜直接出芽或晚期内体与质膜融合的方式而来源于细胞的囊泡。在某些方面中，纳米囊泡包含支架部分，例如支架x和/或支架y。纳米囊泡，一旦来源于生产细胞，就可基于其大小、密度、生物化学参数或它们的组合从生产细胞中分离。
[0160]
如本文所用，术语“有效载荷”是指作用于与本公开的ev(例如，外泌体)接触的靶标(例如，靶细胞)的生物活性分子(例如，治疗剂)。可引入到ev(例如，外泌体)中的有效载荷的非限制性实例包括治疗剂，诸如核苷酸(例如，包含可检测部分或毒素或破坏转录的核苷酸)、核酸(例如，编码诸如酶的多肽的dna或mrna分子，或具有调控功能的rna分子诸如mirna、dsdna、lncrna和sirna)、氨基酸(例如，包含可检测部分或毒素或破坏翻译的氨基酸)、多肽(例如，酶)、脂质、碳水化合物和小分子(例如，小分子药物和毒素)。在某些方面中，有效载荷包含抗原。如本文所用，术语“抗原”是指当引入受试者时引发针对自身的免疫反应(细胞或体液)的任何剂。在一些方面中，有效载荷分子通过马来酰亚胺部分共价连接至ev(例如，外泌体)。在其它方面中，有效载荷包含佐剂。
[0161]
术语“药学上可接受的载体”或“药学上可接受的赋形剂”及其语法变化形式涵盖美国联邦政府的监管机构批准的或美国药典中列出的用于包括人在内的动物的任何剂，以及不会导致产生以至于禁止向受试者施用所述组合物的程度的不希望的生理效应并且不会消除所施用的化合物的生物活性和性质的任何载体或稀释剂。包括可用于制备药物组合物并且通常是安全、无毒且合乎需要的赋形剂和载体。
[0162]
如本文所用，术语“药物组合物”是指本文所述的一种或多种化合物，诸如(例如)与一种或多种其它化学组分诸如药学上可接受的载体和赋形剂混合或掺混或悬浮在其中的本公开的ev(如外泌体)。药物组合物的一个目的是促进ev(例如，外泌体)制剂至受试者的施用。
[0163]
如本文所用的术语“多核苷酸”是指任何长度的核苷酸聚合物，包括核糖核苷酸、脱氧核糖核苷酸、其类似物或其混合物。此术语是指分子的一级结构。因此，所述术语包括三链、双链和单链脱氧核糖核酸(“dna”)，以及三链、双链和单链核糖核酸(“rna”)。它还包括修饰(例如通过烷基化和/或通过加帽)和未修饰形式的多核苷酸。更特别地，术语“多核
苷酸”包括聚脱氧核糖核苷酸(含有2-脱氧-d-核糖)；聚核糖核苷酸(含有d-核糖)，包括trna、rrna、hrna、sirna和mrna，无论是剪接的还是未剪接的；为嘌呤或嘧啶碱基的n-或c-糖苷的任何其它类型的多核苷酸；以及含有正核苷酸主链的其它聚合物，例如聚酰胺(例如，肽核酸“pna”)和聚吗啉代聚合物；以及其它合成的序列特异性核酸聚合物，条件是所述聚合物含有呈允许碱基配对和碱基堆积，如在dna和rna中发现的构型的核碱基。在本公开的一些方面中，通过马来酰亚胺部分连接至ev(例如，外泌体)的生物活性分子是多核苷酸，例如反义寡核苷酸。在特定方面中，多核苷酸包含mrna。在另一方面中，mrna是合成mrna。在一些方面中，合成mrna包含至少一个非天然核碱基。在一些方面中，某一类别的所有核碱基已被非天然核碱基替代(例如，本文公开的多核苷酸中的所有尿苷都可被非天然核碱基，例如5-甲氧基尿苷替代)。在本公开的一些方面中，生物活性分子是多核苷酸。
[0164]
术语“多肽”、“肽”和“蛋白质”在本文中可互换使用以指任何长度的氨基酸聚合物。所述聚合物可包含经修饰的氨基酸。所述术语还涵盖已经天然地或通过干预修饰的氨基酸聚合物；例如二硫键形成、糖基化、脂化、乙酰化、磷酸化或任何其它操纵或修饰，诸如与标记组分缀合。定义中还包括例如含有一种或多种氨基酸类似物(包括，例如非天然氨基酸，诸如高半胱氨酸、鸟氨酸、对乙酰基苯丙氨酸、d-氨基酸和肌酸)以及本领域已知的其它修饰的多肽。在本公开的一些方面中，经由马来酰亚胺部分与ev(例如，外泌体)连接的生物活性分子是多肽，例如抗体或其衍生物，如adc、protac、毒素、融合蛋白或酶。
[0165]
如本文所用，术语“多肽”是指具有任何大小、结构或功能的蛋白质、多肽和肽。多肽包括基因产物、天然存在的多肽、合成多肽、同源物、直向同源物、横向同源物、前述的片段和其它等效物、变体和类似物。多肽可以是单个多肽或者可以是多分子复合物，如二聚物、三聚物或四聚物。它们还可包含单链或多链多肽。最常见地，二硫键存在于多链多肽中。术语多肽还可应用于氨基酸聚合物，其中一个或多个氨基酸残基是相应的天然存在的氨基酸的人工化学类似物。在一些方面中，“肽”可小于或等于50个氨基酸长，例如约5、10、15、20、25、30、35、40、45或50个氨基酸长。
[0166]
如本文所使用的术语“预防(prevent)”、“预防(preventing)”及其变体是指部分或完全延迟疾病、病症和/或疾患的发作；部分或完全延迟特定疾病、病症和/或疾患的一种或多种症状、特征或临床表现的发作；部分或完全延迟特定疾病、病症和/或疾患的一种或多种症状、特征或表现的发作；部分或完全延迟从特定疾病、病症和/或疾患的进展；和/或降低发展与疾病、病症和/或疾患相关的病理的风险。在一些方面中，通过防治性治疗来实现预防结果。
[0167]
如本文所用，术语“生产细胞”是指用于产生ev(例如，外泌体)的细胞。生产细胞可以是体外培养的细胞，或者是体内细胞。生产细胞包括但不限于已知可有效产生ev(例如，外泌体)的细胞，例如，hek293细胞、中国仓鼠卵巢(cho)细胞、间充质干细胞(msc)、bj人包皮成纤维细胞、fhdf成纤维细胞、神经元前体细胞、羊水细胞、脂肪间充质干细胞、rptec/tert1细胞。在某些方面中，生产细胞不是抗原呈递细胞。在一些方面中，生产细胞不是树突细胞、b细胞、肥大细胞、巨噬细胞、嗜中性粒细胞、kupffer-browicz细胞、源自这些细胞中的任一者的细胞或它们的任何组合。
[0168]
如本文所用，“防治性(prophylactic)”是指用于预防疾病或疾患的发作或用于预防或延迟与疾病或疾患相关的症状的治疗或作用过程。
[0169]
如本文所用，“防治(prophylaxis)”是指为维持健康和预防或延迟出血事件的发作或预防或延迟与疾病或疾患相关的症状而采取的措施。
[0170]“重组”多肽或蛋白质是指通过重组dna技术产生的多肽或蛋白质。出于本公开的目的，在工程化宿主细胞中表达的重组产生的多肽和蛋白质被视为分离的，已通过任何合适的技术分离、分馏或部分地或基本上纯化的天然或重组多肽也视为分离的。本文公开的多肽可使用本领域已知的方法重组产生。或者，本文公开的蛋白质和肽可化学合成。在本公开的一些方面中，存在于ev(例如，外泌体)中的支架x和/或支架y蛋白是通过在生产细胞中过表达支架蛋白而重组产生的，以使得所得ev(例如，外泌体)中支架蛋白的水平相对于不过表达此类支架蛋白的生产细胞的ev(例如，外泌体)中存在的支架蛋白的水平显著提高。
[0171]
如本文所用，术语“支架部分”是指可用于将有效载荷(例如，生物活性分子)锚定至ev(例如，外泌体)，锚定在ev(例如，外泌体)的腔表面上或外表面上的分子，例如蛋白质诸如支架x或支架y。在某些方面中，支架部分包含合成分子。在一些方面中，支架部分包含非多肽部分。在其它方面中，支架部分包含例如天然存在于ev(例如，外泌体)中的脂质、碳水化合物、蛋白质或它们的组合(例如，糖蛋白或蛋白脂质)。在一些方面中，支架部分包含不天然存在于ev(例如，外泌体)中的脂质、碳水化合物或蛋白质。在一些方面中，支架部分包含天然存在于ev(例如，外泌体)中、但在ev(例如，外泌体)中已相对于基础/天然/野生型水平富集的脂质或碳水化合物。在一些方面中，支架部分包含天然存在于ev(例如，外泌体)中、但在ev(例如，外泌体)中已例如通过在生产细胞中的重组过表达而相对于基础/天然/野生型水平富集的蛋白质。在某些方面中，支架部分是支架x。在一些方面中，支架部分是支架y。在另外的方面中，支架部分包括支架x和支架y两者。
[0172]
如本文所用，术语“支架x”是指在ev(例如，外泌体)的表面上鉴定的ev(例如，外泌体)蛋白质。参见例如，美国专利号10,195,290，其以引用的方式整体并入本文。支架x蛋白的非限制性实例包括：前列腺素f2受体负调控因子(“ptgfrn”)；basigin(bsg)；免疫球蛋白超家族成员2(“igsf2”)；免疫球蛋白超家族成员3(“igsf3”)；免疫球蛋白超家族成员8(“igsf8”)；整联蛋白β-1(“itgb1”)；整联蛋白α-4(“itga4”)；4f2细胞表面抗原重链(“slc3a2”)；和一类atp转运蛋白(“atp1a1”、“atp1a2”、“atp1a3”、“atp1a4”、“atp1b3”、“atp2b1”、“atp2b2”、“atp2b3”、“atp2b”)。在一些方面中，支架x蛋白可以是完整蛋白质或其片段(例如，功能片段，例如，能够将另一部分锚定在ev(例如，外泌体)的外表面上或腔表面上的最小片段)。在一些方面中，支架x可将生物活性分子锚定至ev(例如，外泌体)的外表面或腔。在本公开的一些方面中，生物活性分子可通过马来酰亚胺部分共价连接至支架x。在一些方面中，生物活性分子可通过马来酰亚胺部分连接至ev(例如，外泌体)的腔表面上的支架x。可用于本公开的其它支架部分的非限制性实例包括：氨基肽酶n(cd13)；脑啡肽酶，aka膜金属内肽酶(mme)；外核苷酸焦磷酸酶/磷酸二酯酶家族成员1(enpp1)；神经纤毛蛋白-1(nrp1)；cd9、cd63、cd81、pdgfr、gpi锚蛋白、乳凝集素、lamp2和lamp2b。
[0173]
如本文所用，术语“支架y”是指在ev(例如，外泌体)的腔内鉴定的ev(例如，外泌体)蛋白质。参见例如，国际申请号pct/us2018/061679，其以引用的方式整体并入本文。支架y蛋白的非限制性实例包括：富含肉豆蔻酰化丙氨酸的蛋白激酶c底物(“marcks”)；富含肉豆蔻酰化丙氨酸的蛋白激酶c底物样1(“marcksl1”)；和脑酸溶性蛋白1(“basp1”)。在一些方面中，支架y蛋白可以是完整蛋白质或其片段(例如，功能片段，例如，能够将部分锚定
在ev(例如，外泌体)的腔表面上的最小片段)。在一些方面中，支架y可将部分锚定至ev(例如，外泌体)的腔表面。在本公开的一些方面中，部分可共价连接至支架y。在一些方面中，部分可连接至ev(例如，外泌体)的腔表面上的支架y。
[0174]
如本文所用的术语“自分解性间隔子”是指如下文定义的间隔子，如果所述间隔子与第一部分(例如，可裂解接头)的键被裂解，则它将自发地与第二部分(例如，生物活性分子)分离。
[0175]
如本文所用，术语“相似性”是指聚合物分子之间，例如多核苷酸分子(例如dna分子和/或rna分子)之间和/或多肽分子之间的总体相关性。可与同一性百分比计算相同的方式进行聚合物分子彼此的相似性百分比的计算，除了相似性百分比计算将如本领域中所理解的保守性取代考虑在内。应当理解，相似性百分比取决于所使用的比较量表，即是否例如根据氨基酸的进化相近性、电荷、体积、柔性、极性、疏水性、芳香性、等电点、抗原性或它们的组合来对氨基酸进行比较。
[0176]
如本文所用的术语“间隔子”是指能够将两个间隔开的部分(例如，可裂解接头和生物活性分子)共价连接在一起成为通常稳定的二联分子(dipartate molecule)的双官能化学部分。
[0177]
除非另有说明，否则提及具有一个或多个立体中心的化合物意欲指其每种立体异构体及立体异构体的所有组合。
[0178]
术语“受试者”、“患者”、“个体”和“宿主”及其变体在本文中可互换使用，并且是指需要诊断、治疗或疗法的任何哺乳动物受试者，包括但不限于人、家养动物(例如，狗、猫等)、农场动物(例如，牛、羊、猪、马等)和实验室动物(例如，猴、大鼠、小鼠、兔、豚鼠等)，特别是人。本文描述的方法适用于人的疗法和兽医应用。
[0179]
如本文所用，术语“基本上不含”意指包含ev(例如，外泌体)的样品包含按质量/体积(m/v)百分比浓度计少于10％的大分子(例如，污染物)。一些级分可含有少于0.001％、少于0.01％、少于0.05％、少于0.1％、少于0.2％、少于0.3％、少于0.4％、少于0.5％、少于0.6％、少于0.7％、少于0.8％、少于0.9％、少于1％、少于2％、少于3％、少于4％、少于5％、少于6％、少于7％、少于8％、少于9％或少于10％(m/v)的大分子。
[0180]
如本文所用，术语“表面工程化ev”(例如，支架x工程化外泌体)是指以下ev：ev的膜或表面在其组成方面进行了修饰，以使得工程化ev的表面不同于修饰前ev的表面或天然存在的ev的表面。
[0181]
如本文所用，术语“表面工程化外泌体”(例如，支架x工程化外泌体)是指以下外泌体：外泌体的膜或表面(外表面或腔表面)在其组成方面进行了修饰，以使得工程化外泌体的表面不同于修饰前外泌体的表面或天然存在的外泌体的表面。
[0182]
工程化可在ev(例如，外泌体)的表面上或在ev(例如，外泌体)的膜中进行，以使得ev(例如，外泌体)的表面被改变。例如，膜可在其例如蛋白质、脂质、小分子、碳水化合物或它们的组合的组成方面进行修饰。可通过化学、物理或生物学方法或通过由先前或同时通过化学、物理或生物学方法进行修饰的细胞产生来改变组成。具体地，可通过遗传工程化或通过由先前通过遗传工程化进行修饰的细胞产生来改变组成。在一些方面中，表面工程化ev(例如，外泌体)包含外源性蛋白质(即，ev(例如，外泌体)不天然表达的蛋白质)或其片段或变体，所述外源性蛋白质或其片段或变体可暴露于ev(例如，外泌体)的表面，或者可以是
暴露于ev(例如，外泌体)的表面上的部分的锚定点(连接)。在其它方面中，表面工程化ev(例如，外泌体)包含天然ev(例如，外泌体)蛋白质(例如，支架x)或其片段或变体的更高表达(例如，更高数量)，所述蛋白质或其片段或变体可暴露于ev(例如，外泌体)的表面，或者可以是暴露于ev(例如，外泌体)的表面上的部分的锚定点(连接)。在一个具体的方面中，表面工程化ev(例如，外泌体)包含一种或多种膜组分(例如，蛋白质诸如支架x、脂质、小分子、碳水化合物或它们的组合)的修饰，其中所述组分中的至少一者通过马来酰亚胺部分与生物活性分子共价连接。
[0183]
如本文所用，术语“治疗有效量”是指足以对有需要的受试者产生所需的治疗作用、药理学和/或生理学作用的包含本公开的ev或外泌体的试剂或药物化合物的量。在防治可视为疗法时，治疗有效量可以是“防治有效量”。
[0184]
如本文所用，术语“治疗(treat)”、“治疗(treatment)”或“治疗(treating)”是指例如疾病或疾患的严重程度的降低；病程持续时间的缩短；与疾病或疾患相关的一种或多种症状的改善或消除；向患有疾病或疾患的受试者提供有益作用，但不一定治愈所述疾病或疾患。所述术语还包括疾病或疾患或其症状的防治或预防。在一个方面中，术语“治疗(treating)”或“治疗(treatment)”是指在受试者中诱导针对抗原的免疫反应。
[0185]
如本文所用，术语分子(例如，功能性分子、抗原、或支架x和/或支架y)的“变体”是指通过本领域已知的方法进行比较后与另一分子共有某些结构和功能属性的分子。例如，蛋白质的变体可包括另一蛋白质中的取代、插入、缺失、移码或重排。
[0186]
在一些方面中，支架x的变体或衍生物包括与全长、成熟ptgfrn、bsg、igsf2、igsf3、igsf8、itgb1、itga4、slc3a2或atp转运蛋白或ptgfrn、bsg、igsf2、igsf3、igsf8、itgb1、itga4、slc3a2或atp转运蛋白的片段(例如，功能片段)具有至少约70％同一性的支架x变体。
[0187]
在一些方面中，本文公开的支架x蛋白的变体或片段的变体或其衍生物保留了特异性地靶向ev(例如，外泌体)的能力。在一些方面中，支架x或支架x衍生物包含一个或多个突变，例如保守氨基酸取代。
[0188]
在一些方面中，支架y的变体或其衍生物包括与marcks、marcksl1、basp1或marcks、marcksl1或basp1的片段具有至少70％同一性的变体。
[0189]
在一些方面中，支架y蛋白的变体或片段的变体或其衍生物保留了特异性地靶向ev(例如，外泌体)的腔表面的能力。在一些方面中，支架y包含一个或多个突变，例如保守氨基酸取代。
[0190]
天然存在的变体被称为“等位基因变体”，并且是指占据生物体的染色体上的给定基因座的基因的若干替代形式之一(genes ii,lewin,b.编辑,john wiley&sons,new york(1985))。这些等位基因变体可在多核苷酸和/或多肽水平上变化，并且包括在本公开中。或者，非天然存在的变体可通过诱变技术或直接合成产生。
[0191]
使用蛋白质工程化和重组dna技术的已知方法，可产生变体以改进或改变多肽的特征。例如，可从分泌蛋白质的n末端或c末端缺失一个或多个氨基酸，而基本上不损失生物功能。ron等人，j.biol.chem.268:2984-2988(1993)(以引用的方式整体并入本文)报告了即使在缺失3个、8个或27个氨基末端氨基酸残基之后仍具有肝素结合活性的变体kgf蛋白。类似地，干扰素γ在从这种蛋白至的羧基末端缺失8-10个氨基酸残基后表现出高达10倍的
活性。(dobeli等人，j.biotechnology 7:199-216(1988)，以引用的方式整体并入本文)。
[0192]
此外，大量的证据表明，变体通常保留与天然存在的蛋白质相似的生物活性。例如，gayle和同事(j.biol.chem 268:22105-22111(1993)，以引用的方式整体并入本文)对人细胞因子il-1a进行了广泛的突变分析。他们利用随机诱变生成了3,500多种单独的il-1a突变体，在分子的整个长度上每种变体具有平均2.5个氨基酸变化。在每个可能的氨基酸位置都检查到多重突变。研究人员发现，“[大多数]分子可被改变，而对[结合或生物活性]几乎没有影响。”(参见摘要)。事实上，在所检查的3,500多个核苷酸序列中，只有23个独特的氨基酸序列产生了与野生型活性显著不同的蛋白质。
[0193]
如上所述，变体或衍生物包括例如经修饰的多肽。在一些方面中，例如多肽、多核苷酸、脂质、糖蛋白的变体或衍生物是化学修饰和/或内源性修饰的结果。在一些方面中，变体或衍生物是体内修饰的结果。在一些方面中，变体或衍生物是体外修饰的结果。在其它方面中，变体或衍生物是生产细胞中的细胞内修饰的结果。
[0194]
变体和衍生物中存在的修饰包括，例如，乙酰化、酰化、adp-核糖基化、酰胺化、黄素的共价连接、血红素部分的共价连接、核苷酸或核苷酸衍生物的共价连接、脂质或脂质衍生物的共价连接、磷脂酰肌醇的共价连接、交联、环化、二硫键形成、去甲基化、共价交联的形成、半胱氨酸的形成、焦谷氨酸盐的形成、甲酰化、γ-羧化、糖基化、gpi锚形成、羟基化、碘化、甲基化、肉豆蔻酰化、氧化、聚乙二醇化(mei等人，blood 116:270-79(2010)，其以引用的方式整体并入本文)、蛋白水解加工、磷酸化、异戊二烯化、外消旋化、硒酰化、硫酸化、转运rna介导的向蛋白质中添加氨基酸，诸如精氨酰化和遍在蛋白化。
[0195]
在一些方面中，可在任何方便的位置修饰支架x和/或支架y。在一些方面中，可在任何方便的位置修饰生物活性分子。在本公开的特定方面中，可对ev(例如，外泌体)组分(例如，诸如支架x和/或支架y的蛋白质、脂质或聚糖)和/或生物活性分子(例如，抗体或adc、protac、诸如环状二核苷酸的小分子、诸如mmae的毒素、sting激动剂、耐受剂或反义寡核苷酸)进行修饰以产生包含至少一个马来酰亚胺部分的衍生物。
[0196]
ii.本公开的缀合ev(例如，外泌体)
[0197]
细胞外囊泡(ev)通常具有20nm至1000nm的直径；例如，为小细胞外囊泡的外泌体通常具有100-200nm的直径。ev(例如，外泌体)由限制性脂质双层和一组不同的蛋白质和核酸组成(maas,s.l.n.,等人,trends.cell biol.27(3):172-188(2017))。ev(例如，外泌体)在离散细胞类型和组织中表现出优先摄取，并且可通过向其表面添加与靶细胞表面上的受体相互作用的蛋白质来引导它们的向性(alvarez-erviti,l.,等人,nat.biotechnol.29(4):341-345(2011))。
[0198]
与抗体不同，ev(例如，外泌体)可容纳大量连接至其表面的分子，每个ev(例如，外泌体)大约有数千至数万个分子。因此，ev(例如，外泌体)-药物缀合物代表了可将高浓度的治疗性化合物递送至离散细胞类型、同时限制对化合物的总体全身暴露、从而降低脱靶毒性的平台。
[0199]
在一些方面中，本公开提供了“经修饰的生物活性分子”(mbam)，例如aso，其包含通过使一个或多个锚定部分直接或间接地，例如通过一个或多个接头组合结合(例如共价)至bam(例如aso)进行修饰的“生物活性分子”(bam)，例如aso。此处公开的经修饰的bam可包含“锚定部分”(am)和任选的一个或多个将am连接至bam的接头(“接头组合”)，如以下示意
性地表示：
[0200]
[am]-[接头]n-[bam]
[0201]
其中n是介于0与10之间的整数。
[0202]
bam可通过“反应性基团”(rg；例如胺、硫醇、羟基、羧酸或叠氮化物)与“反应性部分”(rm；例如马来酰亚胺、琥珀酸酯，nhs)之间的反应连接至锚定部分或接头组合。设想了几种潜在合成途径，例如：
[0203]
[am]-/反应性部分/+/反应性基团/-[bam]
[0204]
[am]-[接头]n-/反应性部分/+/反应性基团/-[bam]
[0205]
[am]-/反应性部分/+/反应性基团/-[接头]n-[bam]
[0206]
[am]-[接头]n-/反应性部分/+/反应性基团/-[接头]n-[bam]
[0207]
锚定部分可插入ev(例如，外泌体)的脂质双层中，从而允许外泌体负载bam，例如aso。目前，外泌体作为极性bam(例如aso)的递送媒介物的商业化的主要障碍是非常低效的负载。这一障碍可通过在将bam(例如aso)负载至外泌体中之前对其进行修饰来克服。因此，如本文所述，bam(例如aso)的修饰有助于将它们负载至外泌体中。
[0208]
与先前报告的通过例如电穿孔或阳离子脂质转染将未修饰的bam引入外泌体中的负载效率相比，本文阐述的使外泌体负载经修饰的bam(例如aso)的方法显著提高负载效率。
[0209]
在一些方面中，相对于天然(未修饰的)bam(例如相应的未修饰的aso)，修饰使bam(例如aso)的疏水性增加至少约1、至少约2、至少约3、至少约4、至少约5、至少约6、至少约7、至少约8、至少约9或至少约10倍。在一些方面中，相对于天然(未修饰的)bam(例如相应的未修饰的aso)，修饰使bam(例如aso)的疏水性增加至少约1、至少约2、至少约3、至少约4、至少约5、至少约6、至少约7、至少约8、至少约9或至少约10个数量级。
[0210]
在一些方面中，相对于天然(未修饰的)bam(例如相应的未修饰的aso)，修饰使bam(例如aso)的疏水性增加至少约10％、至少约20％、至少约30％、至少约40％、至少约50％、至少约60％、至少约70％、至少约80％、至少约90％、至少约100％、至少约125％、至少约150％、至少约175％、至少约200％、至少约250％、至少约300％、至少约350％、至少约400％、至少约450％、至少约500％、至少约600％、至少约700％、至少约800％、至少约900％或至少约1000％。可使用任何合适的方法评估疏水性的增加。例如，可通过与在水性溶剂如水中的溶解度相比，测量在有机溶剂如辛醇中的溶解度百分来确定疏水性。
[0211]
在一些方面中，锚定部分可化学缀合至bam(例如aso)以增强其疏水特性。在示例性方面中，锚定部分是固醇(例如，胆固醇)、gm1、脂质、维生素、小分子、肽或它们的组合。在一些方面中，所述部分是脂质。在一些方面中，锚定部分是固醇，例如胆固醇。另外的部分包括例如磷脂、溶血磷脂、脂肪酸或维生素(例如，维生素d或维生素e)。
[0212]
在一些方面中，锚定部分直接或通过一个或多个接头在bam(例如aso)的末端缀合(即“末端修饰”)。在其它方面中，锚定部分缀合至bm(例如aso)的其它部分。
[0213]
在一些方面中，aso包含长度为约10至约30，如10-20、14-20、16-20或15-25个核苷酸的连续核苷酸序列。在某些方面中，aso的长度是20个核苷酸。在某些方面中，aso的长度是18个核苷酸。在某些方面中，aso的长度是19个核苷酸。在某些方面中，aso的长度是17个核苷酸。在某些方面中，aso的长度是16个核苷酸。在某些方面中，aso的长度是15个核苷酸。
在某些方面中，aso的长度是14个核苷酸。在某些方面中，aso的长度是13个核苷酸。在某些方面中，aso的长度是12个核苷酸。在某些方面中，aso的长度是11个核苷酸。在某些方面中，aso的长度是10个核苷酸。
[0214]
在一些方面中，aso包含长度为约10至约50个核苷酸，例如约10至约45、约10至约40、约10或约35、或约10至约30个核苷酸的连续核苷酸序列。在某些方面中，aso的长度是21个核苷酸。在某些方面中，aso的长度是22个核苷酸。在某些方面中，aso的长度是23个核苷酸。在某些方面中，aso的长度是24个核苷酸。在某些方面中，aso的长度是25个核苷酸。在某些方面中，aso的长度是26个核苷酸。在某些方面中，aso的长度是27个核苷酸。在某些方面中，aso的长度是28个核苷酸。在某些方面中，aso的长度是29个核苷酸。在某些方面中，aso的长度是30个核苷酸。在某些方面中，aso的长度是31个核苷酸。在某些方面中，aso的长度是32个核苷酸。在某些方面中，aso的长度是33个核苷酸。在某些方面中，aso的长度是34个核苷酸。在某些方面中，aso的长度是35个核苷酸。在某些方面中，aso的长度是36个核苷酸。在某些方面中，aso的长度是37个核苷酸。在某些方面中，aso的长度是38个核苷酸。在某些方面中，aso的长度是39个核苷酸。在某些方面中，aso的长度是40个核苷酸。在某些方面中，aso的长度是41个核苷酸。在某些方面中，aso的长度是42个核苷酸。在某些方面中，aso的长度是43个核苷酸。在某些方面中，aso的长度是44个核苷酸。在某些方面中，aso的长度是45个核苷酸。在某些方面中，aso的长度是46个核苷酸。在某些方面中，aso的长度是47个核苷酸。在某些方面中，aso的长度是48个核苷酸。在某些方面中，aso的长度是49个核苷酸。在某些方面中，aso的长度是50个核苷酸。
[0215]
在一些方面中，经修饰的bam(例如aso)可包括可检测标记。示例性标记包括荧光标记和/或放射性标记。在一些方面中，其中经修饰的bam(例如aso)进行荧光标记，可检测标记可以是例如cy3。向经修饰的bam(例如aso)添加可检测标记可用作标记外泌体并跟踪其生物分布的一种方式。在其它方面中，可检测标记可直接地，例如通过标记外泌体脂质和/或外泌体肽而连接至外泌体。
[0216]
经修饰的bam的不同组分(即，锚定部分、接头和接头组合，以及bam，如aso)可通过酰胺、酯、醚、硫醚、二硫化物、氨基磷酸酯、磷酸三酯、二硫代磷酸酯、膦酸甲酯、磷酸二酯或硫代磷酸酯键联或可替代地任何或其它键联连接。
[0217]
在一些方面中，经修饰的bam的不同组分可以是使用双功能接头(即，含有两个官能团的接头)的接头，如n-琥珀酰亚胺基-3-(2-吡啶基二硫代)丙酸酯、n-4-马来酰亚胺丁酸、s-(2-吡啶基二硫代)半胱胺、碘乙酰氧基琥珀酰亚胺、n-(4-马来酰亚胺丁氧基)琥珀酰亚胺、n-[5-(3'-马来酰亚胺丙基酰胺)-1-羧基戊基]亚氨基二乙酸、n-(5-氨基戊基)-亚氨基二乙酸等。
[0218]
ii.a.锚定部分
[0219]
如下文详细描述的，能够将bam锚定至ev(例如，外泌体)的表面的合适锚定部分包含例如固醇(例如，胆固醇)、脂质、溶血磷脂、脂肪酸或脂溶性维生素。
[0220]
在一些方面中，锚定部分可以是脂质。脂质锚定部分可以是本领域已知的任何脂质，例如棕榈酸或糖基磷脂酰肌醇。在一些方面中，脂质是脂肪酸、磷脂(phosphatide)、磷脂(phospholipid)(例如，磷脂酰胆碱、磷脂酰丝氨酸或磷脂酰乙醇胺)或其类似物(例如，磷脂酰胆碱、卵磷脂、磷脂酰乙醇胺、脑磷脂或磷脂酰丝氨酸或其类似物或部分，如其部分
水解的部分)。
[0221]
通常，锚定部分是化学连接的。然而，锚定部分可酶促连接至bam。在一些方面中，有可能通过改变细胞培养条件来将锚定部分连接至bam。例如，通过使用限制肉豆蔻酸的培养基，一些其它脂肪酸(包括短链和不饱和脂肪酸)可连接至n末端甘氨酸。例如，据报告，在bk通道中，肉豆蔻酸通过羟基酯键联在翻译后连接至内部丝氨酸/苏氨酸或酪氨酸残基。
[0222]
锚定部分可在任何化学上可行的位置，例如在核苷酸序列(例如aso)的5'和/或3'端，直接地或通过接头组合间接地缀合至bam。在一个方面中，锚定部分仅缀合至bam的3'端。在一个方面中，锚定部分仅缀合至核苷酸序列(例如aso)的5'端。在一个方面中，锚定部分缀合在不是核苷酸序列(例如aso)的3'端或5'端的位置。
[0223]
可用于实践本公开的方法的一些类型的膜锚呈现于下表中：
[0224][0225]
在一些方面中，本公开的锚定部分可包含本文公开的两种或更多种类型的锚定部分。例如，在一些方面中，锚定部分可包含两种脂质(例如磷脂和脂肪酸)、或两种磷脂、或两种脂肪酸、或脂质和维生素、或胆固醇和维生素等，合在一起具有6-80个碳原子(即，6-80的等价碳数(ecn))。
[0226]
在一些方面中，锚定部分的组合，例如脂质(例如，脂肪酸)的组合具有6-80、8-80、10-80、12-80、14-80、16-80、18-80、20-80、22-80、24-80、26-80、28-80、30-80、4-76、6-76、8-76、10-76、12-76、14-76、16-76、18-76、20-76、22-76、24-76、26-76、28-76、30-76、6-72、8-72、10-72、12-72、14-72、16-72、18-72、20-72、22-72、24-72、26-72、28-72、30-72、6-68、8-68、10-68、12-68、14-68、16-68、18-68、20-68、22-68、24-68、26-68、28-68、30-68、6-64、8-64、10-64、12-64、14-64、16-64、18-64、20-64、22-64、24-64、26-64、28-64、30-64、6-60、8-60、10-60、12-56、14-56、16-56、18-56、20-56、22-56、24-56、26-56、28-56、30-56、6-52、8-52、10-52、12-52、14-52、16-52、18-52、20-52、22-52、24-52、26-52、28-52、30-52、6-48、8-48、10-48、12-48、14-48、16-48、18-48、20-48、22-48、24-48、26-48、28-48、30-48、6-44、8-44、10-44、12-44、14-44、16-44、18-44、20-44、22-44、24-44、26-44、28-44、30-44、6-40、
8-40、10-40、12-40、14-40、16-40、18-40、20-40、22-40、24-40、26-40、28-40、30-40、6-36、8-36、10-36、12-36、14-36、16-36、18-36、20-36、22-36、24-36、26-36、28-36、30-36、6-32、8-32、10-32、12-32、14-32、16-32、18-32、20-32、22-32、24-32、26-32、28-32或30-32的ecn。
[0227]
ii.a.1胆固醇和其它固醇
[0228]
在一些方面中，锚定部分包含固醇、类固醇、藿烷类、羟基类固醇、开环类固醇、或它们的具有亲脂性质的类似物。在一些方面中，锚定部分包含固醇，如植物固醇、真菌固醇(mycosterol)或动物固醇。示例性动物固醇包括胆固醇和24s-羟基胆固醇；示例性植物固醇包括麦角固醇(真菌固醇)、菜油固醇、谷固醇和豆固醇。在一些方面中，固醇选自麦角固醇、7-脱氢胆固醇、胆固醇、24s-羟基胆固醇、羊毛固醇、环阿屯醇、岩藻固醇、大褐马尾藻固醇(saringosterol)、菜油固醇、β-谷固醇、谷甾烷醇、粪固醇、燕麦固醇或豆固醇。固醇可以游离固醇、酰化(固醇酯)、烷基化(固醇烷基醚)、硫酸化(硫酸固醇)形式存在，或与糖苷部分连接(固醇糖苷)，其本身可被酰化(酰化固醇糖苷)。
[0229]
在一些方面中，锚定部分包含类固醇。在一些方面中，类固醇选自二氢睾酮、熊果醇、龙舌蓝皂苷配基、薯蓣皂苷配基、黄体酮或皮质醇。
[0230]
例如，固醇可直接或通过接头组合在固醇的可用—oh基团处与bam缀合。示例性固醇具有如下所示的通用骨架：
[0231][0232]
作为另一实例，麦角固醇具有以下结构：
[0233][0234]
胆固醇具有以下结构：
[0235][0236]
因此，在一些方面中，固醇或类固醇的游离—oh基团用于将aso直接或通过接头组合缀合至固醇(例如胆固醇)或类固醇。
[0237]
ii.a.2.脂肪酸
[0238]
在一些方面中，锚定部分是脂肪酸。在一些方面中，脂肪酸是短链、中链或长链脂
肪酸。在一些方面中，脂肪酸是饱和脂肪酸。在一些方面中，脂肪酸是不饱和脂肪酸。在一些方面中，脂肪酸是单不饱和脂肪酸。在一些方面中，脂肪酸是多不饱和脂肪酸，如ω-3(ω-3)或ω-6(ω-6)脂肪酸。
[0239]
在一些方面中，脂质(例如脂肪酸)具有c
2-c
60
链。在一些方面中，脂质(例如脂肪酸)具有c
2-c
28
链。在一些方面中，脂肪酸具有c
2-c
40
链。在一些方面中，脂肪酸具有c
2-c
12
或c
4-c
12
链。在一些方面中，脂肪酸具有c
4-c
40
链。在一些方面中，脂肪酸具有c
4-c
40
、c
2-c
38
、c
2-c
36
、c
2-c
34
、c
2-c
32
、c
2-c
30
、c
4-c
30
、c
2-c
28
、c
4-c
28
、c
2-c
26
、c
4-c
26
、c
2-c
24
、c
4-c
24
、c
6-c
24
、c
8-c
24
、c
10-c
24
、c
2-c
22
、c
4-c
22
、c
6-c
22
、c
8-c
22
、c
10-c
22
、c
2-c
20
、c
4-c
20
、c
6-c
20
、c
8-c
20
、c
10-c
20
、c
2-c
18
、c
4-c
18
、c
6-c
18
、c
8-c
18
、c
10-c
18
、c
12-c
18
、c
14-c
18
、c
16-c
18
、c
2-c
16
、c
4-c
16
、c
6-c
16
、c
8-c
16
、c
10-c
16
、c
12-c
16
、c
14-c
16
、c
2-c
15
、c
4-c
15
、c
6-c
15
、c
8-c
15
、c
9-c
15
、c
10-c
15
、c
11-c
15
、c
12-c
15
、c
13-c
15
、c
2-c
14
、c
4-c
14
、c
6-c
14
、c
8-c
14
、c
9-c
14
、c
10-c
14
、c
11-c
14
、c
12-c
14
、c
2-c
13
、c
4-c
13
、c
6-c
13
、c
7-c
13
、c
8-c
13
、c
9-c
13
、c
10-c
13
、c
10-c
13
、c
11-c
13
、c
2-c
12
、c
4-c
12
、c
6-c
12
、c
7-c
12
、c
8-c
12
、c
9-c
12
、c
10-c
12
、c
2-c
11
、c
4-c
11
、c
6-c
11
、c
7-c
11
、c
8-c
11
、c
9-c
11
、c
2-c
10
、c
4-c
10
、c
2-c9、c
4-c9、c
2-c8、c
2-c7、c
4-c7、c
2-c6或c
4-c6链。在一些方面中，脂肪酸具有c2、c3、c4、c5、c6、c7、c8、c9、c
10
、c
11
、c
12
、c
13
、c
14
、c
15
、c
16
、c
17
、c
18
、c
19
、c
20
、c
21
、c
22
、c
23
、c
24
、c
25
、c
26
、c
27
、c
28
、c
29
、c
30
、c
31
、c
32
、c
33
、c
34
、c
35
、c
36
、c
37
、c
38
、c
39
、c
40
、c
41
、c
42
、c
43
、c
44
、c
45
、c
46
、c
47
、c
48
、c
49
、c
50
、c
51
、c
52
、c
53
、c
54
、c
55
、c
56
、c
57
、c
58
、c
59
或c
60
链。
[0240]
在一些方面中，锚定部分包含两种脂肪酸，所述脂肪酸各自独立地选自具有链的脂肪酸，所述链具有前述碳原子范围或碳原子数中的任一者。在一些方面中，一种脂肪酸独立地是具有c6-c21链的脂肪酸，并且一种脂肪酸独立地是具有c12-c36链的脂肪酸。在一些方面中，每种脂肪酸独立地具有11、12、13、14、15、16或17个碳原子的链。
[0241]
合适的脂肪酸包括饱和直链脂肪酸、饱和支链脂肪酸、不饱和脂肪酸、羟基脂肪酸和多元羧酸。在一些方面中，此类脂肪酸具有多达32个碳原子。
[0242]
有用的饱和直链脂肪酸的实例包括具有偶数个碳原子的那些，丁酸、己酸、辛酸、癸酸、月桂酸、肉豆蔻酸、棕榈酸、硬脂酸、花生酸、山嵛酸、二十四烷酸、二十六烷酸、二十八烷酸、三十烷酸和正三十二烷酸，以及具有奇数个碳原子的那些，如丙酸、正戊酸、庚酸、壬酸、十一烷酸、十三烷酸、十五烷酸、十七烷酸、十九烷酸、二十一烷酸、二十三烷酸、二十五烷酸和二十七烷酸。
[0243]
合适的饱和支链脂肪酸的实例包括异丁酸、异己酸、异辛酸、异癸酸、异月桂酸、11-甲基十二烷酸、异肉豆蔻酸、13-甲基-十四烷酸、异棕榈酸、15-甲基-十六烷酸、异硬脂酸、17-甲基十八烷酸、异花生酸、19-甲基-二十烷酸、α-乙基-己酸、α-己基癸酸、α-庚基十一烷酸、2-癸基十四烷酸、2-十一烷基十四烷酸、2-癸基十五烷酸、2-十一烷基十五烷酸和fine oxocol 1800酸(nissan chemical industries,ltd.的产品)。合适的饱和奇数碳支链脂肪酸包括以异丁基封端的反异脂肪酸，如6-甲基-辛酸、8-甲基-癸酸、10-甲基-十二烷酸、12-甲基-十四烷酸、14-甲基-十六烷酸、16-甲基-十八烷酸、18-甲基-二十烷酸、20-甲基-二十二烷酸、22-甲基-二十四烷酸、24-甲基-二十六烷酸和26-甲基二十八烷酸。
[0244]
合适的不饱和脂肪酸的实例包括4-癸烯酸、癸烯酸、4-十二碳烯酸、5-十二碳烯酸、月桂烯酸、4-十四碳烯酸、5-十四碳烯酸、9-十四碳烯酸、棕榈油酸、6-十八碳烯酸、油酸、9-十八碳烯酸、11-十八碳烯酸、9-二十碳烯酸、顺式-11-二十碳烯酸、鲸蜡油酸、13-二十二碳烯酸、15-二十四碳烯酸,17-二十六碳烯酸、6,9,12,15-十六碳四烯酸、亚油酸、亚麻
酸、α-桐酸、β-桐酸、石榴酸、6,9,12,15-十八碳四烯酸、杷荏酸、5,8,11,14-二十碳四烯酸、5,8,11,14,17-二十碳五烯酸、7,10,13,16,19-二十二碳五烯酸、4,7,10,13,16,19-二十二碳六烯酸等。
[0245]
合适的羟基脂肪酸的实例包括α-羟基月桂酸、α-羟基肉豆蔻酸、α-羟基棕榈酸、α-羟基硬脂酸、ω-羟基月桂酸、α-羟基花生酸、9-羟基-12-十八碳烯酸、蓖麻油酸、α-羟基山嵛酸、9-羟基-反式-10,12-十八碳二烯酸、粗糠柴酸、番红醇酸、9,10-二羟基硬脂酸、12-羟基硬脂酸等。
[0246]
合适的多元羧酸的实例包括草酸、丙二酸、琥珀酸、戊二酸、己二酸、庚二酸、辛二酸、壬二酸、癸二酸、d,l-苹果酸等。
[0247]
在一些方面中，每种脂肪酸独立地选自丙酸、丁酸、戊酸、己酸、庚酸、辛酸、壬酸、癸酸、十一酸、月桂酸、十三酸、肉豆蔻酸、十五酸、棕榈酸、十七酸、硬脂酸、十九酸、花生酸、二十一酸、山嵛酸、二十三酸、木蜡酸、二十五酸、蜡酸、二十七酸、褐煤酸、二十九酸、蜂花酸、三十一酸、紫胶蜡酸、叶虱酸、格地酸、三十六酸、三十六烷酸、三十七烷酸和三十八烷酸。
[0248]
在一些方面中，每种脂肪酸独立地选自α-亚麻酸、十八碳四烯酸、二十碳五烯酸、二十二碳六烯酸、亚油酸、γ-亚油酸、二高-γ-亚油酸、花生四烯酸、二十二碳四烯酸、棕榈油酸、异油酸、二十烯酸(paullinic acid)、油酸、反油酸、巨头鲸鱼酸(gondoic acid)、芥酸、神经酸、二十碳三烯酸(mead acid)、肾上腺酸、bosseopentaenoic酸、ozubondo酸、沙丁鱼酸(sardine acid)、鲱鱼酸(herring acid)、二十二碳六烯酸或二十四碳五烯酸，或另一种单不饱和或多不饱和脂肪酸。
[0249]
在一些方面中，脂肪酸中的一者或两者是必需脂肪酸。鉴于某些必需脂肪酸的有益健康作用，可通过在治疗剂中包含此类脂肪酸来增加所公开的负载治疗剂的外泌体的治疗益处。在一些方面中，必需脂肪酸是选自由以下组成的组的n-6或n-3必需脂肪酸：亚麻酸、γ-亚麻酸、二高-γ-亚麻酸、花生四烯酸、肾上腺酸、二十二碳五烯n-6酸、α-亚麻酸、十八碳四烯酸、20:4n-3酸、二十碳五烯酸、二十二碳五烯n-3酸或二十二碳六烯酸。
[0250]
在一些方面中，每种脂肪酸独立地选自全顺式-7,10,13-十六碳三烯酸、α-亚麻酸、十八碳四烯酸、二十碳三烯酸、二十碳四烯酸、二十碳五烯酸(epa)、二十二碳五烯酸、二十二碳六烯酸(dha)、二十四碳五烯酸、二十四碳六烯酸或硫辛酸。在其它方面中，脂肪酸选自二十碳五烯酸、二十二碳六烯酸或硫辛酸。脂肪酸的其它实例包括全顺式-7,10,13-十六碳三烯酸、α-亚麻酸(ala或全顺式-9,12,15-十八碳三烯酸)、十八碳四烯酸(std或全顺式-6,9,12,15-十八碳四烯酸)、二十碳三烯酸(ete或全顺式-11,14,17-二十碳三烯酸)、二十碳四烯酸(eta或全顺式-8,11,14,17-二十碳四烯酸)、二十碳五烯酸(epa)、二十二碳五烯酸(dpa，鰶鱼酸或全顺式-7,10,13,16,19-二十二碳五烯酸)、二十二碳六烯酸(dha或全顺式-4,7,10,13,16,19-二十二碳六烯酸)、二十四碳五烯酸(全顺式-9,12,15,18,21-二十二碳六烯酸)或二十四碳六烯酸(尼生酸(nisinic acid)或全顺式-6,9,12,15,18,21-二十四碳烯酸)。在一些方面中，脂肪酸是中链脂肪酸，如硫辛酸。
[0251]
脂肪酸链在其链长度方面差异很大，并且可根据链长进行分类，例如短至极长。短链脂肪酸(scfa)是具有约五个或更少碳的链的脂肪酸(例如丁酸)。在一些方面中，脂肪酸是scfa。中链脂肪酸(mcfa)包括具有约6-12个碳的链的脂肪酸，其可形成中链甘油三酯。在
一些方面中，脂肪酸是mcfa。长链脂肪酸(lcfa)包括具有13-21个碳的链的脂肪酸。在一些方面中，脂肪酸是lcfa。在一些方面中，脂肪酸是lcfa。极长链脂肪酸(vlcfa)包括具有22个或更多个碳，如22-60、22-50或22-40个碳的链的脂肪酸。在一些方面中，脂肪酸是vlcfa。
[0252]
ii.a.3.磷脂
[0253]
在一些方面中，所述锚定部分包含磷脂。磷脂是一类为所有细胞膜的主要组分的脂质。由于它们的两亲特性，它们可形成脂质双层。磷脂分子的结构通常由两个疏水性脂肪酸“尾部”和由磷酸酯基团组成的亲水性“头部”组成。例如，磷脂可以是根据下式的脂质：
[0254][0255]
其中r
p
代表磷脂部分，并且r1和r2代表可相同或不同的具有或不具有不饱和度的脂肪酸部分。
[0256]
磷脂部分可选自例如由以下组成的非限制性组：磷脂酰胆碱、磷脂酰乙醇胺、磷脂酰甘油、磷脂酰丝氨酸、磷脂酸、2溶血磷脂酰胆碱和鞘磷脂。
[0257]
特定的磷脂可促进与脂质双层，例如外泌体膜的脂质双层的融合。例如，阳离子磷脂可与膜的一种或多种带负电荷的磷脂相互作用。磷脂与膜的融合可允许含脂质组合物的一种或多种要素与所述膜结合或穿过所述膜。
[0258]
脂肪酸部分可选自例如由以下组成的非限制性组：月桂酸、肉豆蔻酸、肉豆蔻脑酸、棕榈酸、棕榈油酸、硬脂酸、油酸、亚油酸、α-亚麻酸、芥酸、植烷酸、花生酸、花生四烯酸、二十碳五烯酸、山嵛酸、二十二碳五烯酸和二十二碳六烯酸。
[0259]
在本公开中用作锚定部分的磷脂可以是天然或非天然磷脂。还考虑了非天然磷脂物质，包括具有修饰和取代(包括支化、氧化、环化和炔烃)的天然物质。例如，磷脂可用一种或多种炔烃官能化与一种或多种炔烃(例如，其中一个或多个双键被三键替代的烯基)交联。在适当反应条件下，炔烃基团可在暴露于叠氮化物时经历铜催化的环加成反应。
[0260]
磷脂包括但不限于甘油磷脂，如磷脂酰胆碱、磷脂酰乙醇胺、磷脂酰丝氨酸、磷脂酰肌醇、磷脂酰甘油和磷脂酸。可用于本文公开的锚定部分中的磷脂的实例包括磷脂酰乙醇胺(例如，二月桂酰基磷脂酰乙醇胺、二肉豆蔻酰基磷脂酰乙醇胺、二棕榈酰基磷脂酰乙醇胺、二硬脂酰基磷脂酰乙醇胺、二油酰基磷脂酰乙醇胺、1-棕榈酰基-2-油烯基磷脂酰乙醇胺、1-油烯基-2-棕榈酰基磷脂酰乙醇胺和二芥酰基磷脂酰乙醇胺)、磷脂酰甘油(例如，二月桂酰基磷脂酰甘油、二肉豆蔻酰基磷脂酰甘油、二棕榈酰基磷脂酰甘油、二硬脂酰基磷脂酰甘油、二油酰基磷脂酰甘油、1-棕榈酰基-2-油烯基-磷脂酰甘油、1-油烯基-2-棕榈酰基-磷脂酰甘油和二芥酰基磷脂酰甘油)；磷脂酰丝氨酸(例如，如二月桂酰基磷脂酰丝氨酸、二肉豆蔻酰基磷脂酰丝氨酸、二棕榈酰基磷脂酰丝氨酸、二硬脂酰基磷脂酰丝氨酸、二油酰基磷脂酰丝氨酸、1-棕榈酰基-2-油烯基-磷脂酰丝氨酸、1-油烯基-2-棕榈酰基-磷脂酰丝氨酸和二芥酰基磷脂酰丝氨酸)；磷脂酸(例如，二月桂酰基磷脂酸、二肉豆蔻酰基磷脂酸、二棕榈酰基磷脂酸、二硬脂酰基磷脂酸、二油酰基磷脂酸、1-棕榈酰基-2-油烯基磷脂
酸、1-油烯基-2-棕榈酰基-磷脂酸和二芥酰基磷脂酸)；和磷脂酰肌醇(例如，二月桂酰基磷脂酰肌醇、二肉豆蔻酰基磷脂酰肌醇、二棕榈酰基磷脂酰肌醇、二硬脂酰基磷脂酰肌醇、二油酰基磷脂酰肌醇、1-棕榈酰基-2-油烯基-磷脂酰肌醇、1-油烯基-2-棕榈酰基-磷脂酰肌醇和二芥酰基磷脂酰肌醇)。
[0261]
磷脂可以是对称或不对称类型。如本文所用，术语“对称磷脂”包括具有匹配的脂肪酸部分和鞘脂的甘油磷脂，其中可变脂肪酸部分和鞘氨醇主链的烃链包含相当数量的碳原子。如本文所用，术语“不对称磷脂”包括溶血脂质，具有不同脂肪酸部分的甘油磷脂(例如，具有不同碳原子数和/或不饱和度(例如，双键)的脂肪酸部分)，和其中可变脂肪酸部分和鞘氨醇主链的烃链包含不同数量的碳原子的鞘脂(例如，可变脂肪酸部分包含比烃链多至少两个碳原子或比烃链少至少两个碳原子)。
[0262]
在一些方面中，锚定部分包含至少一种对称磷脂。对称磷脂可选自由以下组成的非限制性组：1,2二丙酰基sn-甘油基3磷酸胆碱(03:0pc)、1,2二丁酰基sn甘油基3磷酸胆碱(04:0pc)、1,2二戊酰基sn甘油基3磷酸胆碱(05:0pc)、1,2二己酰基sn甘油基3磷酸胆碱(06:0pc)、1,2二庚酰基sn甘油基3磷酸胆碱(07:0pc)、1,2二辛酰基sn甘油基3磷酸胆碱(08:0pc)、1,2二壬酰基sn甘油基3磷酸胆碱(09:0pc)、1,2二癸酰基sn甘油基3磷酸胆碱(10:0pc)、1,2双十一烷酰基sn甘油基3磷酸胆碱(11:0pc，dupc)、1,2二月桂酰基sn甘油基3磷酸胆碱(12:0pc)、1,2双十三烷酰基sn甘油基3磷酸胆碱(13:0pc)、1,2二肉豆蔻酰基sn甘油基3磷酸胆碱(14:0pc,dmpc)、1,2双十五烷酰基sn甘油基3磷酸胆碱(15:0pc)、1,2二棕榈酰基sn甘油基3磷酸胆碱(16:0pc，dppc)、1,2二植烷酰基sn甘油基3磷酸胆碱(4me16:0pc)、1,2双十七烷酰基sn甘油基3磷酸胆碱(17:0pc)、1,2二硬脂酰基sn甘油基3磷酸胆碱(18:0pc，dspc)、1,2双十九烷酰基sn甘油基3磷酸胆碱(19:0pc)、1,2双二十烷酰基sn甘油基3磷酸胆碱(20:0pc)、1,2双二十一烷酰基sn甘油基3磷酸胆碱(21:0pc)、1,2二山嵛酰基sn甘油基3磷酸胆碱(22:0pc)、1,2双二十三烷酰基sn甘油基3磷酸胆碱(23:0pc)、1,2双二十四烷酰基sn甘油基3磷酸胆碱(24:0pc)、1,2二肉豆蔻脑酰基sn甘油基3磷酸胆碱(14:1(δ9-顺式)pc)、1,2二反肉豆蔻脑酰基sn甘油基3磷酸胆碱(14:1(δ9-反式)pc)、1,2二棕榈油酰基sn甘油基3磷酸胆碱(16:1(δ9-顺式)pc)、1,2二反棕榈油酰基sn甘油基3磷酸胆碱(16:1(δ9-反式)pc)、1,2二异岩芹酰基sn甘油基3磷酸胆碱(18:1(δ6-顺式)pc)、1,2二油酰基sn甘油基3磷酸胆碱(18:1(δ9-顺式)pc，dopc)、1,2二反油酰基sn甘油基3磷酸胆碱(18:1(δ9-反式)pc)、1,2二亚油酰基sn甘油基3磷酸胆碱(18:2(顺式)pc，dlpc)、1,2二亚麻酰基sn甘油基3磷酸胆碱(18:3(顺式)pc，dlnpc)、1,2双二十碳烯酰基sn甘油基3磷酸胆碱(20:1(顺式)pc)、1,2二花生四烯酰基sn甘油基3磷酸胆碱(20:4(顺式)pc，dapc)、1,2二瓢儿菜基sn甘油基3磷酸胆碱(22:1(顺式)pc)、1,2双二十二碳六烯酰基sn甘油基3磷酸胆碱(22:6(顺式)pc，dhapc)、1,2二神经酰基sn甘油基3磷酸胆碱(24:1(顺式)pc)、1,2二己酰基sn甘油基3磷酸乙醇胺(06:0pe)、1,2二辛酰基sn甘油基3磷酸乙醇胺(08:0pe)、1,2二癸酰基sn甘油基3磷酸乙醇胺(10:0pe)、1,2二月桂酰基sn甘油基3磷酸乙醇胺(12:0pe)、1,2二肉豆蔻酰基sn甘油基3磷酸乙醇胺(14:0pe)、1,2双十五烷酰基sn甘油基3磷酸乙醇胺(15:0pe)、1,2二棕榈酰基sn甘油基3磷酸乙醇胺(16:0pe)、1,2二植烷酰基sn甘油基3磷酸乙醇胺(4me 16:0pe)、1,2双十七烷酰基sn甘油基3磷酸乙醇胺(17:0pe)、1,2二硬脂酰基sn甘油基3磷酸乙醇胺(18:0pe，dspe)、1,2二棕榈油酰基sn甘油基3磷酸乙醇胺(16:1pe)、1,2二油酰基sn
甘油基3磷酸乙醇胺(18:1(δ9-顺式)pe，dope)、1,2二反油酰基sn甘油基3磷酸乙醇胺(18:1(δ9-反式)pe)、1,2二亚油酰基sn甘油基3磷酸乙醇胺(18:2pe，dlpe)、1,2二亚麻酰基sn甘油基3磷酸乙醇胺(18:3pe，dlnpe)、1,2二花生四烯酰基sn甘油基3磷酸乙醇胺(20:4pe，dape)、1,2双二十二碳六烯酰基sn甘油基3磷酸乙醇胺(22:6pe，dhape)、1,2二o十八碳烯基sn甘油基3磷酸胆碱(18:0二醚pc)、1,2二油酰基sn甘油基3磷酸外消旋(1甘油)钠盐(dopg)以及它们的任何组合。
[0263]
在一些方面中，锚定部分包含选自由以下组成的非限制性组的至少一种对称磷脂：dlpc、dmpc、dopc、dppc、dspc、dupc、18:0二醚pc、dlnpc、dapc、dhapc、dope、4me 16:0pe、dspe、dlpe、dlnpe、dape、dhape、dopg以及它们的任何组合。
[0264]
在一些方面中，锚定部分包含至少一种不对称磷脂。不对称磷脂可选自由以下组成的非限制性组：1肉豆蔻酰基2棕榈酰基sn甘油基3磷酸胆碱(14:0-16:0pc，mppc)、1肉豆蔻酰基2硬脂酰基sn甘油基3磷酸胆碱(14:0-18:0pc，mspc)、1棕榈酰基2乙酰基sn甘油基3磷酸胆碱(16:0-02:0pc)、1棕榈酰基2肉豆蔻酰基sn甘油基3磷酸胆碱(16:0-14:0pc，pmpc)、1棕榈酰基2硬脂酰基sn甘油基3磷酸胆碱(16:0-18:0pc，pspc)、1棕榈酰基2油酰基sn甘油基3磷酸胆碱(16:0-18:1pc，popc)、1棕榈酰基2亚油酰基sn甘油基3磷酸胆碱(16:0-18:2pc，plpc)、1棕榈酰基2花生四烯酰基sn甘油基3磷酸胆碱(16:0-20:4pc)、1棕榈酰基2二十二碳六烯酰基sn甘油基3磷酸胆碱(14:0-22:6pc)、1硬脂酰基2肉豆蔻酰基sn甘油基3磷酸胆碱(18:0-14:0pc，smpc)、1硬脂酰基2棕榈酰基sn甘油基3磷酸胆碱(18:0-16:0pc，sppc)、1硬脂酰基2油酰基sn甘油基3磷酸胆碱(18:0-18:1pc，sopc)、1硬脂酰基2亚油酰基sn甘油基3磷酸胆碱(18:0-18:2pc)、1硬脂酰基2花生四烯酰基sn甘油基3磷酸胆碱(18:0-20:4pc)、1硬脂酰基2二十二碳六烯酰基sn甘油基3磷酸胆碱(18:0-22:6pc)、1油酰基2肉豆蔻酰基sn甘油基3磷酸胆碱(18:1-14:0pc，ompc)、1油酰基2棕榈酰基sn甘油基3磷酸胆碱(18:1-16:0pc，oppc)、1油酰基2硬脂酰基sn甘油基3磷酸胆碱(18:1-18:0pc，ospc)、1棕榈酰基2油酰基sn甘油基3磷酸乙醇胺(16:0-18:1pe，pope)、1棕榈酰基2亚油酰基sn甘油基3磷酸乙醇胺(16:0-18:2pe)、1棕榈酰基2花生四烯酰基sn甘油基3磷酸乙醇胺(16:0-20:4pe)、1棕榈酰基2二十二碳六烯酰基sn甘油基3磷酸乙醇胺(16:0-22:6pe)、1硬脂酰基2油酰基sn甘油基3磷酸乙醇胺(18:0-18:1pe)、1硬脂酰基2亚油酰基sn甘油基3磷酸乙醇胺(18:0-18:2pe)、1硬脂酰基2花生四烯酰基sn甘油基3磷酸乙醇胺(18:0-20:4pe)、1硬脂酰基2二十二碳六烯酰基sn甘油基3磷酸乙醇胺(18:0-22:6pe)、1油酰基2胆固醇基半琥珀酰基sn甘油基3磷酸胆碱(ochemspc)以及它们的任何组合。
[0265]
为了提供更显著的核酸酶抗性、细胞摄取效率和更显著的rna干扰效应，磷脂酰乙醇胺可用作锚定部分，例如二肉豆蔻酰基磷脂酰乙醇胺、二棕榈酰基磷脂酰乙醇胺、1-棕榈酰基-2-油烯基-磷脂酰乙醇胺和二油酰基磷脂酰乙醇胺。
[0266]
可根据脂质和接头或bam的类型适当地选择脂质(例如，磷脂)和接头组合或bam(例如aso)的结合位点。除脂质的疏水性基团以外的任何位置都可通过化学键与接头或bam连接。例如，当使用磷脂酰乙醇胺时，可通过在磷脂酰乙醇胺的氨基与接头或bam之间形成酰胺键等来进行连接。当使用磷脂酰甘油时，可通过在甘油残基的羟基与接头或bam之间形成酯键、醚键等来进行连接。当使用磷脂酰丝氨酸时，可通过在丝氨酸残基的氨基或羧基与接头或bam之间形成酰胺键或酯键等来进行连接。当使用磷脂酸时，可通过在磷酸酯残基与
接头或bam之间形成磷酸酯键等来进行连接。当使用磷脂酰肌醇时，可通过在肌醇残基的羟基与接头或bam之间形成酯键、醚键等来进行连接。
[0267]
ii.a.4.溶血脂质(例如溶血磷脂)
[0268]
在一些方面中，锚定部分包含溶血脂质，例如溶血磷脂。溶血脂质是脂质的衍生物，其中一个或两个脂肪酰基链已被除去(通常通过水解)。溶血磷脂是磷脂的衍生物，其中一个或两个脂肪酰基链已通过水解除去。
[0269]
在一些方面中，锚定部分包含上文公开的任何磷脂，其中一个或两个酰基链已通过水解除去，并且因此所得溶血磷脂包含一个脂肪酸酰基链或不包含脂肪酸酰基链。
[0270]
在一些方面中，锚定部分包含溶血性甘油磷脂、溶血性鞘糖脂、溶血性磷脂酰胆碱、溶血性磷脂酰乙醇胺、溶血性磷脂酰肌醇或溶血性磷脂酰丝氨酸。
[0271]
在一些方面中，锚定部分包含选自由以下组成的非限制性组的溶血磷脂：1己酰基2羟基sn甘油基3磷酸胆碱(06:0 lyso pc)、1庚酰基2羟基sn甘油基3磷酸胆碱(07:0 lyso pc)、1辛酰基2羟基sn甘油基3磷酸胆碱(08:0 lyso pc)、1壬酰基2羟基sn甘油基3磷酸胆碱(09:0 lyso pc)、1癸酰基2羟基sn甘油基3磷酸胆碱(10:0 lyso pc)、1十一烷酰基2羟基sn甘油基3磷酸胆碱(11:0 lyso pc)、1月桂酰基2羟基sn甘油基3磷酸胆碱(12:0 lyso pc)、1十三烷酰基2羟基sn甘油基3磷酸胆碱(13:0 lyso pc)、1肉豆蔻酰基2羟基sn甘油基3磷酸胆碱(14:0 lyso pc)、1十五烷酰基2羟基sn甘油基3磷酸胆碱(15:0 lyso pc)、1棕榈酰基2羟基sn甘油基3磷酸胆碱(16:0 lyso pc)、1十七烷酰基2羟基sn甘油基3磷酸胆碱(17:0 lyso pc)、1硬脂酰基2羟基sn甘油基3磷酸胆碱(18:0 lyso pc)、1油酰基2羟基sn甘油基3磷酸胆碱(18:1 lyso pc)、1十九烷酰基2羟基sn甘油基3磷酸胆碱(19:0 lyso pc)、1二十烷酰基2羟基sn甘油基3磷酸胆碱(20:0lyso pc)、1山嵛酰基2羟基sn甘油基3磷酸胆碱(22:0 lyso pc)、1二十四烷酰基2羟基sn甘油基3磷酸胆碱(24:0 lyso pc)、1二十六烷酰基2羟基sn甘油基3磷酸胆碱(26:0 lyso pc)、1肉豆蔻酰基2羟基sn甘油基3磷酸乙醇胺(14:0 lyso pe)、1棕榈酰基2羟基sn甘油基3磷酸乙醇胺(16:0 lyso pe)、1硬脂酰基2羟基sn甘油基3磷酸乙醇胺(18:0 lyso pe)、1油酰基2羟基sn甘油基3磷酸乙醇胺(18:1lyso pe)、1十六烷基sn甘油基3磷酸胆碱(c16 lyso pc)以及它们的任何组合。
[0272]
ii.a.5维生素
[0273]
在一些方面中，锚定部分包含亲脂性维生素，例如叶酸、维生素a、维生素e或维生素k。在一些方面中，锚定部分包含维生素a。维生素a是一组不饱和营养有机化合物，其包括视黄醇、视黄醛、视黄酸和几种维生素原a类胡萝卜素(最显著的是β-胡萝卜素)。在一些方面中，锚定部分包含视黄醇。在一些方面中，锚定部分包含类视黄醇。类视黄醇是一类为维生素a的同效维生素或与其化学相关的化学化合物。在一些方面中，锚定部分包含第一代类视黄醇(例如，视黄醇、维甲酸、异维甲酸或阿利维甲酸)、第二代类视黄醇(例如，依曲替酯或阿曲汀)、第三代类视黄醇(例如，阿达帕林、贝沙罗汀或他扎罗汀)或它们的任何组合。
[0274][0275]
在一些方面中，锚定部分包含维生素e。生育酚是一类甲基化酚，其中许多具有维生素e活性。因此，在一些方面中，锚定部分包含α-生育酚、β-生育酚、γ-生育酚、δ-生育酚或它们的组合。
[0276]
α-生育酚
[0277]
β生育酚
[0278]
γ生育酚
[0279]
δ生育酚
[0280]
生育三烯酚也具有维生素e活性。生育三烯酚与生育酚之间的关键化学结构差异在于与生育酚的饱和侧链相比，生育三烯酚具有含三个碳-碳双键的不饱和类异戊二烯侧链。在一些方面中，锚定部分包含α-生育三烯酚、β-生育三烯酚、γ-生育三烯酚、δ-生育三烯酚或它们的组合。生育三烯酚可用下式表示
[0281]
[0282]
α(α)-生育三烯酚：r1＝me，r2＝me，r3＝me；
[0283]
β(β)-生育三烯酚：r1＝me，r2＝h，r3＝me；
[0284]
γ(γ)-生育三烯酚：r1＝h，r2＝me，r3＝me；
[0285]
δ(δ)-生育三烯酚：r1＝h，r2＝h，r3＝me。
[0286]
在一些方面中，锚定部分包含维生素k。在化学上，维生素k家族包含2-甲基-1.4-萘醌(3-)衍生物。维生素k包含两种天然同效维生素：维生素k1和维生素k2。维生素k1(也称为植物甲萘醌、叶绿醌或(e)-植物甲萘醌)的结构以存在植基为特征。维生素k2(甲基萘醌)的结构以分子中存在的聚异戊二烯侧链为特征，所述侧链可含有6至13个异戊二烯基单元。因此，维生素k2由许多相关的化学亚型组成，具有不同长度的由类异戊二烯原子组组成的碳侧链。mk-4是维生素k2的最常见形式。诸如mk-7、mk-8和mk-9的长链形式在发酵食品中占主导地位。更长链形式的维生素k2，诸如mk-10至mk-13由细菌合成，但它们未被良好吸收，并且几乎没有生物学功能。除了维生素k的天然形式外，还存在许多合成形式的维生素k，诸如维生素k3(甲萘醌；2-甲基萘-1,4-二酮)、维生素k4和维生素k5。
[0287]
因此，在一些方面中，锚定部分包含维生素k1、k2(例如，mk-4、mk-5、mk-6、mk-7、mk-8、mk-9、mk-10、mk-11、mk-12或mk-13)、k3、k4、k5或它们的任何组合。
[0288][0289]
ii.b.接头组合
[0290]
在一些方面中，bam通过接头组合与本文公开的疏水性膜锚定部分连接，所述接头组合可包含可裂解接头和/或不可裂解接头的任何组合。接头组合的主要功能是提供一个或多个锚定部分与bam靶标之间的最佳间距。例如，在aso的情况下，接头组合应减少空间位阻并定位aso，以便它可与靶核酸(例如mrna或mirna)相互作用。
[0291]
接头可易于裂解(“可裂解接头”)，从而促进生物活性分子的释放。因此，在一些方面中，本文公开的接头组合可包含可裂解接头。在生物活性分子保持活性的条件下，此类可裂解接头可能例如易感于酸诱导的裂解、光诱导的裂解、肽酶诱导的裂解、酯酶诱导的裂解和二硫键裂解。或者，接头可基本上抵抗裂解(“不可裂解接头”)。在一些方面中，可裂解接头包含间隔子。在一些方面中，间隔子是peg。
[0292]
在一些方面中，接头组合包含至少2、至少3、至少4、至少5或至少6个或更多个本文公开的不同接头。在一些方面中，接头组合中的接头可通过酯键联(例如，磷酸二酯或硫代磷酸酯)连接。
[0293]
在一些方面中，接头是锚定部分与bam(例如aso)之间的直接键。
[0294]
ii.b.1不可裂解接头
[0295]
在一些方面中，接头组合包含“不可裂解接头”。不可裂解接头是能够以稳定的共价方式连接本公开的经修饰的生物活性分子的两种或更多种组分(例如，生物活性分子和锚定部分；生物活性分子和可裂解接头；锚定部分和可裂解接头)并且不属于上文针对可裂解接头列出的类别的任何化学部分。因此，不可裂解接头基本上耐受酸诱导的裂解、光诱导的裂解、肽酶诱导的裂解、酯酶诱导的裂解和二硫键诱导的裂解。
[0296]
此外，不可裂解是指接头中或与接头相邻的化学键在环状二核苷酸和/或抗体不会失去其活性的条件下经受由酸、光不稳定裂解剂、肽酶、酯酶或裂解二硫键的化学或生理化合物诱导的裂解的能力。在一些方面中，生物活性分子通过另一个接头(例如自分解性接头)连接至接头。
[0297]
在一些方面中，接头组合包含不可裂解接头，所述不可裂解接头包含例如四甘醇(teg)、六甘醇(heg)、聚乙二醇(peg)、琥珀酰亚胺或它们的任何组合。在一些方面中，不可裂解接头包含间隔子单元以将生物活性分子连接至不可裂解接头。
[0298]
在一些方面中，一个或多个不可裂解接头包含连接在一起的较小单元(例如，heg、teg、甘油、c2至c12烷基等)。在一个方面中，键联是酯键联(例如，磷酸二酯或硫代磷酸酯)或其它键联。
[0299]
ii.b.1.a.乙二醇(heg、teg、peg)
[0300]
在一些方面中，接头组合包含不可裂解接头，其中所述不可裂解接头包含特征在于式r
3-(o-ch
2-ch2)
n-或r
3-(0-ch
2-ch2)
n-o-的聚乙二醇(peg)，其中r3是氢、甲基或乙基，并且n具有2至200的值。在一些方面中，接头包含间隔子，其中所述间隔子是peg。
[0301]
在一些方面中，peg接头是低聚乙二醇，例如二甘醇、三甘醇、四甘醇(teg)、五甘醇或六甘醇(heg)接头。
[0302]
在一些方面中，n具有2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17,18,19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、100、101、102、103、104、105、106、107、108、109、110、111、112、113、114、115、116、117、118、119、120、121、122、123、124、125、126、127、128、129、130、131、132、133、134、135、136、137、138、139、140、141、142、143、144、145、146、147、148、149、150、151、152、153、154、155、156、157、158、159、160、161、162、163、164、165、166、167、168、169、170、171、172、173、174、175、176、177、178、179、189、181、182、183、184、185、186、187、188、189、190、191、192、193、194、195、196、197、198、199或200的值。在一些方面中，n介于2与10之间、介于10与20之间、介于20与30之间、介于30与40之间、介于40与50之间、介于50与60之间、介于60与70之间、介于70与80之间、介于80与90之间、介于90与100之间、介于100与110之间、介于110与120之间、介于120与130之间、介于130与140之间、介于140与150之间、介于150与160之间、介于160与170之间、介于170与180之间、介于180与190之间或介于190与200之间。在一些具体方面中，n具有3至200、3至20、10至30或9至45的值。在一些方面中，peg是支链peg。支链peg具有3至10个源自中心核心基团的peg链。
[0303]
在某些方面中，peg部分是单分散聚乙二醇。在本公开的上下文中，单分散聚乙二醇(mdpeg)是具有单一的、限定链长和分子量的peg。mdpeg通常通过色谱法从聚合混合物中分离而产生。在某些式中，单分散peg部分被指定为缩写mdpeg。
[0304]
在一些方面中，peg是星形peg。星形peg具有10至100个源自中心核心基团的peg链。在一些方面中，peg是梳形peg。梳形peg具有通常接枝到聚合物主链上的多个peg链。
[0305]
在某些方面中，peg具有介于100g/mol与3000g/mol之间，特别是介于100g/mol与2500g/mol之间、更特别地大约100g/mol至2000g/mol的摩尔质量。在某些方面中，peg具有介于200g/mol与3000g/mol之间，特别是介于300g/mol与2500g/mol之间、更特别地大约400g/mol至2000g/mol的摩尔质量。
[0306]
在一些方面中，peg是peg
100
、peg
200
、peg
300
、peg
400
、peg
500
、peg
600
、peg
700
、peg
800
、peg
900
、peg
1000
、peg
1100
、peg
1200
、peg
1300
、peg
1400
、peg
1500
、peg
1600
、peg
1700
、peg
1800
、peg
1900
、peg
2000
、peg
2100
、peg
2200
、peg
2300
、peg
2400
、peg
2500
、peg
1600
、peg
1700
、peg
1800
、peg
1900
、peg
2000
、peg
2100
、peg
2200
、peg
2300
、peg
2400
、peg
2500
、peg
2600
、peg
2700
、peg
2800
、peg
2900或
peg
3000
。在一个特定方面中，peg是peg
400
。在另一个特定方面中，peg是peg
2000
。
[0307]
在一些方面中，本公开的接头组合可包含若干peg接头，例如侧接peg、heg或teg接头的可裂解接头。在一些方面中，接头组合包含(heg)n和/或(teg)n，其中n是介于1与50之间的整数，并且每个单元例如通过磷酸酯接头、硫代磷酸酯键联或它们的组合连接。
[0308]
ii.b.1.b.甘油和聚甘油(pg)
[0309]
在一些方面中，接头组合包含不可裂解接头，所述不可裂解接头包含由式((r3—o—(ch2—choh—ch2o)n—)描述的甘油单元或聚甘油(pg)，其中r3是氢、甲基或乙基，并且n具有3至200的值。在一些方面中，n具有3至20的值。在一些方面中，n具有10至30的值。
[0310]
在一些方面中，pg接头是二甘油、三甘油、四甘油(tg)、五甘油或六甘油(hg)接头。在一些方面中，n具有2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17,18,19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、100、101、102、103、104、105、106、107、108、109、110、111、112、113、114、115、116、117、118、119、120、121、122、123、124、125、126、127、128、129、130、131、132、133、134、135、136、137、138、139、140、141、142、143、144、145、146、147、148、149、150、151、152、153、154、155、156、157、158、159、160、161、162、163、164、165、166、167、168、169、170、171、172、173、174、175、176、177、178、179、189、181、182、183、184、185、186、187、188、189、190、191、192、193、194、195、196、197、198、199或200的值。在一些方面中，n介于2与10之间、介于10与20之间、介于20与30之间、介于30与40之间、介于40与50之间、介于50与60之间、介于60与70之间、介于70与80之间、介于80与90之间、介于90与100之间、介于100与110之间、介于110与120之间、介于120与130之间、介于130与140之间、介于140与150之间、介于150与160之间、介于160与170之间、介于170与180之间、介于180与190之间或介于190与200之间。
[0311]
在这些方面的一些替代方案中，n具有9至45的值。在一些方面中，异源部分是由式(r3—o—(ch2—chor5—ch2—o)n—)描述的支链聚甘油，其中r5是氢；或由式(r3—o—(ch2—choh—ch2—o)n—)描述的直链甘油链，并且r3是氢、甲基或乙基。在一些方面中，异源部分
是由式(r3—o—(ch2—chor5—ch2—o)n—)描述的超支化聚甘油，其中r5是氢；或由式(r3—o—(ch2—chor6—ch2—o)n—)描述的甘油链，其中r6是氢；或由式(r3—o—(ch2—chor7—ch2—o)n—)描述的甘油链，其中r7是氢；或由式(r3—o—(ch2—choh—ch2—o)n—)描述的直链甘油链，并且r3是氢、甲基或乙基。超支化甘油及其合成方法描述于oudshorn等人(2006)biomaterials 27:5471-5479；wilms等人(20100acc.chem.res.43,129-41以及其中引用的参考文献中。
[0312]
在某些方面中，pg具有介于100g/mol与3000g/mol之间，特别是介于100g/mol与2500g/mol之间、更特别地大约100g/mol至2000g/mol的摩尔质量。在某些方面中，pg具有介于200g/mol与3000g/mol之间，特别是介于300g/mol与2500g/mol之间、更特别地大约400g/mol至2000g/mol的摩尔质量。
[0313]
在一些方面中，pg是pg
100
、pg
200
、pg
300
、pg
400
、pg
500
、pg
600
、pg
700
、pg
800
、pg
900
、pg
1000
、pg
1100
、pg
1200
、pg
1300
、pg
1400
、pg
1500
、pg
1600
、pg
1700
、pg
1800
、pg
1900
、pg
2000
、pg
2100
、pg
2200
、pg
2300
、pg
2400
、pg
2500
、pg
1600
、pg
1700
、pg
1800
、pg
1900
、pg
2000
、pg
2100
、pg
2200
、pg
2300
、pg
2400
、pg
2500
、pg
2600
、pg
2700
、pg
2800
、pg
2900
或pg
3000。
在一个特定方面中，pg是pg
400
。在另一个特定方面中，pg是pg
2000
。
[0314]
在一些方面中，接头组合包含(甘油)n、和/或(hg)n和/或(tg)n，其中n是介于1与50之间的整数，并且每个单元例如通过磷酸酯接头、硫代磷酸酯键联或它们的组合连接。
[0315]
ii.b.1.c.脂肪族(烷基)接头
[0316]
在一些方面中，接头组合包含至少一个脂肪族(烷基)接头，例如丙基、丁基、己基或c2-c12烷基，如c2-c10烷基或c2-c6烷基。
[0317]
在一些方面中，接头组合包含烷基链，例如未取代的烷基。在一些方面中，接头组合包含取代的或未取代的烯基、取代的或未取代的炔基、芳基烷基、芳基烯基、芳基炔基、杂芳基烷基、杂芳基烯基、杂芳基炔基、杂环基烷基、杂环基烯基、杂环基炔基、芳基、杂芳基、杂环基、环烷基、环烯基、烷基芳基烷基、烷基芳基烯基、烷基芳基炔基、烯基芳基烷基、烯基reyl烯基、烯基芳基炔基、炔基芳基烷基、炔基芳基烯基、炔基芳基炔基、烷基杂芳基烷基、烷基杂芳基烷基、烷基杂芳基烯基、烷基杂芳基炔基、烯基杂芳基烷基、烯基杂芳基烯基、烯基杂芳基炔基、炔基杂芳基烷基、炔基杂芳基烯基、炔基杂芳基炔基、烷基杂环基烷基、烷基杂环基烯基、烷基杂环基炔基、烯基杂环基烷基、烯基杂环基烯基或烯基杂环基炔基。
[0318]
任选地，这些组分被取代。取代基包括醇、烷氧基(如甲氧基、乙氧基和丙氧基)、直链或支链烷基(如c1-c12烷基)、胺、氨基烷基(如氨基c1-c12烷基)、亚磷酰胺、磷酸酯、氨基磷酸酯、二硫代磷酸酯、硫代磷酸酯、酰肼、肼、卤素(如f、cl、br或i)、酰胺、烷基酰胺(如酰胺c1-c12烷基)、羧酸、羧酸酯、羧酸酐、羧酸卤化物、醚、磺酰基卤化物、亚氨酸酯、异氰酸酯、异硫氰酸酯、卤代甲酸酯、碳二亚胺加合物、醛、酮、巯基、卤代乙酰基、烷基卤化物、烷基磺酸酯、c(
═
o)ch
═
chc(
═
o)(马来酰亚胺)、硫醚、氰基、糖(如甘露糖、半乳糖和葡萄糖)、α,β-不饱和羰基、烷基汞或α,β-不饱和砜。
[0319]
除非另有说明，否则术语“烷基”本身或作为另一个取代基的一部分，意指具有指定碳原子数的直链或支链烃基(例如，c
1-c
10
意指1至10个碳原子)。通常，烷基将具有1至24个碳原子，例如具有1至10个碳原子、1至8个碳原子或1至6个碳原子。“低级烷基”是具有1至4个碳原子的烷基。术语“烷基”包括二价和多价基团。例如，在适当的情况下，例如，当式表
示烷基是二价时或者当取代基连接在一起形成环时，术语“烷基”包括“亚烷基”。烷基基团的实例包括但不限于甲基、乙基、正丙基、异丙基、正丁基、叔丁基、异丁基、仲丁基以及例如正戊基、正己基、正庚基和正辛基的同系物和异构体。
[0320]
术语“亚烷基”，本身或作为另一取代基的一部分，意指二价(双基)烷基，其中烷基在本文中定义。“亚烷基”例如但不限于-ch2ch2ch2ch
2-。通常，“亚烷基”将具有1至24个碳原子，例如，具有10个或更少碳原子(例如，1至8个或1至6个碳原子)。“低级亚烷基”是具有1至4个碳原子的亚烷基。
[0321]
术语“烯基”，本身或作为另一个取代基的一部分，是指具有2至24个碳原子和至少一个双键的直链或支链烃基。典型的烯基具有2至10个碳原子和至少一个双键。在一个方面中，烯基具有2至8个碳原子或2至6个碳原子和1至3个双键。示例性烯基包括乙烯基、2-丙烯基、1-丁-3-烯基、巴豆基、2-(丁二烯基)、2,4-戊二烯基、3-(1,4-戊二烯基)、2-异戊烯基、1-戊-3-烯基、1-己-5-烯基等。
[0322]
术语“炔基”，本身或作为另一个取代基的一部分，是指具有2至24个碳原子和至少一个三键的直链或支链、不饱和或多不饱和烃基。典型的“炔基”具有2至10个碳原子和至少一个三键。在本发明的一个方面中，炔基具有2至6个碳原子和至少一个三键。示例性炔基包括丙-1-炔基、丙-2-炔基(即，炔丙基)、乙炔基和3-丁炔基。
[0323]
术语“烷氧基”、“烷基氨基”和“烷硫基”(或硫代烷氧基)以其常规含义使用，并且是指分别通过氧原子、氨基或硫原子连接至分子的其余部分的烷基。
[0324]
术语“杂烷基”，本身或与另一个术语组合，意指由指定数目的碳原子(例如，c
2-c
10
或c
2-c8)和选自例如n、o、s、si、b和p(在一个方面中，n、o和s)的至少一个杂原子组成的稳定的直链或支链烃基团，其中氮、硫和磷原子任选地被氧化，并且一个或多个氮原子任选地被季铵化。一个或多个杂原子被置于杂烷基的任何内部位置。杂烷基的实例包括但不限于-ch
2-ch
2-o-ch3、-ch
2-ch
2-nh-ch3、-ch
2-ch
2-n(ch3)-ch3、-ch
2-s-ch
2-ch3、-ch
2-ch
2-s(o)-ch3、-ch
2-ch
2-s(o)
2-ch3、-ch＝ch-o-ch3、-ch
2-si(ch3)3、-ch
2-ch＝n-och3和-ch＝ch-n(ch3)-ch3。至多两个杂原子可以是连续的，诸如例如-ch
2-nh-och3和
–
ch
2-o-si(ch3)3。
[0325]
类似地，术语“杂亚烷基”，本身或作为另一取代基的一部分，是指衍生自杂烷基的二价基团，例如但不限于-ch
2-ch
2-s-ch
2-ch
2-和-ch
2-s-ch
2-ch
2-nh-ch
2-。通常，杂烷基将具有3至24个原子(碳和杂原子，不包括氢)(3至24元杂烷基)。在另一个实例中，杂烷基总共具有3至10个原子(3至10元杂烷基)或3至8个原子(3至8元杂烷基)。在适当的情况下，例如，当式表示杂烷基是二价时或者当取代基连接在一起形成环时，术语“杂烷基”包括“杂亚烷基”。
[0326]
术语“环烷基”，本身或与其它术语组合，表示饱和或不饱和的非芳族碳环基团，所述基团具有3至24个碳原子，例如具有3至12个碳原子(例如，c
3-c8环烷基或c
3-c6环烷基)。环烷基的实例包括但不限于环丙基、环丁基、环戊基、环己基、环庚基、1-环己烯基、3-环己烯基、环庚基等。术语“环烷基”也包括桥联多环(例如，双环)结构，诸如降冰片基、金刚烷基和双环[2.2.1]庚基。“环烷基”可与至少一个(例如，1至3个)选自芳基(例如，苯基)、杂芳基(例如，吡啶基)和非芳族(例如，碳环或杂环)环的其它环稠合。当“环烷基”包括稠合的芳基、杂芳基或杂环时，则“环烷基”通过碳环连接至分子的其余部分。
[0327]
术语“杂环烷基”、“杂环的”、“杂环”或“杂环基”，本身或与其它术语组合，表示本
领域技术人员已知的稳定组合的含有至少一个并且至多5个选自例如，n、o、s、si、b和p(例如，n、o和s)的杂原子的碳环非芳族环(例如，3至8元环和例如，4、5、6或7元环)，其中氮、硫和磷原子任选被氧化，并且一个或多个氮原子任选被季铵化(例如，1至4个选自氮、氧和硫的杂原子)，或含有至少一个并且至多10个杂原子(例如，1至5个选自n、o和s的杂原子)的4至8元环的稠环系统。示例性杂环烷基包括稠合苯环。当“杂环”基团包括稠合的芳基、杂芳基或环烷基环时，则“杂环”基团通过杂环连接至分子的其余部分。杂原子可占据杂环与分子的其余部分连接的位置。
[0328]
本公开的示例性杂环烷基或杂环基团包括吗啉基、硫代吗啉基、硫代吗啉基s-氧化物、硫代吗啉基s,s-二氧化物、哌嗪基、高哌嗪基、吡咯烷基、吡咯啉基、咪唑烷基、四氢吡喃基、哌啶基、四氢呋喃基、四氢噻吩基、哌啶基、高哌啶基、高吗啉基、高硫代吗啉基(homothiomorpholinyl)、高硫代吗啉基s,s-二氧化物、噁唑烷酮基、二氢吡唑基、二氢吡咯基、二氢吡唑基、二氢吡啶基、二氢嘧啶基、二氢呋喃基、二氢吡喃基、四氢噻吩基s-氧化物、四氢噻吩基s,s-二氧化物、高硫代吗啉基s-氧化物、1-(1,2,5,6-四氢吡啶基)、1-哌啶基、2-哌啶基、3-哌啶基、4-吗啉基、3-吗啉基、四氢呋喃-2-基、四氢呋喃-3-基、四氢噻吩-2-基、四氢噻吩-3-基、1-哌嗪基、2-哌嗪基等。
[0329]“芳基”意指具有单环(例如，苯基)或稠合至其它芳族或非芳族环(例如，1至3个其它环)的5、6或7元芳族碳环基团。当“芳基”包括非芳族环(诸如在1,2,3,4-四氢萘基中)或杂芳基时，则“芳基”通过芳环(例如，苯环)连接至分子的其余部分。芳基是任选取代的(例如，具有本文所述的1至5个取代基)。在一个实例中，芳基具有6至10个碳原子。芳基的非限制性实例包括苯基、1-萘基、2-萘基、喹啉、茚满基、茚基、二氢萘基、芴基、四氢萘基(tetralinyl)、苯并[d][1,3]二氧杂环戊烯基或6,7,8,9-四氢-5h-苯并[a]环庚烯基。在一个方面中，芳基选自苯基、苯并[d][1,3]二氧杂环戊烯基和萘基。在另一个方面中，芳基是苯基。
[0330]
术语“芳基烷基”或“芳烷基”旨在包括其中芳基或杂芳基与烷基连接以生成基团-烷基-芳基和-烷基-杂芳基(其中烷基、芳基和杂芳基在本文中定义)的那些基团。示例性“芳基烷基”或“芳烷基”包括苄基、苯乙基、吡啶基甲基等。
[0331]“芳氧基”意指基团-o-芳基，其中芳基如本文所定义。在一个实例中，芳氧基的芳基部分是苯基或萘基。在一个方面中，芳氧基的芳基部分是苯基。
[0332]
术语“杂芳基”或“杂芳族”是指含有至少一个选自n、o、s、si和b(例如，n、o和s)的杂原子(例如，1至5个杂原子，诸如1-3个杂原子)的多不饱和的5、6或7元芳族部分，其中氮和硫原子任选地被氧化，并且一个或多个氮原子任选被季铵化。“杂芳基”可以是单环或与其它芳基、杂芳基、环烷基或杂环烷基环(例如，1至3个其它环)稠合。当“杂芳基”包括稠合的芳基、环烷基或杂环烷基环时，则“杂芳基”通过杂芳环连接至分子的其余部分。杂芳基可通过碳或杂原子连接至分子的其余部分。
[0333]
在一个实例中，杂芳基具有4至10个碳原子和1至5个选自o、s和n的杂原子。杂芳基的非限制性实例包括吡啶基、嘧啶基、喹啉基、苯并噻吩基、吲哚基、吲哚啉基、哒嗪基、吡嗪基、异吲哚基、异喹啉基、喹唑啉基、喹喔啉基、酞嗪基、咪唑基、异噁唑基、吡唑基、噁唑基、噻唑基、吲哚嗪基、吲唑基、苯并噻唑基、苯并咪唑基、苯并呋喃基、呋喃基、噻吩基、吡咯基、噁二唑基、噻二唑基、三唑基、四唑基、异噻唑基、萘啶基、异色满基、色满基、四氢异喹啉基、
异吲哚啉基、异苯并四氢呋喃基、异苯并四氢噻吩基、异苯并噻吩基、苯并噁唑基、吡啶并吡啶基、苯并四氢呋喃基、苯并四氢噻吩基、嘌呤基、苯并二氧杂环戊烯基(benzodioxolyl)、三嗪基、蝶啶基、苯并噻唑基、咪唑并吡啶基、咪唑并噻唑基、二氢苯并异噁嗪基(dihydrobenzisoxazinyl)、苯并异噁嗪基(benzisoxazinyl)、苯并噁嗪基、二氢苯并异噻嗪基(dihydrobenzisothiazinyl)、苯并吡喃基、苯并噻喃基、色酮基、色满酮基(chromanonyl)、吡啶基-n-氧化物、四氢喹啉基、二氢喹啉基、二氢喹啉酮基、二氢异喹啉酮基、二氢香豆素基、二氢异香豆素基、异吲哚啉酮基(isoindolinonyl)、苯并二噁烷基、苯并噁唑啉酮基(benzoxazolinonyl)、吡咯基n-氧化物、嘧啶基n-氧化物、哒嗪基n-氧化物、吡嗪基-n-氧化物、喹啉基-n-氧化物、吲哚基n-氧化物、吲哚啉基n-氧化物、异喹啉基n-氧化物、喹唑啉基n-氧化物、喹喔啉基n-氧化物、酞嗪基n-氧化物、咪唑基n-氧化物、异噁唑基n-氧化物、噁唑基n-氧化物、噻唑基n-氧化物、吲哚嗪基n-氧化物、吲唑基n-氧化物、苯并噻唑基n-氧化物、苯并咪唑基n-氧化物、吡咯基n-氧化物、噁二唑基n-氧化物、噻二唑基n-氧化物、三唑基n-氧化物、四唑基n-氧化物、苯并噻喃基s-氧化物、苯并噻喃基s,s-二氧化物。示例性杂芳基包括咪唑基、吡唑基、噻二唑基、三唑基、异噁唑基、异噻唑基、咪唑基、噻唑基、噁二唑基和吡啶基。其它示例性杂芳基包括1-吡咯基、2-吡咯基、3-吡咯基、3-吡唑基、2-咪唑基、4-咪唑基、吡嗪基、2-噁唑基、4-噁唑基、2-苯基-4-噁唑基、5-噁唑基、3-异噁唑基、4-异噁唑基、5-异噁唑基、2-噻唑基、4-噻唑基、5-噻唑基、2-呋喃基、3-呋喃基、2-噻吩基、3-噻吩基、2-吡啶基、3-吡啶基、吡啶-4-基、2-嘧啶基、4-嘧啶基、5-苯并噻唑基、嘌呤基、2-苯并咪唑基、5-吲哚基、1-异喹啉基、5-异喹啉基、2-喹喔啉基、5-喹喔啉基、3-喹啉基、6-喹啉基。以上所提到的芳环和杂芳环体系中每个的取代基选自由以下所述的可接受的芳基取代基组成的组。
[0334]
脂肪族接头的实例包括以下结构：—o—co—o—；—nh—co—o—；—nh—co—nh—；—nh—(ch2)
n1
—；—s—(ch2)
n1
—；—co—(ch2)
n1
—co—；—co—(ch2)
n1
—nh—；—nh—(ch2)
n1
—nh—；—co—nh—(ch2)
n1
—nh—co—；—c(
═
s)—nh—(ch2)
n1
—nh—co—；—c(
═
s)—nh—(ch2)
n1
—nh—c—(
═
s)—；—co—o—(ch2)
n1
—o—co—；—c(
═
s)—o—(ch2)
n1
—o—co—；—c(
═
s)—o—(ch2)
n1
—o—c—(
═
s)—；—co—nh—(ch2)
n1
—o—co—；—c(
═
s)—nh—(ch2)
n1
—o—co—；—c(
═
s)—nh—(ch2)
n1
—o—c—(
═
s)—；—co—nh—(ch2)
n1
—o—co—；—c(
═
s)—nh—(ch2)
n1
—co—；—c(
═
s)—o—(ch2)
n1
—nh—co—；—c(
═
s)—nh—(ch2)
n1
—o—c—(
═
s)—；—nh—(ch2ch2o)
n2
—ch(ch2oh)—；—nh—(ch2ch2o)
n2
—ch2—；—nh—(ch2ch2o)
n2
—ch2—co—；—o—(ch2)
n3
—s—s—(ch2)
n4
—o—p(
═
o)2—；—co—(ch2)
n3
—o—co—nh—(ch2)
n4
—；—co—(ch2)
n3
—co—nh—(ch2)
n4
—；—(ch2)
n1
nh—；—c(o)(ch2)
n1
nh—；—c(o)—(ch2)
n1-c(o)—；—c(o)—(ch2)
n1-c(o)o—；—c(o)—o—；—c(o)—(ch2)
n1-nh—c(o)—；—c(o)—(ch2)
n1
—；—c(o)—nh—；—c(o)—；—(ch2)
n1-c(o)—；—(ch2)
n1-c(o)o—；—(ch2)
n1
—；—(ch2)
n1-nh—c(o)—；其中n1是介于1与40之间(例如，2至20或2至12)的整数；n2是介于1与20之间(例如，1至10或1至6)的整数；n3和n4可相同或不同，并且是介于1与20之间(例如，1至10或1至6)的整数。
[0335]
在一些方面中，接头组合包含(c3)n、(c4)n、(c5)n、(c6)n、(c7)n或(c8)n或它们的组合，其中n是介于1与50之间的整数，并且每个单元例如通过磷酸酯接头、硫代磷酸酯键联或它们的组合连接。
[0336]
ii.b.2.可裂解接头
[0337]
在一些方面中，本文公开的aso的不同组分可以是可裂解接头的接头。术语可裂解接头是指包含至少一个可断裂或裂解的键联或化学键的接头。如本文所用，术语裂解是指以产生两个或更多个相对较小分子的方式使相对大的分子中的一个或多个化学键断裂。裂解可例如由例如核酸酶、肽酶、蛋白酶、磷酸酶、氧化酶或还原酶介导，或者由特定物理化学条件，例如氧化还原环境、ph、活性氧类的存在或特定波长的光介导。
[0338]
在一些方面中，如本文所用的术语“可裂解”是指例如可快速降解的接头，诸如例如磷酸二酯和二硫化物，而术语“不可裂解”是指例如更稳定的键联，诸如例如，耐核酸酶的硫代磷酸酯。
[0339]
在一些方面中，可裂解接头是二核苷酸或三核苷酸接头、二硫化物、亚胺、硫缩酮、val-cit二肽或它们的任何组合。
[0340]
在一些方面中，可裂解接头包含缬氨酸-丙氨酸-氨基甲酸对氨基苄酯或缬氨酸-瓜氨酸-氨基甲酸对氨基苄酯。
[0341]
ii.b.2.a.氧化还原可裂解接头
[0342]
在一些方面中，接头组合包含氧化还原可裂解接头。作为非限制性实例，一种类型的可裂解接头是在还原或在氧化时裂解的氧化还原可裂解连接基团。在一些方面中，氧化还原可裂解接头含有二硫键，即，它是二硫化物可裂解接头。可通例如过细胞内硫醇、氧化酶或还原酶来还原氧化还原可裂解接头。
[0343]
ii.b.2.b.活性氧类(ros)可裂解接头
[0344]
在一些方面中，接头组合可包含可裂解接头，所述可裂解接头可由活性氧类(ros)，诸如例如由炎症过程如活化的嗜中性粒细胞产生的超氧化物(of)或过氧化氢(h2o2)裂解。在一些方面中，ros可裂解接头是硫缩酮可裂解接头。参见例如，美国专利8,354,455b2，所述专利以引用的方式整体并入本文。
[0345]
ii.b.2.c.ph依赖性可裂解接头
[0346]
在一些方面中，接头是包含酸可裂解的连接基团的“酸不稳定型接头”，所述连接基团是在酸性条件(ph《7)下选择性地裂解的连接基团。
[0347]
作为非限制性实例，酸可裂解的连接基团在酸性环境，例如约6.0、5.5、5.0或更低中裂解。在一些方面中，ph是约6.5或更低。在一些方面中，接头由诸如可充当广义酸的酶，例如肽酶(其可以是底物特异性的)或磷酸酶裂解。在细胞中，某些低ph细胞器(诸如内体和溶酶体)可为酸可裂解的连接基团提供裂解环境。虽然人血清的ph是7.4，但细胞中的平均ph略低，在约7.1-7.3范围内。内体也具有酸性ph，在5.5至6.0的范围内，并且溶酶体是在甚至更酸性的ph下约5.0。因此，ph依赖性可裂解接头在本领域中有时称为内体不稳定型接头。
[0348]
酸可裂解基团可具有通式-c＝nn-、c(o)o或-oc(o)。在另一个非限制性实例中，例如，当连接至酯氧(烷氧基)的碳连接至芳基、取代的烷基或叔烷基如二甲基戊基或叔丁基时。酸可裂解的连接基团的实例包括但不限于胺、亚胺、氨基酯、苯甲酸亚胺、二原酸酯、聚磷酸酯、聚磷腈、缩醛、乙烯基醚、腙、顺式-乌头酸酯、酰肼、硫代氨基甲酰基、米帕明(imizine)、叠氮基甲基-甲基马来酸酐、硫代丙酸酯、掩蔽的内体溶解剂、柠康酰基(citraconyl)或它们的任何组合。二硫键联也对ph敏感。
[0349]
在一些方面中，接头包含低ph不稳定型腙键。此类酸不稳定型键已广泛用于缀合物领域，例如抗体-药物缀合物。参见例如，zhou等人(2011)biomacromolecules 12:1460-7；yuan等人(2008)acta biomater.4:1024-37；zhang等人(2007)acta biomater.6:838-50；yang等人(2007)j.pharmacol.exp.ther.321:462-8；reddy等人(2006)cancer chemother.pharmacol.58:229-36；doronina等人(2003)nature biotechnol.21:778-84。
[0350]
在某些方面中，接头包含选自以下的低ph不稳定型键：在酸性环境(例如，ph小于7，大于约4)中不稳定、从而形成二醇和酮的缩酮类；在酸性环境(例如，ph小于7，大于约4)中不稳定、从而形成二醇和醛的缩醛类；在酸性环境(例如，ph小于7，大于约4)中不稳定、从而形成胺和醛或酮的亚胺类或亚胺鎓类(iminiums)；在酸性条件下不稳定的硅-氧-碳键联；硅-氮(硅氮烷)键联；硅-碳键联(例如，芳基硅烷、乙烯基硅烷和烯丙基硅烷)；马来酰胺酸(maleamate)(从马来酸酐衍生物和胺合成的酰胺键)；原酸酯；腙；被设计为经受酸催化的水解的活化羧酸衍生物(例如酯、酰胺)；或乙烯基醚。
[0351]
其它实例可在美国专利号9,790,494b2和8,137,695b2中找到，其内容以引用的方式整体并入本文。
[0352]
ii.b.2.d.酶可裂解接头
[0353]
在一些方面中，接头组合可包含可由细胞内或细胞外酶，例如蛋白酶、酯酶、核酸酶、酰胺酶(amidades)裂解的接头。可裂解接头组合中的特定接头的酶的范围取决于接头的特定键和化学结构。因此，肽接头可例如由肽酶(peptidades)裂解，含有酯键联的接头可例如由酯酶裂解；含有酰胺键联的接头可例如由酰胺酶裂解；等等。
[0354]
ii.b.2.e.蛋白酶可裂解接头
[0355]
在一些方面中，接头组合包含蛋白酶可裂解接头，即可由内源性蛋白酶裂解的接头。只有某些肽在细胞内或细胞外容易地裂解。参见例如，trout等人,79proc.natl.acad.sci.usa,626-629(1982)和umemoto等人43int.j.cancer,677-684(1989)。可裂解接头可含有由α-氨基酸单元和肽键组成的可裂解位点，肽键在化学上是一个氨基酸的羧酸根与第二氨基酸的氨基之间的酰胺键。其它酰胺键，诸如羧酸根与赖氨酸的α-氨基之间的键不被理解为是肽键并且被认为是不可裂解的。
[0356]
在一些方面中，蛋白酶可裂解接头包含蛋白酶的裂解位点，所述蛋白酶是例如脑啡肽酶(calla或cdio)、甲拌磷寡肽酶(top)、白三烯a4水解酶、内皮缩血管肽转化酶、ste24蛋白酶、溶神经素、线粒体中间肽酶、间质胶原酶、胶原酶、溶基质素、巨噬细胞弹性酶、基质溶解因子、明胶酶、穿膜肽酶(meprins)、前胶原c-内肽酶、前胶原n-内肽酶、adam和adamt金属蛋白酶、髓磷脂相关的金属蛋白酶、釉质溶素(enamelysin)、肿瘤坏死因子α-转化酶、胰岛素溶酶(insulysin)、苯乙肼裂解酶(nardilysin)、线粒体加工肽酶、magnolysin、dactylysin样金属蛋白酶、嗜中性粒细胞胶原酶、基质金属蛋白酶、膜型基质金属蛋白酶、sp2内肽酶、前列腺特异性抗原(psa)、纤溶酶、尿激酶、人成纤维细胞活化蛋白质(fapα)、胰蛋白酶、胰凝乳蛋白酶、降钙蛋白酶(caldecrin)、胰弹性蛋白酶、胰内肽酶、肠肽酶、白细胞弹性蛋白酶、成髓细胞、类糜蛋白酶(chymase)、类胰蛋白酶、颗粒酶、角质层糜蛋白酶、顶体蛋白酶、激肽释放酶、补体组分和因子、替代补体途径c3/c5转化酶、甘露糖结合蛋白相关的丝氨酸蛋白酶、凝血因子、凝血酶、蛋白c、u和t型纤溶酶原活化剂、组织蛋白酶g、丝氨酸穿膜蛋白酶(hepsin)、前列腺蛋白(prostasin)、肝细胞生长因子活化内肽酶、枯草杆菌蛋白
酶/kexin型前蛋白转化酶、弗林蛋白酶、前蛋白转化酶、脯氨酰肽酶、酰基氨基酰基肽酶、肽基-glycaminase、信号肽酶、n末端亲核试剂氨基水解酶、20s蛋白酶体、γ-谷氨酰转肽酶、线粒体内肽酶、线粒体内肽酶ia、htra2肽酶、蛋白裂解酶(matriptase)、位点1蛋白酶、天冬酰胺内肽酶(legumain)、组织蛋白酶、半胱氨酸组织蛋白酶、钙蛋白酶、泛素异肽酶t、半胱天冬酶、糖基磷脂酰肌醇蛋白转酰胺酶、癌症促凝血剂、激素原硫醇蛋白酶、γ-谷氨酰基水解酶、博莱霉素水解酶、成纤维细胞活化蛋白(seprase)、组织蛋白酶b、组织蛋白酶d、组织蛋白酶l、组织蛋白酶m、蛋白酶k、胃蛋白酶、凝乳酶(chymosyn)、胃亚蛋白酶(gastricsin)、肾素、酵母天冬酶(yapsin)和/或mapsin、前列腺特异性抗原(psa)或通常任何asp-n、glu-c、lys-c或arg-c蛋白酶。参见例如，cancer res.77(24):7027-7037(2017)，其以引用的方式整体并入本文。
[0357]
在一些方面中，可裂解接头组分包含肽，所述肽包含一至十个氨基酸残基。在这些方面中，肽允许蛋白酶裂解接头，由此有助于在暴露于细胞内蛋白酶(如溶酶体酶)时释放生物活性分子(doronina等人(2003)nat.biotechnol.21:778-784)。示例性肽包括但不限于二肽、三肽、四肽、五肽和六肽。
[0358]
肽可包含天然存在的和/或非天然氨基酸残基。术语“天然存在的氨基酸”是指ala、asp、cys、glu、phe、gly、his、he、lys、leu、met、asn、pro、gin、arg、ser、thr、val、trp和tyr。“非天然氨基酸”(即氨基酸不是天然存在的)包括，作为非限制性实例，高丝氨酸、高精氨酸、瓜氨酸、苯基甘氨酸、牛磺酸、碘代酪氨酸、硒代半胱氨酸、正亮氨酸(“nle”)、正缬氨酸(“nva”)、β-丙氨酸、l-或d-萘丙氨酸、鸟氨酸(“orn”)等。肽可被设计和优化以由特定酶进行酶促裂解，所述特定酶例如，肿瘤相关蛋白酶、组织蛋白酶b、c和d或纤溶酶蛋白酶。
[0359]
氨基酸还包括天然和非天然氨基酸的d-形式。“d
‑”
表示具有“d”(右旋)构型的氨基酸，与天然存在的(“l
‑”
)氨基酸中的构型相反。可商购(sigma chemical co.，advanced chemtech)或使用本领域已知的方法合成天然或非天然氨基酸。示例性二肽包括但不限于缬氨酸-丙氨酸、缬氨酸-瓜氨酸、苯丙氨酸-赖氨酸、n-甲基-缬氨酸-瓜氨酸、环己基丙氨酸-赖氨酸和β-丙氨酸-赖氨酸。示例性三肽包括但不限于甘氨酸-缬氨酸-瓜氨酸(gly-val-cit)和甘氨酸-甘氨酸-甘氨酸(gly-gly-gly)。
[0360]
ii.b.2.f.酯酶可裂解接头
[0361]
一些接头由酯酶裂解(“酯酶可裂解接头”)。只有某些酯可由细胞内部或外部存在的酯酶和酰胺酶裂解。酯通过羧酸与醇之间的缩合作用形成。简单的酯是用简单的醇产生的酯，所述简单的醇诸如脂肪醇和小的环醇以及小的芳族醇。基于酯的可裂解的连接基团的实例包括但不限于亚烷基、亚烯基和亚炔基的酯。酯可裂解的连接基团具有通式-c(o)o-或-oc(o)-。
[0362]
ii.b.2.g.磷酸酶可裂解接头
[0363]
在一些方面中，接头组合可包含基于磷酸酯的可裂解的连接基团，所述连接基团由降解或水解磷酸酯基团的剂裂解。裂解细胞内磷酸酯基团的剂的一个实例是酶，如细胞内磷酸酶。基于磷酸酯的连接基团的实例是—o—p(o)(ork)—o—、—o—p(s)(ork)—o—、—o—p(s)(srk)—o-、-s-p(o)(ork)-o-、-o-p(o)(ork)-s-、-s-p(o)(ork)-s-、-o-p(s)(ork)-s-、-sp(s)(ork)-o-、-op(o)(rk)-o-、-op(s)(rk)-o-、-sp(o)(rk)-o-、-sp(s)(rk)-o-、-sp(o)(rk)-s-或-op(s)(rk)-s-。在各个方面中，rk是以下中的任一者：nh2、bh3、ch3、c
1-6
烷基、c
6-10
芳基、c
1-6
烷氧基和c
6-10
芳基-氧基。在一些方面中，c
1-6
烷基和c
6-10
芳基是未取代的。其它非限制性实例是-o-p(o)(oh)-o-、-o-p(s)(oh)-o-、-o-p(s)(sh)-o-、-s-p(o)(oh)-o-、o-p(o)(oh)-s-、-s-p(o)(oh)-s-、-o-p(s)(oh)-s-、-s-p(s)(oh)-o-、-o-p(o)(h)-o-、-o-p(s)(h)-o-、-s-p(o)(h)-o-、-sp(s)(h)-o-、-sp(o)(h)-s-、-op(s)(h)-s-或-o-p(o)(oh)-o-。
[0364]
ii.b.2.h.光活化可裂解接头
[0365]
在一些方面中，组合接头包含光活化可裂解接头，例如硝基苄基接头或包含硝基苄基反应性基团的接头。
[0366]
ii.b.2.i.自分解性接头
[0367]
在一些方面中，接头组合包含自分解性接头。在一些方面中，本公开的ev(例如，外泌体)中的自分解性接头在蛋白酶可裂解接头的酶促裂解后经历1,4消除。在一些方面中，本公开的ev(例如，外泌体)中的自分解性接头在蛋白酶可裂解接头的酶促裂解后经历1,6消除。在一些方面中，自分解性接头是例如对氨基苄基(pab)衍生物，如氨基甲酸对氨基苄酯(pabc)、对氨基苄基醚(pabe)、碳酸对氨基苄酯或它们的组合。在某些方面中，自分解性接头包含芳族基团。在一些方面中，芳族基团选自由以下组成的组：苄基、肉桂基、萘基和联苯基。在一些方面中，芳族基团是杂环的。在其它方面中，芳族基团包含至少一个取代基。在一些方面中，至少一个取代基选自由以下组成的组：f、cl、i、br、oh、甲基、甲氧基、no2、nh2、no
3+
、nhcoch3、n(ch3)2、nhcocf3、烷基、卤代烷基、c
1-c8烷基卤化物、羧酸酯、硫酸酯、氨基磺酸酯和磺酸酯。在其它方面中，芳族基团中的至少一个c被n、o或c-r*取代，其中r*独立地选自h、f、cl、i、br、oh、甲基、甲氧基、no2、nh2、no
3+
、nhcoch3、n(ch3)2、nhcocf3、烷基、卤代烷基、c
1-c8烷基卤化物、羧酸酯、硫酸酯、氨基磺酸酯和磺酸酯。
[0368]
在一些方面中，自分解性接头包含氨基甲酸氨基苄酯基团(例如，氨基甲酸对氨基苄酯)、氨基苄基醚基团或碳酸氨基苄酯基团。在一个方面中，自分解性接头是氨基甲酸对氨基苄酯(pabc)。pabc是用于自分解性位点特异性前药活化的最有效且最广泛的连接子(connector)键联(参见例如，carl等人j.med.chem.24:479-480(1981)；wo 1981/001145；rautio等人,nature rev.drug disc.7:255-270(2008)；simplicio等人,molecules 13:519-547(2008))。
[0369]
在一些方面中，自分解性接头将生物活性分子(例如，aso)连接至蛋白酶可裂解底物(例如，val-cit)。在具体方面中，pabc自分解性接头的氨基甲酸酯基团连接至生物活性分子(例如，aso)的氨基，并且pabc自分解性接头的氨基连接至蛋白酶可裂解底物。
[0370]
氨基苄基的芳环可任选地被芳环上的一个或多个(例如，r1和/或r2)取代基取代，所述取代基替代以其它方式连接至形成环的四个未取代的碳中的一个的氢。如本文所用，符号“r
x”(例如，r1、r2、r3、r4)是表示如本文所述的取代基的一般缩写。取代基可提高对氨基苄基的自分解能力(hay等人,j.chem soc.,perkin trans.1:2759-2770(1999)；还参见，sykes等人j.chem.soc.,perkin trans.1:1601-1608(2000))。
[0371]
可例如通过1,4消除、1,6-消除(例如，pabc)、1,8消除(例如，对氨基肉桂醇)、β-消除、环化消除(例如，4-氨基丁醇酯和乙二胺)、环化/内酯化、环化/内酯化等发生自分解性消除。参见例如，singh等人curr.med.chem.15:1802-1826(2008)；greenwald等人j.med.chem.43:475-487(2000)。
[0372]
在一些方面中，自分解性间隔子可包含例如肉桂基、萘基或联苯基(参见例如，blencowe等人polym.chem.2:773-790(2011))。在一些方面中，自分解性接头包含杂环(参见例如，美国专利号7,375,078；7,754,681)。许多同源芳族(参见例如，carl等人j.med.chem.24:479(1981)；senter等人j.org.chem.55:2975(1990)；taylor等人j.org.chem.43:1197(1978)；andrianomenjanahary等人bioorg.med.chem.lett.2:1903(1992))以及在水性和生理条件下可自分解的基于香豆素(参见例如，weinstein等人chem.commun.46:553(2010))、呋喃、噻吩、噻唑、噁唑、异噁唑、吡咯、吡唑(参见例如，hay等人j.med.chem.46:5533(2003))、吡啶(参见例如，perry-feigenbaum等人org.biomol.chem.7:4825(2009))、咪唑酮(参见例如，nailor等人bioorg.med.chem.lett.z:1267(1999)；hay和denny,tetrahedron lett.38:8425(1997))和三唑(参见例如，bertrand和gesson,j.org.chem.72:3596(2007))的杂芳族基团是本领域已知的。还参见美国专利号7,691,962；7,091,186；美国专利公布号us2006/0269480；us2010/0092496；us2010/0145036；us2003/0130189；us2005/0256030)。
[0373]
在一些方面中，本文公开的接头组合包含串联的多于一个自分解性接头，例如两个或更多个pabc单元。参见例如，de groot等人j.org.chem.66:8815-8830(2001)。在一些方面中，本文公开的接头组合可包含与荧光探针连接的自分解性接头(例如，对氨基苄醇或对羧基苯甲醛或乙醛酸(glyoxilic acid)的半硫代缩醛胺(hemithioaminal)衍生物)(参见例如，meyer等人org.biomol.chem.8:1777-1780(2010))。
[0374]
当自分解性接头中的取代基由其从左至右书写的常规化学式指定时，其同样包括将由从右向左书写结构得到的化学上相同的取代基。例如，
“‑
ch2o
‑”
还意在表示
“‑
och2‑”
。
[0375]
自分解性，例如在如上所述的对氨基苄基自分解性接头中的r1和/或r2取代基中的取代基可包括例如烷基、亚烷基、烯基、炔基、烷氧基、烷基氨基、烷硫基、杂烷基、环烷基、杂环烷基、芳基、芳基烷基、芳氧基、杂芳基等。当本公开的化合物包含多于一个取代基时，则独立地选择每个取代基。
[0376]
在一些具体方面中，自分解性接头连接至具有下式的可裂解肽接头，组合具有下式：
[0377]-a
a-y
y-[0378]
其中每个
–
a-独立地是氨基酸单元，a独立地是1至12的整数；并且-y-是自分解性间隔子，并且y是1或2。在一些方面中，-a
a-是二肽、三肽、四肽、五肽或六肽。在一些方面中，
–aa-选自由以下组成的组：缬氨酸-丙氨酸、缬氨酸-瓜氨酸、苯丙氨酸-赖氨酸、n-甲基缬氨酸-瓜氨酸、环己基丙氨酸-赖氨酸和β-丙氨酸-赖氨酸。在一些方面中，
–aa-是缬氨酸-丙氨酸或缬氨酸-瓜氨酸。
[0379]
在一些方面中，自分解性接头
–yy-具有下式：
[0380][0381]
其中每个r2独立地是c
1-8
烷基、-o-(c
1-8
烷基)、卤素、硝基或氰基；并且m是0至4的
整数。在一些方面中，m是0、1或2。在一些方面中，m是0。
[0382]
在一些方面中，可裂解接头是缬氨酸-丙氨酸-氨基甲酸对氨基苄酯或缬氨酸-瓜氨酸-氨基甲酸对氨基苄酯。
[0383]
ii.b.3.反应性部分(rm)
[0384]
本公开的aso通过化学合成或通过它们的组分之间的化学反应产生。例如，在一些方面中，包含反应性基团(例如，马来酰亚胺)的锚定部分可与包含马来酰亚胺反应基团的bam反应，以产生本公开的经修饰的bam，其中所述锚定部分可插入外泌体的膜的脂质双层中，从而将bam连接至外泌体的表面。
[0385]
本公开的经修饰的bam的任何组分或组分组可至少包含rg和/或rm，这将允许所述组分通过一个反应或一系列反应连接，以产生本公开的经修饰的bam。用于产生经修饰的bam的示例性合成模式包括：
[0386]
[am]-/rg/+/rm/-[bam]
→
[am]-[bam]
[0387]
[am]-/rm/+/rg/-[bam]
→
[am]-[bam]
[0388]
[am]-[l]-/rm/+/rg/-[bam]
→
[am]-[l]-[bam]
[0389]
[am]-[l]-/rg/+/rm/-[bam]
→
[am]-[l]-[bam]
[0390]
[am]-/rm/+/rg/-[l]-[bam]
→
[am]-[l]-[bam]
[0391]
[am]-/rg/+/rm/-[l]-[bam]
→
[am]-[l]-[bam]
[0392]
[am]-[l]-/rm/+/rg/-[l]-[bam]
→
[am]-[l]-[l]-[bam]
[0393]
[am]-[l]-/rg/+/rm/-[l]-[bam]
→
[am]-[l]-[l]-[bam]
[0394]
其中[am]是锚定部分，[bam]是生物活性分子，[l]是接头或接头组合，/rm/是反应性部分，并且/rg/是反应性基团。在所提供的任何示意图中，bam可例如通过其5'端或3'端连接。
[0395]
用于在bam的合成中产生中间体的示例性合成模式包括：
[0396]
[am]-/rm/+/rg/-[l]
→
[am]-[l]
[0397]
[am]-/rg/+/rm/-[l]
→
[am]-[l]
[0398]
[l]-/rm/+/rg/-[l]
→
[l]-[l]
[0399]
[l]-/rg/+/rm/-[l]
→
[l]-[l]
[0400]
[l]-/rm/+/rg/-[bam]
→
[l]-[bam]
[0401]
[l]-/rg/+/rm/-[bam]
→
[l]-[bam]
[0402]
其中[am]是锚定部分，[bam]是生物活性分子，[l]是接头或接头组合，/rm/是反应性部分，并且/rg/是反应性基团。在所提供的任何示意图中，bam可例如通过其5'端或3'端连接。
[0403]
在一些方面中，反应性基团“/rg/”可以是例如氨基、硫醇基团、羟基、羧酸基团或叠氮化物基团。可与这些反应性基团反应的特定反应性部分“/rm/”在下文更详细地描述。
[0404]
[am]-(/rm/)n+(/rg/-[l]-[bam])n
→
[am]-[l]-[bam]
[0405]
本文公开的任何锚定部分、接头或接头组合或bam可缀合至反应性部分，例如氨基反应性部分(例如，nhs-酯、对硝基苯酚、异硫氰酸酯、异氰酸酯或醛)、硫醇反应性部分(例如，丙烯酸酯、马来酰亚胺或吡啶基二硫化物)、羟基反应性部分(例如，异硫氰酸酯或异氰酸酯)、羧酸反应性部分(例如，环氧化物)或叠氮化物反应性部分(例如，炔烃)。
[0406]
可用于共价结合本文公开的两种组分(例如，锚定部分和bam，或锚定部分和接头，或锚定部分和接头，或两个接头，或接头和bam，或两个锚定部分)的示例性反应性部分包括例如n-琥珀酰亚胺基-3-(2-吡啶基二硫代)丙酸酯、n-4-马来酰亚胺丁酸、s-(2-吡啶基二硫代)半胱胺、碘乙酰氧基琥珀酰亚胺、n-(4-马来酰亚胺丁酰基氧基)琥珀酰亚胺、n-[5-(3'-马来酰亚胺丙基酰胺)-1-羧基戊基]亚氨基二乙酸、n-(5-氨基戊基)亚氨基二乙酸和1'-[(2-氰基乙基)-(n,n-二异丙基)]-亚磷酰胺)。双功能接头(含有两个官能团的接头)也是可用的。
[0407]
在一些方面中，锚定部分、接头或bam可包含末端氧氨基，例如—onh2、肼基、—nhnh2、巯基(即，sh或硫醇)或烯烃(例如，ch
═
ch2)。在一些方面中，锚定部分、接头或bam可例如在末端位置包含亲电子部分，例如醛、烷基卤化物、甲磺酸酯、甲苯磺酸酯、间硝基苯磺酸或对溴苯磺酸酯，或活化的羧酸酯，例如nhs酯、亚磷酰胺或五氟苯基酯。在一些方面中，可通过将配体的亲核基团(例如羟基、硫醇或氨基)与亲电子基团偶联来形成共价键。本发明适用于所有方式的反应性基团和反应性部分，包括但不限于本领域已知的那些。
[0408]
如本文所用，术语“保护基团”是指本领域中已知在合成程序期间保护反应性基团(包括但不限于羟基、氨基和硫醇基团)免于不需要的反应的不稳定化学部分。保护基团通常选择性地和/或正交地用于在其它反应性位点的反应期间保护位点，并且然后可除去以留下原样未受保护的基团或可用于进一步反应。如本领域中已知的保护基团通常描述于greene和wuts,protective groups in organic synthesis,第3版,john wiley&sons,new york(1999)中。
[0409]
另外，各种合成步骤可以交替顺序或次序执行以得到所需化合物。可用于合成本文所述的化合物的合成化学转化和保护基团方法论(保护和脱保护)在本领域中是已知的，并且包括例如如以下文献中描述的那些：r.larock,comprehensive organic transformations,vch publishers(1989)；t.w.greene和p.g.m.wuts,protective groups in organic synthesis,第2版,john wiley and sons(1991)；l.fieser和m.fieser,fieser and fieser's reagents for organic synthesis,john wiley and sons(1994)；和l.paquette,编辑,encyclopedia of reagents for organic synthesis,john wiley and sons(1995),以及其后续版本。
[0410]
可另外地或替代地使用本领域中已知的固相合成。合适的固相技术(包括自动化合成技术)描述于f.eckstein(编辑),oligonucleotides and analogues,a practical approach,oxford university press,new york(1991)和toy,p.h.；lam,y(编辑),solid-phase organic synthesis,concepts,strategies,and applications,john wiley&sons,inc.new jersey(2012)。
[0411]
在一些方面中，反应性基团可替代地与下文所述的反应性部分中的多于一者反应。
[0412]
ii.b.3.a.胺反应性部分
[0413]
在一些方面中，反应性部分是胺反应性部分。如本文所用，术语“胺反应性部分”是指可与具有氨基部分(例如伯胺)的反应性基团反应的化学基团。示例性胺反应性部分是n-羟基琥珀酰亚胺酯(nhs-酯)、对硝基苯酚、异硫氰酸酯、异氰酸酯和醛。与伯胺反应的替代反应性部分在本领域中也是众所周知的。在一些方面中，胺反应性部分可连接至本公开的
锚定部分、接头组合或bam的末端位置。
[0414]
在一些方面中，胺反应性部分是nhs-酯。通常，nhs-酯反应性部分与反应性基团的伯胺反应而产生稳定的酰胺键和n-羟基琥珀酰亚胺(nhs)。
[0415]
在一些方面中，胺反应性部分是对硝基苯酚基团。通常，对硝基苯酚反应性部分是与反应性基团的伯胺反应而产生稳定的氨基甲酸酯部分和对硝基苯酚的活化的氨基甲酸酯。
[0416]
在一些方面中，胺反应性部分是异硫氰酸酯。通常，异硫氰酸酯与反应性基团的伯胺反应而产生稳定的硫脲部分。
[0417]
在一些方面中，胺反应性部分是异氰酸酯。通常，异氰酸酯与反应性基团的伯胺反应而产生稳定的脲部分。
[0418]
在一些方面中，胺反应性部分是醛。通常，醛与伯胺反应而形成席夫碱，席夫碱可通过还原性胺化进一步还原而形成共价键。
[0419]
ii.b.3.b.硫醇反应性部分
[0420]
在一些方面中，反应性部分是硫醇反应性部分。如本文所用，术语“硫醇反应性部分”是指可与具有硫醇部分(或巯基)的反应性基团反应的化学基团。示例性的硫醇反应性部分是丙烯酸酯、马来酰亚胺和吡啶基二硫化物。与硫醇反应的替代反应性部分也是本领域中众所周知的。在一些方面中，硫醇反应性部分可连接至本公开的锚定部分、接头组合或bam的末端位置。
[0421]
在一些方面中，硫醇反应性部分是丙烯酸酯。通常，丙烯酸酯与硫醇在硫醇的β碳处与丙烯酸酯的羰基反应而形成稳定的硫化物键。在一些方面中，硫醇反应性部分是马来酰亚胺。通常，马来酰亚胺与硫醇在硫醇的β碳处与羰基反应而形成稳定的硫化物键。在一些方面中，硫醇反应性部分是吡啶基二硫化物。通常，吡啶基二硫化物与硫醇在硫醇的β硫原子处与吡啶基反应而形成稳定的二硫键和吡啶-2-硫酮。
[0422]
ii.b.3.c.羟基反应性部分
[0423]
在一些方面中，反应性部分是羟基反应性部分。如本文所用，术语“羟基反应性部分”是指可与具有羟基部分的反应性基团反应的化学基团。示例性的羟基反应性部分是异硫氰酸酯和异氰酸酯。与羟基部分反应的替代反应性部分也是本领域中众所周知的。在一些方面中，羟基反应性部分可连接至本公开的锚定部分、接头组合或bam的末端位置。
[0424]
在一些方面中，羟基反应性部分是异硫氰酸酯。通常，异硫氰酸酯与反应性基团的羟基反应而产生稳定的硫代氨基甲酸酯部分。在一些方面中，胺反应性部分是异氰酸酯。通常，异氰酸酯与反应性基团的羟基反应而产生稳定的氨基甲酸酯部分。
[0425]
ii.b.3.d.羧酸反应性部分
[0426]
在一些方面中，反应性部分是羧酸反应性部分。如本文所用，术语“羧酸反应性部分”是指可与具有羧酸部分的反应性基团反应的化学基团。示例性的羧酸反应性部分是环氧化物。与羧酸部分反应的替代反应性部分也是本领域中众所周知的。在一些方面中，羧酸反应性部分可连接至本公开的锚定部分、接头组合或bam的末端位置。
[0427]
在一些方面中，羧酸反应性部分是环氧化物。通常，环氧化物与反应性基团的羧酸在环氧化物的任一碳原子处反应而形成乙酸2-羟基乙酯部分。
[0428]
ii.b.3.e.叠氮化物反应性部分
[0429]
在一些方面中，反应性部分是叠氮化物反应性部分。如本文所用，术语“叠氮化物反应性部分”是指可与具有叠氮化物部分的反应性基团反应的化学基团。示例性叠氮化物反应性部分是炔烃。与叠氮化物部分反应的替代反应性部分也是本领域中众所周知的。在一些方面中，羧酸反应性部分可连接至本公开的锚定部分、接头组合或bam的末端位置。
[0430]
在一些方面中，叠氮化物反应性部分是炔烃。通常，炔烃通过1,3-偶极环加成反应(也称为“点击化学”)与反应性基团的叠氮化物反应而形成1,2,3-三唑部分。
[0431]
ii.b.4.具体实例和拓扑结构
[0432]
在本公开的具体方面中，接头组合由下式的接头组成：
[0433]
[烷基接头]m-[peg1]n-[peg2]o
[0434]
其中m、n和o是0或1，并且m、n或o中的至少一者不为零。根据这样的式的示例性接头组合是c6-teg-heg、c6-heg、c6-teg、c6、teg-heg、teg、c8-teg-heg、c8-heg、c8-teg和c8。
[0435]
在一些方面中，接头组合包含与一种或多种可裂解接头(例如酶可裂解接头和自分解性接头)组合的不可裂解接头(例如，teg或heg)。
[0436]
在一个具体方面中，接头组合包括接头组合teg(不可裂解接头)-val-cit(可裂解接头)-pab(自分解性接头)，如下所示：
[0437]
[胆固醇]-[teg]-[val-cit]-[pab]
[0438][0439]
锚定部分和接头组合的具体组合在下表中说明。
[0440]
表1.
[0441]
[0442][0443]
表2.
[0444][0445]
在一些方面中，接头组合具有通式结构[am]-[接头1]-[接头2]-[bam]，其中锚定部分[am]选自胆固醇、棕榈酸酯和生育酚，第一接头[接头1]是疏水性接头，并且第二接头[接头2]是亲水性接头。在其它方面中，接头组合具有通式结构[am]-[接头1]-[接头2]-[bam]，其中锚定部分[am]选自胆固醇、棕榈酸酯和生育酚，第一接头[接头1]是亲水性接头，并且第二接头[接头2]是亲水性接头。在其它方面中，在一些方面中，接头组合具有通式结构[am]-[接头1]-[接头2]-[aso]，其中锚定部分[am]选自胆固醇、棕榈酸酯和生育酚，第一接头[接头1]选自c6接头、c8接头、teg接头和heg接头，并且第二接头[接头2]是选自teg和heg的亲水性接头。
[0446]
在一些方面中，接头组合具有通式结构[am]-[接头1]-[接头2]-[接头3]-[aso]，其中锚定部分[am]是脂质(例如，磷脂)，第一接头[接头1]选自由以下组成的组：heg、teg、teg-heg和c6，或第一接头不存在，第二接头[接头2]选自由以下组成的组：二硫化物、亚胺、硫缩酮、三/二核苷酸和val-cit，并且第三接头[接头3]选自由以下组成的组：heg、teg、teg-heg和c6，或者第三接头不存在。
[0447]
下文举例说明本公开的具体接头组合
[0448]
[胆固醇]-[teg]-[heg]-[bam]
[0449][0450]
[胆固醇]-[smal]-[val-cit]-[pab]-[bam]
[0451][0452]
[胆固醇l]-[teg]-[val-cit]-[c6]-[bam]
[0453][0454]
[胆固醇]-[teg]-[ss]-[c6]-[bam]
[0455][0456]
其中[胆固醇]是胆固醇锚定部分，[teg]是teg不可裂解接头，[heg]是heg不可裂解接头，[ss]是二硫化物氧化还原可裂解接头，[c6]是烷基不可裂解接头，[smal]是s-马来酰亚胺，[val-cit]是缬氨酸-瓜氨酸可裂解接头，[pab]是pab自分解性接头。在一些方面中，本公开的aso具有根据上文提供的示例性结构的结构，其中一种或多种组分已被与实例中描绘的那些相同类别的组分替代。例如，[胆固醇]锚定部分可被本文公开的另一种锚定部分取代，[teg]可被本文公开的另一种聚合不可裂解接头(例如，heg、peg、pg)取代，[val-cit]可被另一种肽酶可裂解的接头替代，或者[pab]可被另一种自分解性接头取代。
[0457]
下文举例说明本公开的另外的具体接头组合
[0458]
[饱和磷脂；乙醇胺；dlpe]-[teg]-[bam]
[0459][0460]
[不饱和磷脂；乙醇胺；dope]-[bam]
[0461][0462]
[饱和脂肪酸；月桂酸]-[teg]-[c6]-[bam]
[0463][0464]
[不饱和脂肪酸；亚油酸酯]-[teg]-[c6]-[bam]
[0465][0466]
[硬脂酸酯]-[teg]-[heg]-[bam]
[0467][0468]
ii.c.生物活性分子
[0469]
在一些方面中，本文公开的ev(例如，外泌体)能够将有效载荷(通过锚定部分连接至ev，例如外泌体的生物活性分子)递送至靶标。有效载荷是作用于与ev(例如，外泌体)接触的靶标(例如，靶细胞)的剂。接触可发生在体外或受试者体内。可通过马来酰亚胺部分连接至ev(例如，外泌体)的有效载荷的非限制性实例包括剂，诸如核苷酸(例如，包含可检测部分或毒素或破坏转录的核苷酸)、核酸(例如，编码多肽诸如酶的dna或mrna分子，或具有调控功能的rna分子诸如mirna、dsdna、lncrna或sirna)、氨基酸(例如，包含可检测部分或破坏翻译的毒素的氨基酸)、多肽(例如，酶)、脂质、碳水化合物和小分子(例如，小分子药物和毒素)。在一些方面中，有效载荷在ev(例如，外泌体)的腔中。在一些方面中，ev(例如，外泌体)可包含多于一个有效载荷，例如，在ev(例如，外泌体)的腔的溶液中的第一有效载荷，和例如通过锚定部分连接至ev(例如，外泌体)的外表面的第二有效载荷。
[0470]
在一些方面中，生物活性分子(有效载荷，bam)不天然存在于ev(例如，外泌体)中。在一些方面中，有效载荷(bam)是非天然存在的。在一些方面中，包含bam的ev是非天然存在的。
[0471]
在一些方面中，有效载荷靶向肿瘤抗原。肿瘤抗原的非限制性实例包括：甲胎蛋白(afp)、癌胚抗原(cea)、上皮肿瘤抗原(eta)、粘蛋白1(muc1)、tn-muc1、粘蛋白16(muc16)、酪氨酸酶、黑素瘤相关抗原(mage)、肿瘤蛋白p53(p53)、cd4、cd8、cd45、cd80、cd86、程序性死亡配体1(pd-l1)、程序性死亡配体2(pd-l2)、ny-eso-1、psma、tag-72、her2、gd2、cmet、egfr、间皮素、vegfr、α-叶酸受体、ce7r、il-3、癌症-睾丸抗原(cta)、mart-1gp100、tnf相关细胞凋亡诱导配体或它们的组合。
[0472]
在一些方面中，有效载荷是小分子。在一些方面中，小分子是蛋白水解靶向嵌合体(protac)。
[0473]
在一些方面中，有效载荷包含核苷酸，其中所述核苷酸是干扰素基因蛋白刺激因子(sting)激动剂。sting是通常由细菌产生的环状二核苷酸的胞质传感器。活化后，其导致i型干扰素的产生并引发免疫反应。
[0474]
在一些方面中，本公开的ev(例如，外泌体)包含通过锚定部分与ev(例如，外泌体)
共价连接的一种或多种sting激动剂。在一些方面中，sting激动剂包括环状二核苷酸sting激动剂或非环状二核苷酸sting激动剂。
[0475]
已知环状嘌呤二核苷酸，诸如但不限于cgmp、环状二-gmp(c-二-gmp)、camp、环状二-amp(c-二-amp)、环-二-gmp-amp(cgamp)、环状二-imp(c-二-imp)、环状amp-imp(caimp)及其任何类似物，可刺激或增强患者的免疫或炎症反应。cdn可具有连接环状二核苷酸的2'2'、2'3'、2'5'、3'3'或3'5'键，或它们的任何组合。
[0476]
环状嘌呤二核苷酸可通过标准有机化学技术进行修饰，以产生嘌呤二核苷酸的类似物。合适的嘌呤二核苷酸包括但不限于腺嘌呤、鸟嘌呤、肌苷、次黄嘌呤、黄嘌呤、异鸟嘌呤或本领域已知的任何其它合适的嘌呤二核苷酸。环状二核苷酸可以是经修饰的类似物。可使用本领域已知的任何合适的修饰，包括但不限于硫代磷酸酯、双硫代磷酸酯(biphosphorothioate)、氟化和二氟化修饰。
[0477]
还可使用非环状二核苷酸激动剂，诸如5,6-二甲基呫吨酮-4-乙酸(dmxaa)，或本领域已知的任何其它非环状二核苷酸激动剂。
[0478]
预期可使用任何sting激动剂。sting激动剂中有dmxaa、sting激动剂-1、ml rr-s2 cda、ml rr-s2c-di-gmp、ml-rr-s2 cgamp、2
’3’‑
c-di-am(ps)2、2
’3’‑
cgamp、2
’3’‑
cgampdfhs、3'3'-cgamp、3'3'-cgampdfsh、caimp、caim(ps)2、3
’3’‑
caimp、3
’3’‑
caimpdfsh、2
’2’‑
cgamp、2
’3’‑
cgam(ps)2、3'3'-cgamp、c-di-amp、2'3'-c-di-amp、2
’3’‑
c-di-am(ps)2、c-di-gmp、2
’3’‑
c-di-gmp、c-di-imp、c-di-ump或其任意组合。在具体方面中，sting激动剂是3'3'-caimpdfsh，可替代地命名为3-3caimpdfsh。还可使用本领域已知的另外sting激动剂。
[0479]
在一些方面中，生物活性分子是抗体或其抗原结合片段。在一些方面中，生物活性分子是adc。在一些方面中，生物活性分子是包含合成抗肿瘤剂(例如，单甲基奥瑞斯他汀e(mmae)(维多汀(vedotin)))、细胞因子释放抑制剂(例如，mcc950)、mtor抑制剂(例如，雷帕霉素及其类似物(雷帕霉素类似物(rapalog)))、自分泌运动因子(autotaxin)抑制剂(例如，pat409或pat505)、溶血磷脂酸受体拮抗剂(例如，bms-986020)、sting拮抗剂(例如，cl656)或它们的任何组合。在一些方面中，生物活性分子是融合肽。
[0480]
在一些方面中，生物活性分子包含反义寡核苷酸(aso)。在一些方面中，aso靶向体内表达的各种基因(转录物)。在一些方面中，本公开的生物活性分子包含在美国专利号5,034,506中公开的吗啉代主链结构，所述专利以引用的方式整体并入本文。在一些方面中，本公开的生物活性分子包括二氨基磷酸酯吗啉代寡聚物(pmo)，其中脱氧核糖部分被吗啉环替代，并且带电荷的磷酸二酯亚基间键联被不带电荷的二氨基磷酸酯键联替代，如summerton,等人,antisense nucleic acid drug dev.1997,7:63-70中所述。因此，在一些方面中，生物活性分子是反义寡核苷酸、二氨基磷酸酯吗啉代寡聚物(pmo)或肽缀合的二氨基磷酸酯吗啉代寡聚物(ppmo)。
[0481]
在一些方面中，生物活性分子靶向巨噬细胞。在其它方面中，生物活性分子诱导巨噬细胞极化。巨噬细胞极化是巨噬细胞经由其而采用响应于来自巨噬细胞微环境的信号的不同功能性程序的方法。此能力与巨噬细胞在生物体中的多种作用有关：巨噬细胞是先天性免疫系统的有力效应细胞，还在细胞碎片去除、胚胎发育和组织修复中至关重要。
[0482]
通过简化分类，巨噬细胞表型分为2组：m1(经典活化的巨噬细胞)和m2(交替活化
的巨噬细胞)。这种粗略分类是基于体外研究，在所述体外研究中将培养的巨噬细胞用刺激其表型转换成特定状态的分子进行处理。除了化学刺激外，已经表明，巨噬细胞在其上生长的下层基底的刚度可指导极化状态、功能作用和迁移模式。m1巨噬细胞被描述为促炎性类型，在针对病原体的直接宿主防御(诸如促炎性细胞因子和杀微生物分子的吞噬作用和分泌)中起重要作用。m2巨噬细胞被描述为具有完全相反功能：调控炎症的消退期和修复受损组织。后来，更广泛的体外和离体研究表明，巨噬细胞表型更加多样化，在基因表达和功能方面相互重叠，从而揭示这些多种混合状态形成依赖于微环境的一系列活化状态。此外，在体内，不同组织巨噬细胞群体之间的基因表达谱存在高度多样性。因此，巨噬细胞活化谱被认为更宽，涉及复杂调控途径以对来自环境的大量不同信号作出反应。巨噬细胞表型的多样性仍有待在体内充分表征。
[0483]
巨噬细胞类型的不平衡与许多免疫相关疾病有关。例如，在小鼠中增加的m1/m2比率可能与炎症性肠病的发展以及肥胖相关。在另一方面，体外实验表明m2巨噬细胞是组织纤维化的主要介质。几项研究已将m2巨噬细胞的纤维化概况与系统性硬化症的发病机制联系起来。靶向巨噬细胞的生物活性分子的非限制性例子是：pi3kγ(磷脂酰肌醇-4,5-二磷酸3-激酶催化亚基γ)、rip1(受体相互作用蛋白(rip)激酶1，ripk1)、hif-1α(缺氧诱导因子1-α)、ahr1(粘附和菌丝调控因子1)、mir146a、mir155、irf4(干扰素调控因子4)、pparγ(过氧化物酶体增殖物活化受体γ)、il-4ra(白细胞介素-4受体亚基α)、tlr8(toll样受体8)和tgf-β1(转化生长因子β-1前蛋白)。
[0484]
在一些方面中，生物活性分子靶向pi3kγ蛋白或转录物(pi3kγ拮抗剂)。在一些方面中，pi3kγ拮抗剂是反义寡核苷酸。在其它方面中，pi3kγ拮抗剂是小分子。在一些方面中，aso靶向编码pi3kγ的转录物，例如mrna。pi3kγ基因的序列可在染色体位置7q22.3和可公开获得的genbank登录号nc_000007.14(106865282..106908980)下找到，其以引用的方式整体并入。人pi3kγ蛋白的序列可在可公开获得的uniprot登录号p48736下找到，其以引用的方式整体并入本文。
[0485]
在一些方面中，生物活性分子靶向rip1蛋白或转录物(rip1拮抗剂)。在一些方面中，rip1拮抗剂是反义寡核苷酸。在其它方面中，rip1拮抗剂是小分子。在一些方面中，aso靶向编码rip1的转录物，例如mrna。rip1基因的序列可在染色体位置6p25.2和可公开获得的genbank登录号nc_000006.12(3063967..3115187)下找到，其以引用的方式整体并入。人rip1蛋白的序列可在可公开获得的uniprot登录号q13546下找到，其以引用的方式整体并入本文。
[0486]
在一些方面中，生物活性分子靶向hif-1α蛋白或转录物(hif-1α拮抗剂)。在一些方面中，hif-1α拮抗剂是反义寡核苷酸。在其它方面中，hif-1α拮抗剂是小分子。在一些方面中，aso靶向编码hif-1α的转录物，例如mrna。hif-1α基因的序列可在染色体位置14q23.2和可公开获得的genbank登录号nc_000014.9(61695513..61748259)下找到，其以引用的方式整体并入。人hif-1α蛋白的序列可在可公开获得的uniprot登录号q16665下找到，其以引用的方式整体并入本文。在一些方面中，aso靶向编码hif-2α的mrna。hif-2α基因的序列可在染色体位置2p21和可公开获得的genbank登录号nc_000002.12(46297407..46386697)下找到，其以引用的方式整体并入。人hif-2α蛋白的序列可在可公开获得的uniprot登录号q99814下找到，其以引用的方式整体并入本文。
[0487]
在一些方面中，生物活性分子靶向ahr1蛋白或转录物(ahr1拮抗剂)。在其它方面中，ahr1拮抗剂是小分子。
[0488]
在一些方面中，生物活性分子靶向mir146a(mir146a antagomir)。在一些方面中，mir146a antagomir是反义寡核苷酸。在一些方面中，aso结合至mir146a-5p(ugagaacugaauuccauggguu)(seq id no:54)。在一些方面中，aso结合至mir146a-3p(ccucugaaauucaguucuucag)(seq id no:55)。
[0489]
在一些方面中，生物活性分子模拟mir155(mir155模拟物)。在一些方面中，mir155模拟物是rna或dna。在一些方面中，mir155模拟物包含mir155-5p的核苷酸序列(uuaaugcuaaucgugauaggggu)(seq id no:56)。在一些方面中，mir155模拟物包含mir155-3p的核苷酸序列(cuccuacauauuagcauuaaca)(seq id no:57)。
[0490]
在一些方面中，生物活性分子靶向irf-4蛋白或转录物(irf4拮抗剂)。在一些方面中，irf4拮抗剂是反义寡核苷酸。在一些方面中，aso靶向编码irf-4的转录物，例如mrna。irf-4基因的序列可在染色体位置6p25.3和可公开获得的genbank登录号nc_000006.12(391739..411443)下找到，其以引用的方式整体并入。人irf-4蛋白的序列可在可公开获得的uniprot登录号q15306下找到，其以引用的方式整体并入本文。
[0491]
在一些方面中，生物活性分子靶向pparγ蛋白或转录物(pparγ拮抗剂)。在一些方面中，pparγ拮抗剂是反义寡核苷酸。在其它方面中，pparγ拮抗剂是小分子。在一些方面中，aso靶向编码pparγ的转录物，例如mrna。pparγ基因的序列可在染色体位置3p25.2和可公开获得的genbank登录号nc_000003.12(12287485..12434356)下找到，其以引用的方式整体并入。人pparγ蛋白的序列可在可公开获得的uniprot登录号p37231下找到，其以引用的方式整体并入本文。
[0492]
在一些方面中，生物活性分子靶向il-4ra蛋白或转录物(il-4ra拮抗剂)。在一些方面中，il-4ra拮抗剂是反义寡核苷酸。在一些方面中，aso靶向编码il-4ra的转录物，例如mrna。il-4ra基因的序列可在染色体位置16p12.1和可公开获得的genbank登录号nc_000016.10(27313668..27364778)下找到，其以引用的方式整体并入。人il-4ra蛋白的序列可在可公开获得的uniprot登录号p24394下找到，其以引用的方式整体并入本文。
[0493]
在一些方面中，生物活性分子是toll样受体8(tlr8)的激动剂。tlr8也称为cd288。tlr8是先天性和适应性免疫的关键组分。tlr(toll样受体)通过识别微生物特有的分子模式来控制针对病原体的宿主免疫反应。它通过myd88和traf6起作用，从而导致nf-κ-b活化、细胞因子分泌和炎症反应。人tlr8蛋白的序列可在可公开获得的uniprot登录号q9nr97下找到，其以引用的方式整体并入本文。
[0494]
在一些方面中，生物活性分子靶向tgf-β1蛋白或转录物(tgf-β1拮抗剂)。在一些方面中，tgf-β1拮抗剂是反义寡核苷酸。在一些方面中，aso靶向编码tgf-β1的转录物，例如mrna。tgf-β1基因的序列可在染色体位置19q13.2和可公开获得的genbank登录号nc_000019.10(41330323..41353922，互补序列)下找到，其以引用的方式整体并入。人tgf-β1蛋白的序列可在可公开获得的uniprot登录号p01137下找到，其以引用的方式整体并入本文。
[0495]
在一些方面中，aso是间隙聚体(gapmer)、混合聚体(mixmer)或全聚体(totalmer)。本公开的aso可包含具有经修饰的糖部分(即当与dna和rna中发现的核糖部分
2004/046160、wo 00/047599、wo 2007/134181、wo 2010/077578、wo 2010/036698、wo 2007/090071、wo 2009/006478、wo 2011/156202、wo 2008/154401、wo 2009/067647、wo 2008/150729；morita等人,bioorganic&med.chem.lett.12,73-76；seth等人,j.org.chem.2010,第75(5)卷第1569-81页；以及mitsuoka等人,nucleic acids research 2009,37(4),1225-1238中。在一些方面中，本公开的aso的经修饰的核苷或lna核苷具有式i或ii的通式结构：
[0502][0503]
其中
[0504]
w选自-o-、-s-、-n(ra)-、-c(rarb)-，特别是
–
o-；
[0505]
b是核碱基或经修饰的核碱基部分；
[0506]
z是与相邻核苷或5'-末端基团的核苷间键联；
[0507]
z*是与相邻核苷或3'-末端基团的核苷间键联；
[0508]
r1、r2、r3、r5和r
5*
独立地选自氢、卤素、烷基、烯基、炔基、羟基、烷氧基、烷氧基烷基、烯氧基、羧基、烷氧基羰基、烷基羰基、甲酰基、叠氮化物、杂环和芳基；并且
[0509]
x、y、ra和rb在本文中定义。
[0510]
ii.c.1.靶向nlrp3的aso
[0511]
nlrp3(nlrp3)也称为含nlr家族热蛋白结构域3。除非另有说明，否则如本文所用的术语“nlrp3”可指来自一种或多种物种(例如，人、非人灵长类动物、狗、猫、豚鼠、兔、大鼠、小鼠、马、牛和熊)的nlrp3。nlrp3/nlrp3的同义词是已知的，并且包括nlrp3；c1orf7；cias1；nalp3；pypaf1；含核苷酸结合寡聚化结构域、富含亮氨酸的重复序列和热蛋白结构域3；冷诱导的自身炎症性综合征1蛋白；cryopyin；含nacht、lrr和pyd结构域的蛋白3；血管紧张素/加压素受体aii/avp样；毛虫蛋白1.1；clr1.1；冷诱导的自身炎症性综合征1蛋白；和含pyrin的apaf1样蛋白1。人nl rp3基因的序列可在可公开获得的genbank登录号nc_000001.11:247416156-247449108下找到。人nlrp3基因位于染色体位置1q44的247,416,156-247,449,108。
[0512]
人nlrp3前体mrna转录物的序列(seq id no:1)对应于染色体1q44的残基247,416,156-247,449,108的反向互补序列。nlrp3mrna序列(genbank登录号nm_001079821.2)提供于seq id no:3中，除了seq id no:3中的核苷酸“t”在mrna中显示为“u”。人nlrp3蛋白的序列可在可公开获得的登录号：q96p20(规范序列，seq id no:2)、q96p20-2(seq id no:4)、q96p20-3(seq id no:5)、q96p20-4(seq id no:6)、q96p20-5(seq id no:7)和q96p20-6(seq id no:8)下找到，其各自以引用的方式整体并入本文。
[0513]
人nlrp3基因产物的天然变体是已知的。例如，人nlrp3蛋白的天然变体可含有选自以下的一个或多个氨基酸取代：d21h、i174t、v200m、r262l、4262p、r262w、l266h、d305g、d305n、l307p、q308k、f311s、t350m、a354v、l355p、e356d、h360r、t407p、t438i、t438n、a441t、a441v、r490k、f525c、f525l、g571r、y572c、f575s、e629g、l634f、m664t、q705k、y861c和r920q以及它们的任何组合。由选择性剪接产生的人nlrp3蛋白的另外变体也是本领域中已知的。nlrp3同种型1(uniprot的标识符：q96p20-2)与规范序列(seq id no:3)的不同之处如下：相对于seq id no:3的残基721-777和836-892的缺失。nlrp3同种型3(标识符：q96p20-3)的序列与规范序列(seq id no:3)的不同之处如下：相对于seq id no:3的残基720-1036的缺失。nlrp3同种型4(标识符：q96p20-4)的序列与规范序列(seq id no:3)的不同之处如下：相对于seq id no:3的残基721-777的缺失。nlrp3同种型5(标识符：q96p20-5)的序列与规范序列(seq id no:3)的不同之处如下：相对于seq id no:3的残基836-892的缺失。nlrp3同种型6(标识符：q96p20-6)的序列与规范序列(seq id no:3)的不同之处如下：相对于seq id no:3的残基776-796的缺失。因此，本公开的aso可被设计为降低或抑制nlrp3蛋白的天然变体的表达。
[0514]
aso的靶核酸序列的一个实例是nlrp3前体mrna。seq id no:1表示人nlrp3基因组序列(即，染色体1q44的核苷酸247,416,156-247,449,108的反向互补序列)。seq id no:1与nlrp3前体mrna序列同一，除了seq id no:1中的核苷酸“t”在前体mrna中显示为“u”。在某些方面中，“靶核酸”包含编码nlrp3蛋白的核酸或其天然存在的变体以及源自其的rna核酸(例如，前体mrna)的内含子。在其它方面中，靶核酸包含编码nlrp3蛋白的核酸或其天然存在的变体以及源自其的rna核酸(例如，前体mrna)的外显子区域。在其它方面中，靶核酸包含编码nlrp3蛋白的核酸或其天然存在的变体以及源自其的rna核酸(例如，前体mrna)的外显子-内含子接合点。在一些方面中，例如当用于研究或诊断时，“靶核酸”可以是源自上述dna或rna核酸靶标的cdna或合成寡核苷酸。由nlrp3前体mrna编码的人nlrp3蛋白序列显示为seq id no:3。在其它方面中，靶核酸包含编码nlrp3蛋白的核酸或其天然存在的变体的非翻译区，例如5'utr、3'utr或两者。
[0515]
在一些方面中，本公开的aso与nlrp3转录物(例如，seq id no:1)的内含子内的区域杂交。在某些方面中，本公开的aso与nlrp3转录物(例如，seq id no:1)的外显子内的区域杂交。在其它方面中，本公开的aso与nlrp3转录物(例如，seq id no:1)的外显子-内含子接合点内的区域杂交。在一些方面中，本公开的aso与nlrp3转录物(例如，内含子、外显子或外显子-内含子接合点)，例如seq id no:1内的区域杂交，其中aso具有根据下式的设计：如本文别处所述的5'a-b-c 3'。
[0516]
在一些方面中，aso靶向编码nlrp3蛋白的特定同种型(例如，同种型1)的mrna。在一些方面中，aso靶向nlrp3蛋白的所有同种型。在其它方面中，aso靶向nlrp3蛋白的两种同种型(例如，同种型1和同种型2、同种型3和同种型4、以及同种型5和同种型6)。
[0517]
在一些方面中，本公开的aso的核苷酸序列或连续核苷酸序列与选自seq id no:101至200的序列(即，图1a中的序列)具有至少约80％序列同一性，如至少约80％、至少约85％、至少约90％、至少约91％、至少约92％、至少约93％、至少约94％、至少约95％、至少约96％序列同一性、至少约97％序列同一性、至少约98％序列同一性、至少约99％序列同一性，如约100％序列同一性(同源)。在一些方面中，aso具有本文别处描述的设计或本文别处
所示的化学结构(例如，图1a)。
[0518]
在一些方面中，aso(或其连续核苷酸部分)选自或包含选自由以下组成的组的序列中的一个：seq id no:101至200或其至少10个连续核苷酸的区域，其中当与相应的nlrp3转录物相比时，aso(或其连续核苷酸部分)可任选地包含1个、2个、3个或4个错配。
[0519]
在一些方面中，aso包含选自由以下组成的组的序列：seq id no:101、seq id no:102、seq id no:103、seq id no:104、seq id no:105、seq id no:106、seq id no:107、seq id no:108、seq id no:109、seq id no:110、seq id no:111、seq id no:112、seq id no:113、seq id no:114、seq id no:115、seq id no:116、seq id no:117、seq id no:118、seq id no:119、seq id no:120、seq id no:121、seq id no:122、seq id no:123、seq id no:124、seq id no:125、seq id no:126、seq id no:127、seq id no:128、seq id no:129、seq id no:130、seq id no:131、seq id no:132、seq id no:133、seq id no:134、seq id no:135、seq id no:136、seq id no:137、seq id no:138、seq id no:139、seq id no:140、seq id no:141、seq id no:142、seq id no:143、seq id no:144、seq id no:145、seq id no:146、seq id no:147、seq id no:148、seq id no:149、seq id no:150、seq id no:151、seq id no:152、seq id no:153、seq id no:154、seq id no:155、seq id no:156、seq id no:157、seq id no:158、seq id no:159、seq id no:160、seq id no:161、seq id no:162、seq id no:163、seq id no:164、seq id no:165、seq id no:166、seq id no:167、seq id no:168、seq id no:169、seq id no:170、seq id no:171、seq id no:172、seq id no:173、seq id no:174、seq id no:175、seq id no:176、seq id no:177、seq id no:178、seq id no:179、seq id no:180、seq id no:181、seq id no:182、seq id no:183、seq id no:184、seq id no:185、seq id no:186、seq id no:187、seq id no:188、seq id no:189、seq id no:190、seq id no:191、seq id no:192、seq id no:193、seq id no:194、seq id no:195、seq id no:196、seq id no:197、seq id no:198、seq id no:199或seq id no:200。
[0520]
在一些方面中，aso包含如seq id no:101中列出的序列。在一些方面中，aso包含如seq id no:102中列出的序列。在一些方面中，aso包含如seq id no:103中列出的序列。在一些方面中，aso包含如seq id no:104中列出的序列。在一些方面中，aso包含如seq id no:105中列出的序列。在一些方面中，aso包含如seq id no:106中列出的序列。在一些方面中，aso包含如seq id no:107中列出的序列。在一些方面中，aso包含如seq id no:108中列出的序列。在一些方面中，aso包含如seq id no:109中列出的序列。在一些方面中，aso包含如seq id no:110中列出的序列。在一些方面中，aso包含如seq id no:111中列出的序列。在一些方面中，aso包含如seq id no:112中列出的序列。在一些方面中，aso包含如seq id no:113中列出的序列。在一些方面中，aso包含如seq id no:114中列出的序列。在一些方面中，aso包含如seq id no:115中列出的序列。在一些方面中，aso包含如seq id no:116中列出的序列。在一些方面中，aso包含如seq id no:117中列出的序列。在一些方面中，aso包含如seq id no:118中列出的序列。在一些方面中，aso包含如seq id no:119中列出的序列。在一些方面中，aso包含如seq id no:120中列出的序列。在一些方面中，aso包含如seq id no:121中列出的序列。在一些方面中，aso包含如seq id no:122中列出的序列。在一些方面中，aso包含如seq id no:123中列出的序列。在一些方面中，aso包含如seq id no:124中列出的序列。在一些方面中，aso包含如seq id no:125中列出的序列。在一些方面中，aso包含
如seq id no:126中列出的序列。在一些方面中，aso包含如seq id no:127中列出的序列。在一些方面中，aso包含如seq id no:128中列出的序列。在一些方面中，aso包含如seq id no:129中列出的序列。在一些方面中，aso包含如seq id no:130中列出的序列。在一些方面中，aso包含如seq id no:131中列出的序列。在一些方面中，aso包含如seq id no:132中列出的序列。在一些方面中，aso包含如seq id no:133中列出的序列。在一些方面中，aso包含如seq id no:134中列出的序列。在一些方面中，aso包含如seq id no:135中列出的序列。在一些方面中，aso包含如seq id no:136中列出的序列。在一些方面中，aso包含如seq id no:137中列出的序列。在一些方面中，aso包含如seq id no:138中列出的序列。在一些方面中，aso包含如seq id no:139中列出的序列。在一些方面中，aso包含如seq id no:140中列出的序列。在一些方面中，aso包含如seq id no:141中列出的序列。在一些方面中，aso包含如seq id no:142中列出的序列。在一些方面中，aso包含如seq id no:143中列出的序列。在一些方面中，aso包含如seq id no:144中列出的序列。在一些方面中，aso包含如seq id no:145中列出的序列。在一些方面中，aso包含如seq id no:146中列出的序列。在一些方面中，aso包含如seq id no:147中列出的序列。在一些方面中，aso包含如seq id no:148中列出的序列。在一些方面中，aso包含如seq id no:149中列出的序列。在一些方面中，aso包含如seq id no:150中列出的序列。在一些方面中，aso包含如seq id no:151中列出的序列。在一些方面中，aso包含如seq id no:152中列出的序列。在一些方面中，aso包含如seq id no:153中列出的序列。在一些方面中，aso包含如seq id no:154中列出的序列。在一些方面中，aso包含如seq id no:155中列出的序列。在一些方面中，aso包含如seq id no:156中列出的序列。在一些方面中，aso包含如seq id no:157中列出的序列。在一些方面中，aso包含如seq id no:158中列出的序列。在一些方面中，aso包含如seq id no:159中列出的序列。在一些方面中，aso包含如seq id no:160中列出的序列。在一些方面中，aso包含如seq id no:161中列出的序列。在一些方面中，aso包含如seq id no:162中列出的序列。在一些方面中，aso包含如seq id no:163中列出的序列。在一些方面中，aso包含如seq id no:164中列出的序列。在一些方面中，aso包含如seq id no:165中列出的序列。在一些方面中，aso包含如seq id no:166中列出的序列。在一些方面中，aso包含如seq id no:167中列出的序列。在一些方面中，aso包含如seq id no:168中列出的序列。在一些方面中，aso包含如seq id no:169中列出的序列。在一些方面中，aso包含如seq id no:170中列出的序列。在一些方面中，aso包含如seq id no:171中列出的序列。在一些方面中，aso包含如seq id no:172中列出的序列。在一些方面中，aso包含如seq id no:173中列出的序列。在一些方面中，aso包含如seq id no:174中列出的序列。在一些方面中，aso包含如seq id no:175中列出的序列。在一些方面中，aso包含如seq id no:176中列出的序列。在一些方面中，aso包含如seq id no:177中列出的序列。在一些方面中，aso包含如seq id no:178中列出的序列。在一些方面中，aso包含如seq id no:179中列出的序列。在一些方面中，aso包含如seq id no:180中列出的序列。在一些方面中，aso包含如seq id no:181中列出的序列。在一些方面中，aso包含如seq id no:182中列出的序列。在一些方面中，aso包含如seq id no:183中列出的序列。在一些方面中，aso包含如seq id no:184中列出的序列。在一些方面中，aso包含如seq id no:185中列出的序列。在一些方面中，aso包含如seq id no:186中列出的序列。在一些方面中，aso包含如seq id no:187中列出的序列。在一些方面中，aso包含如seq id no:188中列
出的序列。在一些方面中，aso包含如seq id no:189中列出的序列。在一些方面中，aso包含如seq id no:190中列出的序列。在一些方面中，aso包含如seq id no:191中列出的序列。在一些方面中，aso包含如seq id no:192中列出的序列。在一些方面中，aso包含如seq id no:193中列出的序列。在一些方面中，aso包含如seq id no:194中列出的序列。在一些方面中，aso包含如seq id no:195中列出的序列。在一些方面中，aso包含如seq id no:196中列出的序列。在一些方面中，aso包含如seq id no:197中列出的序列。在一些方面中，aso包含如seq id no:198中列出的序列。在一些方面中，aso包含如seq id no:199中列出的序列。在一些方面中，aso包含如seq id no:200中列出的序列。
[0521]
在一些方面中，aso包含与seq id no:101至200中列出的序列至少约60％、至少约65％、至少约70％、至少约75％、至少约80％、至少约85％、至少约90％、至少约95％、至少约96％、至少约97％、至少约98％、至少约99％或约100％同一的序列或由其组成。在一些方面中，aso(或其连续核苷酸部分)选自或包含选自由以下组成的组的序列中的一个：seq id no:101至200或其至少8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19或20个连续核苷酸的区域。在一些方面中，aso(或其连续核苷酸部分)选自或包含选自由以下组成的组的序列中的一个：seq id no:101至200或其至少8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19或20个连续核苷酸的区域，其中当与相应的nlrp3转录物相比时，aso(或其连续核苷酸部分)可任选地包含1个、2个、3个或4个错配。在一些方面中，aso(或其连续核苷酸部分)选自或包含选自由以下组成的组的序列中的一个：seq id no:101至200，除了1、2、3、4、5、6、7、8、9或10个取代外，其中取代的aso可结合至nlrp3转录物。在一些方面中，aso(或其连续核苷酸部分)选自或包含选自由以下组成的组的序列中的一个：seq id no:101至200或其至少8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19或20个连续核苷酸的区域，其中aso(或其连续核苷酸部分)可任选地包含与相应的nlrp3转录物互补的1个、2个、3个或4个另外的5'和/或3'核苷酸。
[0522]
在一些方面中，靶向本文公开的nlrp3转录物的aso与编码nlrp3的mrna转录物的结合可降低nlrp3的表达水平和/或活性水平。
[0523]
ii.c.2.靶向stat6的aso
[0524]
stat6(stat6)也称为信号转导因子和转录活化因子6。stat6/stat6的同义词是已知的，并且包括il-4stat；stat，白细胞介素4诱导的；转录因子il-4stat；stat6b；stat6c；和d12s1644。人stat6基因的序列可在可公开获得的genbank登录号nc_000012.12:c57111413-57095404下找到。人stat6基因位于染色体位置12q13.3的57111413-57095404，互补序列。除非另有说明，否则如本文所用的术语“stat6”可指来自一种或多种物种(例如，人、非人灵长类动物、狗、猫、豚鼠、兔、大鼠、小鼠、马、牛和熊)的stat6。
[0525]
人stat6前体mrna转录物的序列(seq id no:11)对应于染色体12q13.3的残基57111413-57095404，互补序列的反向互补序列。stat6 mrna序列(genbank登录号nm_001178078.1)提供于seq id no:13中，除了seq id no:13中的核苷酸“t”在mrna中显示为“u”。人stat6蛋白的序列可在可公开获得的登录号：p42226-1(规范序列，seq id no:12)、p42226-2(seq id no:14)和p42226-3(seq id no:15)下找到，其各自以引用的方式整体并入本文。
[0526]
人stat6基因产物的天然变体是已知的。例如，人stat6蛋白的天然变体可含有选自以下的一个或多个氨基酸取代：m118r、d419n和它们的任何组合。由选择性剪接产生的人
id no:649中列出的序列(例如，aso-stat6-1848)。在一些方面中，aso包含如seq id no:650中列出的序列(例如，aso-stat6-1849)。在一些方面中，aso包含如seq id no:651中列出的序列(例如，aso-stat6-1891)。在一些方面中，aso包含如seq id no:652中列出的序列(例如，aso-stat6-1915)。在一些方面中，aso包含如seq id no:653中列出的序列(例如，aso-stat6-1916)。在一些方面中，aso包含如seq id no:654中列出的序列(例如，aso-stat6-1917)。在一些方面中，aso包含如seq id no:655中列出的序列(例如，aso-stat6-1938)。在一些方面中，aso包含如seq id no:656中列出的序列(例如，aso-stat6-1939)。在一些方面中，aso包含如seq id no:657中列出的序列(例如，aso-stat6-2063)。在一些方面中，aso包含如seq id no:658中列出的序列(例如，aso-stat6-2064)。在一些方面中，aso包含如seq id no:659中列出的序列(例如，aso-stat6-2065)。在一些方面中，aso包含如seq id no:660中列出的序列(例如，aso-stat6-2066)。在一些方面中，aso包含如seq id no:661中列出的序列(例如，aso-stat6-2068)。在一些方面中，aso包含如seq id no:662中列出的序列(例如，aso-stat6-2187)。在一些方面中，aso包含如seq id no:663中列出的序列(例如，aso-stat6-2350)。在一些方面中，aso包含如seq id no:664中列出的序列(例如，aso-stat6-2351)。在一些方面中，aso包含如seq id no:665中列出的序列(例如，aso-stat6-2352)。在一些方面中，aso包含如seq id no:666中列出的序列(例如，aso-stat6-2357)。在一些方面中，aso包含如seq id no:667中列出的序列(例如，aso-stat6-513)。在一些方面中，aso包含如seq id no:668中列出的序列(例如，aso-stat6-671)。在一些方面中，aso包含如seq id no:669中列出的序列(例如，aso-stat6-1131)。在一些方面中，aso包含如seq id no:670中列出的序列(例如，aso-stat6-1354)。在一些方面中，aso包含如seq id no:671中列出的序列(例如，aso-stat6-1355)。在一些方面中，aso包含如seq id no:672中列出的序列(例如，aso-stat6-1356)。在一些方面中，aso包含如seq id no:673中列出的序列(例如，aso-stat6-1432)。在一些方面中，aso包含如seq id no:674中列出的序列(例如，aso-stat6-1555)。在一些方面中，aso包含如seq id no:675中列出的序列(例如，aso-stat6-1556)。在一些方面中，aso包含如seq id no:676中列出的序列(例如，aso-stat6-1557)。在一些方面中，aso包含如seq id no:677中列出的序列(例如，aso-stat6-1558)。在一些方面中，aso包含如seq id no:678中列出的序列(例如，aso-stat6-1826)。在一些方面中，aso包含如seq id no:679中列出的序列(例如，aso-stat6-1827)。在一些方面中，aso包含如seq id no:680中列出的序列(例如，aso-stat6-1833)。在一些方面中，aso包含如seq id no:681中列出的序列(例如，aso-stat6-1843)。在一些方面中，aso包含如seq id no:682中列出的序列(例如，aso-stat6-1846)。在一些方面中，aso包含如seq id no:683中列出的序列(例如，aso-stat6-1847)。在一些方面中，aso包含如seq id no:684中列出的序列(例如，aso-stat6-1883)。在一些方面中，aso包含如seq id no:685中列出的序列(例如，aso-stat6-1889)。在一些方面中，aso包含如seq id no:686中列出的序列(例如，aso-stat6-1890)。在一些方面中，aso包含如seq id no:687中列出的序列(例如，aso-stat6-1891)。在一些方面中，aso包含如seq id no:688中列出的序列(例如，aso-stat6-1916)。在一些方面中，aso包含如seq id no:689中列出的序列(例如，aso-stat6-1917)。在一些方面中，aso包含如seq id no:690中列出的序列(例如，aso-stat6-2056)。在一些方面中，aso包含如seq id no:691中列出的序列(例如，aso-stat6-2057)。在一些方面中，aso包
no:24)和p17676-3(seq id no:25)下找到，其各自以引用的方式整体并入本文。
[0539]
人cebp/β基因产物的天然变体是已知的。例如，人cebp/β蛋白的天然变体可含有选自以下的一个或多个氨基酸取代：a241p、a253g、g195s和它们的任何组合。由选择性剪接产生的人cebp/β蛋白的另外变体也是本领域已知的。cebp/β同种型2(uniprot的标识符：p17676-2)与规范序列(seq id no:23)的不同之处如下：相对于seq id no:23的残基1-23的缺失。cebp/β同种型3(标识符：p17676-3)的序列与规范序列(seq id no:23)的不同之处如下：相对于seq id no:23的残基1-198的缺失。因此，本公开的aso可被设计为降低或抑制所述蛋白的天然变体的表达。
[0540]
aso的靶核酸序列的一个实例是cebp/β前体mrna。seq id no:21表示人cebp/β基因组序列(即，染色体20q13.13的核苷酸50190583-50192690的反向互补序列)。seq id no:21与cebp/β前体mrna序列同一，除了seq id no:21中的核苷酸“t”在前体mrna中显示为“u”。在某些方面中，“靶核酸”包含编码cebp/β蛋白的核酸或其天然存在的变体以及源自其的rna核酸(例如，前体mrna)的内含子。在其它方面中，靶核酸包含编码cebp/β蛋白的核酸或其天然存在的变体以及源自其的rna核酸(例如，前体mrna)的外显子区域。在其它方面中，靶核酸包含编码cebp/β蛋白的核酸或其天然存在的变体以及源自其的rna核酸(例如，前体mrna)的外显子-内含子接合点。在一些方面中，例如当用于研究或诊断时，“靶核酸”可以是源自上述dna或rna核酸靶标的cdna或合成寡核苷酸。由cebp/β前体mrna编码的人cebp/β蛋白序列显示为seq id no:23。在其它方面中，靶核酸包含编码cebp/β蛋白的核酸或其天然存在的变体的非翻译区，例如5'utr、3'utr或两者。
[0541]
在一些方面中，本公开的aso与cebp/β转录物(例如，seq id no:21)的内含子内的区域杂交。在某些方面中，本公开的aso与cebp/β转录物(例如，seq id no:21)的外显子内的区域杂交。在其它方面中，本公开的aso与cebp/β转录物(例如，seq id no:21)的外显子-内含子接合点内的区域杂交。在一些方面中，本公开的aso与cebp/β转录物(例如，内含子、外显子或外显子-内含子接合点)，例如seq id no:21内的区域杂交，其中aso具有根据下式的设计：如本文别处所述的5'a-b-c 3'。
[0542]
在一些方面中，aso靶向编码cebp/β蛋白的特定同种型(例如，同种型1)的mrna。在一些方面中，aso靶向cebp/β蛋白的所有同种型。在其它方面中，aso靶向cebp/β蛋白的两种同种型(例如，同种型1和同种型2、同种型1和同种型3、或同种型2和同种型3)。
[0543]
在一些方面中，本公开的aso的核苷酸序列或连续核苷酸序列与选自seq id no:704-806的序列(即，图1c中的序列)具有至少约80％序列同一性，如至少约80％、至少约85％、至少约90％、至少约91％、至少约92％、至少约93％、至少约94％、至少约95％、至少约96％序列同一性、至少约97％序列同一性、至少约98％序列同一性、至少约99％序列同一性，如约100％序列同一性(同源)。在一些方面中，aso具有本文别处描述的设计或本文别处所示的化学结构(例如，图1c)。
[0544]
在一些方面中，aso(或其连续核苷酸部分)选自或包含选自由以下组成的组的序列中的一个：seq id no:704
–
806或其至少10个连续核苷酸的区域，其中当与相应的cebp/β转录物相比时，aso(或其连续核苷酸部分)可任选地包含1个、2个、3个或4个错配。
[0545]
在一些方面中，aso包含如seq id no:704中列出的序列(例如，aso-cebpb-540)。在一些方面中，aso包含如seq id no:705中列出的序列(例如，aso-cebpb-565)。在一些方
面中，aso包含如seq id no:706中列出的序列(例如，aso-cebpb-569)。在一些方面中，aso包含如seq id no:707中列出的序列(例如，aso-cebpb-648)。在一些方面中，aso包含如seq id no:708中列出的序列(例如，aso-cebpb-816)。在一些方面中，aso包含如seq id no:709中列出的序列(例如，aso-cebpb-817)。在一些方面中，aso包含如seq id no:710中列出的序列(例如，aso-cebpb-818)。在一些方面中，aso包含如seq id no:711中列出的序列(例如，aso-cebpb-819)。在一些方面中，aso包含如seq id no:712中列出的序列(例如，aso-cebpb-820)。在一些方面中，aso包含如seq id no:713中列出的序列(例如，aso-cebpb-851)。在一些方面中，aso包含如seq id no:714中列出的序列(例如，aso-cebpb-853)。在一些方面中，aso包含如seq id no:715中列出的序列(例如，aso-cebpb-856)。在一些方面中，aso包含如seq id no:716中列出的序列(例如，aso-cebpb-858)。在一些方面中，aso包含如seq id no:717中列出的序列(例如，aso-cebpb-987)。在一些方面中，aso包含如seq id no:718中列出的序列(例如，aso-cebpb-1056)。在一些方面中，aso包含如seq id no:719中列出的序列(例如，aso-cebpb-1064)。在一些方面中，aso包含如seq id no:720中列出的序列(例如，aso-cebpb-1065)。在一些方面中，aso包含如seq id no:721中列出的序列(例如，aso-cebpb-1066)。在一些方面中，aso包含如seq id no:722中列出的序列(例如，aso-cebpb-1071)。在一些方面中，aso包含如seq id no:723中列出的序列(例如，aso-cebpb-1270)。在一些方面中，aso包含如seq id no:724中列出的序列(例如，aso-cebpb-1273)。在一些方面中，aso包含如seq id no:725中列出的序列(例如，aso-cebpb-1274)。在一些方面中，aso包含如seq id no:726中列出的序列(例如，aso-cebpb-1405)。在一些方面中，aso包含如seq id no:727中列出的序列(例如，aso-cebpb-1407)。在一些方面中，aso包含如seq id no:728中列出的序列(例如，aso-cebpb-539)。在一些方面中，aso包含如seq id no:729中列出的序列(例如，aso-cebpb-540)。在一些方面中，aso包含如seq id no:730中列出的序列(例如，aso-cebpb-563)。在一些方面中，aso包含如seq id no:731中列出的序列(例如，aso-cebpb-564)。在一些方面中，aso包含如seq id no:732中列出的序列(例如，aso-cebpb-565)。在一些方面中，aso包含如seq id no:733中列出的序列(例如，aso-cebpb-568)。在一些方面中，aso包含如seq id no:734中列出的序列(例如，aso-cebpb-644)。在一些方面中，aso包含如seq id no:735中列出的序列(例如，aso-cebpb-645)。在一些方面中，aso包含如seq id no:736中列出的序列(例如，aso-cebpb-648)。在一些方面中，aso包含如seq id no:737中列出的序列(例如，aso-cebpb-819)。在一些方面中，aso包含如seq id no:738中列出的序列(例如，aso-cebpb-855)。在一些方面中，aso包含如seq id no:739中列出的序列(例如，aso-cebpb-860)。在一些方面中，aso包含如seq id no:740中列出的序列(例如，aso-cebpb-986)。在一些方面中，aso包含如seq id no:741中列出的序列(例如，aso-cebpb-987)。在一些方面中，aso包含如seq id no:742中列出的序列(例如，aso-cebpb-996)。在一些方面中，aso包含如seq id no:743中列出的序列(例如，aso-cebpb-1049)。在一些方面中，aso包含如seq id no:744中列出的序列(例如，aso-cebpb-1050)。在一些方面中，aso包含如seq id no:745中列出的序列(例如，aso-cebpb-1064)。在一些方面中，aso包含如seq id no:746中列出的序列(例如，aso-cebpb-1065)。在一些方面中，aso包含如seq id no:747中列出的序列(例如，aso-cebpb-1066)。在一些方面中，aso包含如seq id no:748中列出的序列(例如，aso-cebpb-1083)。在一些方面中，aso包含如seq id no:
749中列出的序列(例如，aso-cebpb-1088)。在一些方面中，aso包含如seq id no:750中列出的序列(例如，aso-cebpb-1253)。在一些方面中，aso包含如seq id no:751中列出的序列(例如，aso-cebpb-1269)。在一些方面中，aso包含如seq id no:752中列出的序列(例如，aso-cebpb-1272)。在一些方面中，aso包含如seq id no:753中列出的序列(例如，aso-cebpb-1274)。在一些方面中，aso包含如seq id no:754中列出的序列(例如，aso-cebpb-539)。在一些方面中，aso包含如seq id no:755中列出的序列(例如，aso-cebpb-564)。在一些方面中，aso包含如seq id no:756中列出的序列(例如，aso-cebpb-565)。在一些方面中，aso包含如seq id no:757中列出的序列(例如，aso-cebpb-567)。在一些方面中，aso包含如seq id no:758中列出的序列(例如，aso-cebpb-647)。在一些方面中，aso包含如seq id no:759中列出的序列(例如，aso-cebpb-648)。在一些方面中，aso包含如seq id no:760中列出的序列(例如，aso-cebpb-815)。在一些方面中，aso包含如seq id no:761中列出的序列(例如，aso-cebpb-818)。在一些方面中，aso包含如seq id no:762中列出的序列(例如，aso-cebpb-820)。在一些方面中，aso包含如seq id no:763中列出的序列(例如，aso-cebpb-854)。在一些方面中，aso包含如seq id no:764中列出的序列(例如，aso-cebpb-855)。在一些方面中，aso包含如seq id no:765中列出的序列(例如，aso-cebpb-859)。在一些方面中，aso包含如seq id no:766中列出的序列(例如，aso-cebpb-1050)。在一些方面中，aso包含如seq id no:767中列出的序列(例如，aso-cebpb-1053)。在一些方面中，aso包含如seq id no:768中列出的序列(例如，aso-cebpb-1062)。在一些方面中，aso包含如seq id no:769中列出的序列(例如，aso-cebpb-1063)。在一些方面中，aso包含如seq id no:770中列出的序列(例如，aso-cebpb-1064)。在一些方面中，aso包含如seq id no:771中列出的序列(例如，aso-cebpb-1065)。在一些方面中，aso包含如seq id no:772中列出的序列(例如，aso-cebpb-1265)。在一些方面中，aso包含如seq id no:773中列出的序列(例如，aso-cebpb-1270)。在一些方面中，aso包含如seq id no:774中列出的序列(例如，aso-cebpb-1271)。在一些方面中，aso包含如seq id no:775中列出的序列(例如，aso-cebpb-1272)。在一些方面中，aso包含如seq id no:776中列出的序列(例如，aso-cebpb-1274)。在一些方面中，aso包含如seq id no:777中列出的序列(例如，aso-cebpb-1277)。在一些方面中，aso包含如seq id no:778中列出的序列(例如，aso-cebpb-564)。在一些方面中，aso包含如seq id no:779中列出的序列(例如，aso-cebpb-565)。在一些方面中，aso包含如seq id no:780中列出的序列(例如，aso-cebpb-818)。在一些方面中，aso包含如seq id no:781中列出的序列(例如，aso-cebpb-1061)。在一些方面中，aso包含如seq id no:782中列出的序列(例如，aso-cebpb-1062)。在一些方面中，aso包含如seq id no:783中列出的序列(例如，aso-cebpb-1064)。在一些方面中，aso包含如seq id no:784中列出的序列(例如，aso-cebpb-1267)。在一些方面中，aso包含如seq id no:785中列出的序列(例如，aso-cebpb-1272)。在一些方面中，aso包含如seq id no:786中列出的序列(例如，aso-cebpb-645)。在一些方面中，aso包含如seq id no:787中列出的序列(例如，aso-cebpb-848)。在一些方面中，aso包含如seq id no:788中列出的序列(例如，aso-cebpb-849)。在一些方面中，aso包含如seq id no:789中列出的序列(例如，aso-cebpb-850)。在一些方面中，aso包含如seq id no:790中列出的序列(例如，aso-cebpb-1063)。在一些方面中，aso包含如seq id no:791中列出的序列(例如，aso-cebpb-1070)。在一些方面中，aso包含如seq id no:792中列
出的序列(例如，aso-cebpb-1071)。在一些方面中，aso包含如seq id no:793中列出的序列(例如，aso-cebpb-1262)。在一些方面中，aso包含如seq id no:794中列出的序列(例如，aso-cebpb-1274)。在一些方面中，aso包含如seq id no:795中列出的序列(例如，aso-cebpb-1275)。在一些方面中，aso包含如seq id no:796中列出的序列(例如，aso-cebpb-644)。在一些方面中，aso包含如seq id no:797中列出的序列(例如，aso-cebpb-647)。在一些方面中，aso包含如seq id no:798中列出的序列(例如，aso-cebpb-851)。在一些方面中，aso包含如seq id no:799中列出的序列(例如，aso-cebpb-1266)。在一些方面中，aso包含如seq id no:800中列出的序列(例如，aso-cebpb-1268)。在一些方面中，aso包含如seq id no:801中列出的序列(例如，aso-cebpb-1270)。在一些方面中，aso包含如seq id no:802中列出的序列(例如，aso-cebpb-646)。在一些方面中，aso包含如seq id no:803中列出的序列(例如，aso-cebpb-1060)。在一些方面中，aso包含如seq id no:804中列出的序列(例如，aso-cebpb-1263)。在一些方面中，aso包含如seq id no:805中列出的序列(例如，aso-cebpb-1269)。在一些方面中，aso包含如seq id no:806中列出的序列(例如，aso-cebpb-1271)。
[0546]
在一些方面中，aso包含与seq id no:704至806中列出的序列至少约60％、至少约65％、至少约70％、至少约75％、至少约80％、至少约85％、至少约90％、至少约95％、至少约96％、至少约97％、至少约98％、至少约99％或约100％同一的序列或由其组成。在一些方面中，aso(或其连续核苷酸部分)选自或包含选自由以下组成的组的序列中的一个：seq id no:704至806或其至少8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19或20个连续核苷酸的区域。在一些方面中，aso(或其连续核苷酸部分)选自或包含选自由以下组成的组的序列中的一个：seq id no:704至806或其至少8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19或20个连续核苷酸的区域，其中当与相应的cebpb转录物相比时，aso(或其连续核苷酸部分)可任选地包含1个、2个、3个或4个错配。在一些方面中，aso(或其连续核苷酸部分)选自或包含选自由以下组成的组的序列中的一个：seq id no:704至806，除了1、2、3、4、5、6、7、8、9或10个取代外，其中取代的aso可结合至cebpb转录物。在一些方面中，aso(或其连续核苷酸部分)选自或包含选自由以下组成的组的序列中的一个：seq id no:704至806或其至少8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19或20个连续核苷酸的区域，其中aso(或其连续核苷酸部分)可任选地包含与相应的cebpb转录物互补的1个、2个、3个或4个另外的5'和/或3'核苷酸。
[0547]
在一些方面中，靶向本文公开的cebpb转录物的aso与编码cebpb的mrna转录物的结合可降低cebpb的表达水平和/或活性水平。
[0548]
ii.c.4.靶向stat3的aso
[0549]
信号转导因子和转录活化因子3(stat3)是将信号从细胞表面受体传递至细胞核的信号转导因子和转录活化因子。stat3在许多人癌症中经常过度活化。编码stat3的基因组dna可位于染色体位置17q21.2(即，genbank登录号ng_007370.1的核苷酸5,001至80,171)。高水平的活化stat3通常发现与就转移进展而言人乳腺癌患者的不良预后相关(ranger等人2009)。因此，stat3代表预防和治疗er阳性和er阴性乳腺癌以及还有其它癌症如胰腺癌、头颈癌、前列腺癌和肺癌的有希望的靶标。然而，通过阻断肽、阻断易位、破坏二聚化或调节磷酸酶活性来抑制stat3活性的当前策略并未充分抑制癌细胞中的stat3活性。在正常条件下，stat3活化是短暂的并且受到严格调控。在配体诸如生长因子或细胞因子进
行的细胞刺激时，stat3在关键酪氨酸残基(tyr705)上变得磷酸化，并且因此通过两个相互磷酸酪氨酸(ptyr)-src-同源性2(sh2)相互作用诱导stat3二聚化。stat3二聚体然后易位至细胞核并与靶基因的启动子中的特定dna反应元件结合，从而活化转录。异常stat3活化与许多类型的人恶性肿瘤和实体瘤的关联使stat3成为开发新型癌症治疗剂的有吸引力的分子靶标。
[0550]
stat3经常被发现在肿瘤细胞中组成型活化，并通过调节靶基因(如抗凋亡基因bcl-xl、bcl-2、mcl-1和survivin)以及驱动细胞周期进程的基因c-myc和细胞周期蛋白-d1而促成肿瘤进展。stat3的异常活化在几乎所有血液恶性肿瘤和实体瘤(包括淋巴瘤和白血病、乳腺癌、前列腺癌、肺头颈癌、脑癌和结肠癌)中都常见，这使得stat3成为开发抗癌剂的有吸引力的靶标。stat活化的特异性是由于特异性细胞因子，即，每个stat应答于少数特异性细胞因子。还已发现其它非细胞因子信号传导分子(如生长因子)活化stat。这些因子对与蛋白酪氨酸激酶相关的细胞表面受体的结合也引起stat的磷酸化。具体来说，已发现stat3应答于白细胞介素-6(il-6)以及表皮生长因子(egf)(darnell,jr.,j.e.,等人,science,1994,264,1415-1421)。有证据表明stat3可通过mapk途径来调控。erk2诱导丝氨酸磷酸化并且还与stat3缔合(jain,n.,等人,oncogene,1998,17,3157-3167)。stat3在大多数细胞类型中表达，并且还参与诱导在对组织损伤和炎症的反应中涉及的基因的表达。stat3的异常表达或组成型表达与许多疾病过程相关。已发现stat3在骨髓瘤肿瘤细胞中(在培养物和来自多发性骨髓瘤患者的骨髓单核细胞中)具有组成型活性。这些细胞对fas介导的细胞凋亡具有抗性并表达高水平的bcl-xl。stat3 sh2结构域是促进二聚化所必需的。靶向蛋白质二聚化的限制之一是靶向二聚体界面的可行性，由于大表面积的平面性，这具有挑战性。
[0551]
信号转导因子和转录活化因子3(stat3)在本领域中以各种名称所知。此类名称包括：dna结合蛋白aprf和急性期反应因子。编码人stat3的mrna可在genbank登录号nm_003150.3找到，并由序列(seq id no:43)表示。
[0552]
人stat3基因产物的天然变体是已知的。例如，人stat3蛋白的天然变体可含有选自以下的一个或多个氨基酸取代：r382l、r382q或r382w和它们的任何组合。由选择性剪接产生的人stat3蛋白的另外变体也是本领域中已知的，如：r382w、f384l、f384s、t389i、n395y、r423q、n425y、h437y、del-463、s611n、f621v、t622i、v637l、v637m、del-644、y657c、p330s、k392r、n646k、k658n、del-701或t716m。因此，本公开的aso可被设计为降低或抑制stat3蛋白的天然变体的表达。
[0553]
seq id no:41与stat3前体mrna序列同一，除了seq id no:41中的核苷酸“t”在前体mrna中显示为“u”。在某些方面中，“靶核酸”包含编码stat3蛋白的核酸或其天然存在的变体以及源自其的rna核酸(例如，前体mrna)的内含子。在其它方面中，靶核酸包含编码stat3蛋白的核酸或其天然存在的变体以及源自其的rna核酸(例如，前体mrna)的外显子区域。在其它方面中，靶核酸包含编码stat3蛋白的核酸或其天然存在的变体以及源自其的rna核酸(例如，前体mrna)的外显子-内含子接合点。在一些方面中，例如当用于研究或诊断时，“靶核酸”可以是源自上述dna或rna核酸靶标的cdna或合成寡核苷酸。由stat3前体mrna编码的人stat3蛋白序列显示为seq id no:42。在其它方面中，靶核酸包含编码stat3蛋白的核酸或其天然存在的变体的非翻译区，例如5'utr、3'utr或两者。
[0554]
在其它方面中，靶核酸包含编码stat3蛋白的核酸或其天然存在的变体以及源自其的rna核酸(例如，前体mrna)的外显子-内含子接合点。在一些方面中，例如当用于研究或诊断时，“靶核酸”可以是源自上述dna或rna核酸靶标的cdna或合成寡核苷酸。由stat3前体mrna编码的人stat3蛋白序列显示为seq id no:43。在其它方面中，靶核酸包含编码stat3蛋白的核酸或其天然存在的变体的非翻译区，例如5'utr、3'utr或两者。
[0555]
在一些方面中，本公开的aso与stat3转录物(例如，seq id no:41或seq id no:43)的内含子内的区域杂交。在某些方面中，本公开的aso与stat3转录物(例如，seq id no:41或seq id no:43)的外显子内的区域杂交。在其它方面中，本公开的aso与stat3转录物(例如，seq id no:41或seq id no:43)的外显子-内含子接合点内的区域杂交。在一些方面中，本公开的aso与stat3转录物(例如，内含子、外显子或外显子-内含子接合点)，例如seq id no:41或seq id no:43内的区域杂交，其中aso具有根据下式的设计：如本文别处所述的5'a-b-c 3'。
[0556]
在一些方面中，aso靶向编码stat3蛋白的特定同种型(例如，同种型1)的mrna。在一些方面中，aso靶向stat3蛋白的所有同种型。在其它方面中，aso靶向stat3蛋白的两种同种型(例如，同种型1(uniprot id：p40763-1)和同种型2(uniprot id：p40763-2)、同种型2和同种型3(uniprot id：p40763-3)。
[0557]
在一些方面中，本公开的aso与stat3转录物(例如，seq id no:41或seq id no:43)的内含子内的区域杂交。在某些方面中，本公开的aso与stat3转录物(例如，seq id no:41或seq id no:43)的外显子内的区域杂交。在其它方面中，本公开的aso与stat3转录物(例如，seq id no:41或seq id no:43)的外显子-内含子接合点内的区域杂交。在一些方面中，本公开的aso与stat3转录物(例如，内含子、外显子或外显子-内含子接合点)，例如seq id no:41或seq id no:43内的区域杂交，其中aso具有根据下式的设计：如本文别处所述的5'a-b-c 3'。
[0558]
在一些方面中，本公开的aso与stat3转录物(例如，基因组序列，seq id no:41)内的多个靶区域杂交。在一些方面中，aso与stat3转录物内的两个不同靶区域杂交。在一些方面中，aso与stat3转录物内的三个不同靶区域杂交。与多个靶区域杂交的示例性aso的序列以及不同靶区域的起始/终止位点提供于图1d中。在一些方面中，相较于与stat3转录物(例如，基因组序列，seq id no:41)内的单个区域杂交的aso，与stat3转录物(例如，基因组序列，seq id no:41)内的多个区域杂交的aso在降低stat3表达方面更有效(例如，具有较低ec50)。
[0559]
本公开的aso包含连续核苷酸序列，所述连续核苷酸序列对应于stat3转录物(例如，对应于seq id no:41的核苷酸序列)的区域的互补序列。
[0560]
在一些方面中，本公开的aso的核苷酸序列或连续核苷酸序列与选自seq id no:889-988的序列(即，图1d中的序列)具有至少约80％序列同一性，如至少约80％、至少约85％、至少约90％、至少约91％、至少约92％、至少约93％、至少约94％、至少约95％、至少约96％序列同一性、至少约97％序列同一性、至少约98％序列同一性、至少约99％序列同一性，如约100％序列同一性(同源)。在一些方面中，aso具有本文别处描述的设计或本文别处所示的化学结构(例如，图1d)。
[0561]
在一些方面中，aso(或其连续核苷酸部分)选自或包含选自由以下组成的组的序
列中的一个：stat3的seq id no:889-988或其至少10个连续核苷酸的区域，其中当与相应的stat3转录物相比时，aso(或其连续核苷酸部分)可任选地包含1、2个、3个或4个错配。靶向stat3基因的非限制性示例性aso显示在图1d中。
[0562]
在一些方面中，aso包含如seq id no:889中列出的序列(例如，aso-stat3-2559)。在一些方面中，aso包含如seq id no:890中列出的序列(例如，aso-stat3-2556)。在一些方面中，aso包含如seq id no:891中列出的序列(例如，aso-stat3-2557)。在一些方面中，aso包含如seq id no:892中列出的序列(例如，aso-stat3-1046)。在一些方面中，aso包含如seq id no:893中列出的序列(例如，aso-stat3-351)。在一些方面中，aso包含如seq id no:894中列出的序列(例如，aso-stat3-450)。在一些方面中，aso包含如seq id no:895中列出的序列(例如，aso-stat3-2558)。在一些方面中，aso包含如seq id no:896中列出的序列(例如，aso-stat3-2558)。在一些方面中，aso包含如seq id no:897中列出的序列(例如，aso-stat3-865)。在一些方面中，aso包含如seq id no:898中列出的序列(例如，aso-stat3-894)。在一些方面中，aso包含如seq id no:899中列出的序列(例如，aso-stat3-1778)。在一些方面中，aso包含如seq id no:900中列出的序列(例如，aso-stat3-2558)。在一些方面中，aso包含如seq id no:901中列出的序列(例如，aso-stat3-1482)。在一些方面中，aso包含如seq id no:902中列出的序列(例如，aso-stat3-892)。在一些方面中，aso包含如seq id no:903中列出的序列(例如，aso-stat3-2262)。在一些方面中，aso包含如seq id no:904中列出的序列(例如，aso-stat3-2267)。在一些方面中，aso包含如seq id no:905中列出的序列(例如，aso-stat3-411)。在一些方面中，aso包含如seq id no:906中列出的序列(例如，aso-stat3-2267)。在一些方面中，aso包含如seq id no:907中列出的序列(例如，aso-stat3-896)。在一些方面中，aso包含如seq id no:908中列出的序列(例如，aso-stat3-2555)。在一些方面中，aso包含如seq id no:909中列出的序列(例如，aso-stat3-525)。在一些方面中，aso包含如seq id no:910中列出的序列(例如，aso-stat3-1766)。在一些方面中，aso包含如seq id no:911中列出的序列(例如，aso-stat3-1114)。在一些方面中，aso包含如seq id no:912中列出的序列(例如，aso-stat3-2557)。在一些方面中，aso包含如seq id no:913中列出的序列(例如，aso-stat3-995)。在一些方面中，aso包含如seq id no:914中列出的序列(例如，aso-stat3-2263)。在一些方面中，aso包含如seq id no:915中列出的序列(例如，aso-stat3-511)。在一些方面中，aso包含如seq id no:916中列出的序列(例如，aso-stat3-511)。在一些方面中，aso包含如seq id no:917中列出的序列(例如，aso-stat3-1043)。在一些方面中，aso包含如seq id no:918中列出的序列(例如，aso-stat3-1780)。在一些方面中，aso包含如seq id no:919中列出的序列(例如，aso-stat3-458)。在一些方面中，aso包含如seq id no:920中列出的序列(例如，aso-stat3-894)。在一些方面中，aso包含如seq id no:921中列出的序列(例如，aso-stat3-1779)。在一些方面中，aso包含如seq id no:922中列出的序列(例如，aso-stat3-2274)。在一些方面中，aso包含如seq id no:923中列出的序列(例如，aso-stat3-1039)。在一些方面中，aso包含如seq id no:924中列出的序列(例如，aso-stat3-1238)。在一些方面中，aso包含如seq id no:925中列出的序列(例如，aso-stat3-1239)。在一些方面中，aso包含如seq id no:926中列出的序列(例如，aso-stat3-516)。在一些方面中，aso包含如seq id no:927中列出的序列(例如，aso-stat3-1238)。在一些方面中，aso包含如seq id no:928中列出的序列
(例如，aso-stat3-1034)。在一些方面中，aso包含如seq id no:929中列出的序列(例如，aso-stat3-1239)。在一些方面中，aso包含如seq id no:930中列出的序列(例如，aso-stat3-1113)。在一些方面中，aso包含如seq id no:931中列出的序列(例如，aso-stat3-1484)。在一些方面中，aso包含如seq id no:932中列出的序列(例如，aso-stat3-2556)。在一些方面中，aso包含如seq id no:933中列出的序列(例如，aso-stat3-461)。在一些方面中，aso包含如seq id no:934中列出的序列(例如，aso-stat3-2273)。在一些方面中，aso包含如seq id no:935中列出的序列(例如，aso-stat3-1783)。在一些方面中，aso包含如seq id no:936中列出的序列(例如，aso-stat3-891)。在一些方面中，aso包含如seq id no:937中列出的序列(例如，aso-stat3-510)。在一些方面中，aso包含如seq id no:938中列出的序列(例如，aso-stat3-2115)。在一些方面中，aso包含如seq id no:939中列出的序列(例如，aso-stat3-1482)。在一些方面中，aso包含如seq id no:940中列出的序列(例如，aso-stat3-986)。在一些方面中，aso包含如seq id no:941中列出的序列(例如，aso-stat3-893)。在一些方面中，aso包含如seq id no:942中列出的序列(例如，aso-stat3-1237)。在一些方面中，aso包含如seq id no:943中列出的序列(例如，aso-stat3-1111)。在一些方面中，aso包含如seq id no:944中列出的序列(例如，aso-stat3-1236)。在一些方面中，aso包含如seq id no:945中列出的序列(例如，aso-stat3-2557)。在一些方面中，aso包含如seq id no:946中列出的序列(例如，aso-stat3-2264)。在一些方面中，aso包含如seq id no:947中列出的序列(例如，aso-stat3-1234)。在一些方面中，aso包含如seq id no:948中列出的序列(例如，aso-stat3-1241)。在一些方面中，aso包含如seq id no:949中列出的序列(例如，aso-stat3-524)。在一些方面中，aso包含如seq id no:950中列出的序列(例如，aso-stat3-890)。在一些方面中，aso包含如seq id no:951中列出的序列(例如，aso-stat3-1114)。在一些方面中，aso包含如seq id no:952中列出的序列(例如，aso-stat3-1108)。在一些方面中，aso包含如seq id no:953中列出的序列(例如，aso-stat3-409)。在一些方面中，aso包含如seq id no:954中列出的序列(例如，aso-stat3-1356)。在一些方面中，aso包含如seq id no:955中列出的序列(例如，aso-stat3-1231)。在一些方面中，aso包含如seq id no:956中列出的序列(例如，aso-stat3-2267)。在一些方面中，aso包含如seq id no:957中列出的序列(例如，aso-stat3-1238)。在一些方面中，aso包含如seq id no:958中列出的序列(例如，aso-stat3-1237)。在一些方面中，aso包含如seq id no:959中列出的序列(例如，aso-stat3-522)。在一些方面中，aso包含如seq id no:960中列出的序列(例如，aso-stat3-2266)。在一些方面中，aso包含如seq id no:961中列出的序列(例如，aso-stat3-1998)。在一些方面中，aso包含如seq id no:962中列出的序列(例如，aso-stat3-881)。在一些方面中，aso包含如seq id no:963中列出的序列(例如，aso-stat3-513)。在一些方面中，aso包含如seq id no:964中列出的序列(例如，aso-stat3-1107)。在一些方面中，aso包含如seq id no:965中列出的序列(例如，aso-stat3-1235)。在一些方面中，aso包含如seq id no:966中列出的序列(例如，aso-stat3-882)。在一些方面中，aso包含如seq id no:967中列出的序列(例如，aso-stat3-1112)。在一些方面中，aso包含如seq id no:968中列出的序列(例如，aso-stat3-521)。在一些方面中，aso包含如seq id no:969中列出的序列(例如，aso-stat3-1110)。在一些方面中，aso包含如seq id no:970中列出的序列(例如，aso-stat3-1475)。在一些方面中，aso包含如seq id no:971中列出的序列(例
如，aso-stat3-894)。在一些方面中，aso包含如seq id no:972中列出的序列(例如，aso-stat3-519)。在一些方面中，aso包含如seq id no:973中列出的序列(例如，aso-stat3-2553)。在一些方面中，aso包含如seq id no:974中列出的序列(例如，aso-stat3-2552)。在一些方面中，aso包含如seq id no:975中列出的序列(例如，aso-stat3-883)。在一些方面中，aso包含如seq id no:976中列出的序列(例如，aso-stat3-842)。在一些方面中，aso包含如seq id no:977中列出的序列(例如，aso-stat3-851)。在一些方面中，aso包含如seq id no:978中列出的序列(例如，aso-stat3-2265)。在一些方面中，aso包含如seq id no:979中列出的序列(例如，aso-stat3-520)。在一些方面中，aso包含如seq id no:980中列出的序列(例如，aso-stat3-985)。在一些方面中，aso包含如seq id no:981中列出的序列(例如，aso-stat3-524)。在一些方面中，aso包含如seq id no:982中列出的序列(例如，aso-stat3-1106)。在一些方面中，aso包含如seq id no:983中列出的序列(例如，aso-stat3-517)。在一些方面中，aso包含如seq id no:984中列出的序列(例如，aso-stat3-1721)。在一些方面中，aso包含如seq id no:985中列出的序列(例如，aso-stat3-1113)。在一些方面中，aso包含如seq id no:986中列出的序列(例如，aso-stat3-992)。在一些方面中，aso包含如seq id no:987中列出的序列(例如，aso-stat3-993)。在一些方面中，aso包含如seq id no:988中列出的序列(例如，aso-stat3-1104)。
[0563]
在一些方面中，aso包含与seq id no:889至988中列出的序列至少约60％、至少约65％、至少约70％、至少约75％、至少约80％、至少约85％、至少约90％、至少约95％、至少约96％、至少约97％、至少约98％、至少约99％或约100％同一的序列或由其组成。在一些方面中，aso(或其连续核苷酸部分)选自或包含选自由以下组成的组的序列中的一个：seq id no:889至988或其至少8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19或20个连续核苷酸的区域。在一些方面中，aso(或其连续核苷酸部分)选自或包含选自由以下组成的组的序列中的一个：seq id no:889至988或其至少8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19或20个连续核苷酸的区域，其中当与相应的stat3转录物相比时，aso(或其连续核苷酸部分)可任选地包含1个、2个、3个或4个错配。在一些方面中，aso(或其连续核苷酸部分)选自或包含选自由以下组成的组的序列中的一个：seq id no:889至988，除了1、2、3、4、5、6、7、8、9或10个取代外，其中取代的aso可结合至cebpb转录物。在一些方面中，aso(或其连续核苷酸部分)选自或包含选自由以下组成的组的序列中的一个：seq id no:889至988或其至少8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19或20个连续核苷酸的区域，其中aso(或其连续核苷酸部分)可任选地包含与相应的stat3转录物互补的1个、2个、3个或4个另外的5'和/或3'核苷酸。
[0564]
在一些方面中，靶向本文公开的stat3转录物的aso与编码stat3的mrna转录物的结合可降低stat3的表达水平和/或活性水平。
[0565]
ii.c.5.靶向nras的aso
[0566]
nras是编码在高尔基体与质膜之间穿梭的膜蛋白的致癌基因。编码nras的基因组dna可位于染色体位置1p13.2(即genbank登录号ng_007572的核苷酸5001至17438)。具体地，时差显微术和光漂白技术的组合揭示，在没有棕榈酰化的情况下，gfp标记的n-ras在细胞溶质与er/高尔基体膜之间发生快速交换，并且野生型gfp-n-ras是通过非囊泡机制再循环至高尔基氏复合体。n-ras突变已在黑素瘤、甲状腺癌、畸胎癌、纤维肉瘤、成神经细胞瘤、横纹肌肉瘤、伯基特淋巴瘤、急性早幼粒细胞白血病、t细胞白血病和慢性髓细胞性白血病
中进行了描述。致癌性n-ras可在小鼠中诱导急性骨髓性白血病(aml)或慢性骨髓单核细胞性白血病(cmml)样疾病。
[0567]
成神经细胞瘤ras病毒致癌基因(nras)在本领域中以各种名称所已知。此类名称包括：gtp酶nras、n-ras蛋白部分4、成神经细胞瘤ras病毒(v-ras)致癌基因同源物成神经细胞瘤ras病毒致癌基因同源物、转化蛋白n-ras和v-ras成神经细胞瘤ras病毒致癌基因同源物。
[0568]
nras基因提供用于制造称为n-ras的蛋白质的指令，所述蛋白质主要参与调控细胞分裂。编码人nras的mrna序列可在ncbi参考序列nm_002524.5找到，并且由编码序列(seq id no:53)表示。
[0569]
人nras基因产物的天然变体是已知的。例如，人nras蛋白的天然变体可含有选自以下的一个或多个氨基酸取代：g12d、g13d、t50i、g60e和它们的任何组合。由选择性剪接产生的人nras蛋白的另外变体也是本领域中已知的，如：g13r、q61k、q61r和p34l。因此，本公开的aso可被设计为降低或抑制stat3蛋白的天然变体的表达。
[0570]
seq id no:51与nras前体mrna序列同一，除了seq id no:51中的核苷酸“t”在前体mrna中显示为“u”。在某些方面中，“靶核酸”包含编码nras蛋白的核酸或其天然存在的变体以及源自其的rna核酸(例如，前体mrna)的内含子。在其它方面中，靶核酸包含编码nras蛋白的核酸或其天然存在的变体以及源自其的rna核酸(例如，前体mrna)的外显子区域。在其它方面中，靶核酸包含编码nras蛋白的核酸或其天然存在的变体以及源自其的rna核酸(例如，前体mrna)的外显子-内含子接合点。在一些方面中，例如当用于研究或诊断时，“靶核酸”可以是源自上述dna或rna核酸靶标的cdna或合成寡核苷酸。由nras前体mrna编码的人nras蛋白序列显示为seq id no:52。在其它方面中，靶核酸包含编码nras蛋白的核酸或其天然存在的变体的非翻译区，例如5'utr、3'utr或两者。
[0571]
在某些方面中，本公开的aso还能够下调(例如，降低或除去)nras mrna或蛋白质的表达。在这方面，本公开的aso可通过降低通常哺乳动物细胞，诸如人细胞，诸如肿瘤细胞中的nras mrna水平来影响对nras蛋白的间接抑制。特别地，本公开涉及靶向nras pre-mrna的一个或多个区域(例如，内含子区域、外显子区域和/或外显子-内含子接合点区域)的aso。除非另有说明，否则如本文所用的术语“nras”可指来自一种或多种物种(例如，人、非人灵长类动物、狗、猫、豚鼠、兔、大鼠、小鼠、马、牛和熊)的nras。
[0572]
在一些方面中，本公开的aso与nras转录物(例如，seq id no:51或seq id no:53)的内含子内的区域杂交。在某些方面中，本公开的aso与nras转录物(例如，seq id no:51或seq id no:53)的外显子内的区域杂交。在其它方面中，本公开的aso与nras转录物(例如，seq id no:51或seq id no:53)的外显子-内含子接合点内的区域杂交。在一些方面中，本公开的aso与nras转录物(例如，内含子、外显子或外显子-内含子接合点)，例如seq id no:51或seq id no:53内的区域杂交，其中aso具有根据下式的设计：如本文别处所述的5'a-b-c 3'。
[0573]
在一些方面中，本公开的aso与nras转录物(例如，基因组序列，seq id no:51)内的多个靶区域杂交。在一些方面中，aso与nras转录物内的两个不同靶区域杂交。在一些方面中，aso与nras转录物内的三个不同靶区域杂交。与多个靶区域杂交的示例性aso的序列以及不同靶区域的起始/终止位点提供于图1e中。在一些方面中，相较于与nras转录物(例
no:1011中列出的序列(例如，aso-nras-183)。在一些方面中，aso包含如seq id no:1012中列出的序列(例如，aso-nras-325)。在一些方面中，aso包含如seq id no:1013中列出的序列(例如，aso-nras-337)。在一些方面中，aso包含如seq id no:1014中列出的序列(例如，aso-nras-338)。在一些方面中，aso包含如seq id no:1015中列出的序列(例如，aso-nras-341)。在一些方面中，aso包含如seq id no:1016中列出的序列(例如，aso-nras-378)。在一些方面中，aso包含如seq id no:1017中列出的序列(例如，aso-nras-379)。在一些方面中，aso包含如seq id no:1018中列出的序列(例如，aso-nras-388)。在一些方面中，aso包含如seq id no:1019中列出的序列(例如，aso-nras-389)。在一些方面中，aso包含如seq id no:1020中列出的序列(例如，aso-nras-399)。在一些方面中，aso包含如seq id no:1021中列出的序列(例如，aso-nras-400)。在一些方面中，aso包含如seq id no:1022中列出的序列(例如，aso-nras-401)。在一些方面中，aso包含如seq id no:1023中列出的序列(例如，aso-nras-402)。在一些方面中，aso包含如seq id no:1024中列出的序列(例如，aso-nras-408)。在一些方面中，aso包含如seq id no:1025中列出的序列(例如，aso-nras-421)。在一些方面中，aso包含如seq id no:1026中列出的序列(例如，aso-nras-422)。在一些方面中，aso包含如seq id no:1027中列出的序列(例如，aso-nras-429)。在一些方面中，aso包含如seq id no:1028中列出的序列(例如，aso-nras-490)。在一些方面中，aso包含如seq id no:1029中列出的序列(例如，aso-nras-513)。在一些方面中，aso包含如seq id no:1030中列出的序列(例如，aso-nras-514)。在一些方面中，aso包含如seq id no:1031中列出的序列(例如，aso-nras-520)。在一些方面中，aso包含如seq id no:1032中列出的序列(例如，aso-nras-521)。在一些方面中，aso包含如seq id no:1033中列出的序列(例如，aso-nras-522)。在一些方面中，aso包含如seq id no:1034中列出的序列(例如，aso-nras-524)。在一些方面中，aso包含如seq id no:1035中列出的序列(例如，aso-nras-532)。在一些方面中，aso包含如seq id no:1036中列出的序列(例如，aso-nras-534)。在一些方面中，aso包含如seq id no:1037中列出的序列(例如，aso-nras-535)。在一些方面中，aso包含如seq id no:1038中列出的序列(例如，aso-nras-536)。在一些方面中，aso包含如seq id no:1039中列出的序列(例如，aso-nras-537)。在一些方面中，aso包含如seq id no:1040中列出的序列(例如，aso-nras-539)。在一些方面中，aso包含如seq id no:1041中列出的序列(例如，aso-nras-604)。在一些方面中，aso包含如seq id no:1042中列出的序列(例如，aso-nras-611)。在一些方面中，aso包含如seq id no:1043中列出的序列(例如，aso-nras-612)。在一些方面中，aso包含如seq id no:1044中列出的序列(例如，aso-nras-613)。在一些方面中，aso包含如seq id no:1045中列出的序列(例如，aso-nras-614)。在一些方面中，aso包含如seq id no:1046中列出的序列(例如，aso-nras-615)。在一些方面中，aso包含如seq id no:1047中列出的序列(例如，aso-nras-616)。在一些方面中，aso包含如seq id no:1048中列出的序列(例如，aso-nras-617)。在一些方面中，aso包含如seq id no:1049中列出的序列(例如，aso-nras-618)。在一些方面中，aso包含如seq id no:1050中列出的序列(例如，aso-nras-619)。在一些方面中，aso包含如seq id no:1051中列出的序列(例如，aso-nras-620)。在一些方面中，aso包含如seq id no:1052中列出的序列(例如，aso-nras-622)。在一些方面中，aso包含如seq id no:1053中列出的序列(例如，aso-nras-623)。在一些方面中，aso包含如seq id no:1054中列出的序列(例如，aso-nras-624)。在一些方面中，aso包含如
seq id no:1055中列出的序列(例如，aso-nras-690)。在一些方面中，aso包含如seq id no:1056中列出的序列(例如，aso-nras-691)。在一些方面中，aso包含如seq id no:1057中列出的序列(例如，aso-nras-731)。在一些方面中，aso包含如seq id no:1058中列出的序列(例如，aso-nras-835)。在一些方面中，aso包含如seq id no:1059中列出的序列(例如，aso-nras-836)。在一些方面中，aso包含如seq id no:1060中列出的序列(例如，aso-nras-918)。在一些方面中，aso包含如seq id no:1061中列出的序列(例如，aso-nras-922)。在一些方面中，aso包含如seq id no:1062中列出的序列(例如，aso-nras-1072)。在一些方面中，aso包含如seq id no:1063中列出的序列(例如，aso-nras-1074)。在一些方面中，aso包含如seq id no:1064中列出的序列(例如，aso-nras-1313)。在一些方面中，aso包含如seq id no:1065中列出的序列(例如，aso-nras-1475)。在一些方面中，aso包含如seq id no:1066中列出的序列(例如，aso-nras-1617)。在一些方面中，aso包含如seq id no:1067中列出的序列(例如，aso-nras-1618)。在一些方面中，aso包含如seq id no:1068中列出的序列(例如，aso-nras-1621)。在一些方面中，aso包含如seq id no:1069中列出的序列(例如，aso-nras-1622)。在一些方面中，aso包含如seq id no:1070中列出的序列(例如，aso-nras-1623)。在一些方面中，aso包含如seq id no:1071中列出的序列(例如，aso-nras-1956)。在一些方面中，aso包含如seq id no:1072中列出的序列(例如，aso-nras-1957)。在一些方面中，aso包含如seq id no:1073中列出的序列(例如，aso-nras-1958)。在一些方面中，aso包含如seq id no:1074中列出的序列(例如，aso-nras-1959)。在一些方面中，aso包含如seq id no:1075中列出的序列(例如，aso-nras-1962)。在一些方面中，aso包含如seq id no:1076中列出的序列(例如，aso-nras-1965)。在一些方面中，aso包含如seq id no:1077中列出的序列(例如，aso-nras-2113)。在一些方面中，aso包含如seq id no:1078中列出的序列(例如，aso-nras-2114)。在一些方面中，aso包含如seq id no:1079中列出的序列(例如，aso-nras-2122)。在一些方面中，aso包含如seq id no:1080中列出的序列(例如，aso-nras-2417)。在一些方面中，aso包含如seq id no:1081中列出的序列(例如，aso-nras-2419)。在一些方面中，aso包含如seq id no:1082中列出的序列(例如，aso-nras-2759)。在一些方面中，aso包含如seq id no:1083中列出的序列(例如，aso-nras-2760)。在一些方面中，aso包含如seq id no:1084中列出的序列(例如，aso-nras-2761)。在一些方面中，aso包含如seq id no:1085中列出的序列(例如，aso-nras-2886)。在一些方面中，aso包含如seq id no:1086中列出的序列(例如，aso-nras-3557)。在一些方面中，aso包含如seq id no:1087中列出的序列(例如，aso-nras-4027)。在一些方面中，aso包含如seq id no:1088中列出的序列(例如，aso-nras-4082)。
[0579]
在一些方面中，aso包含与seq id no:989至1088中列出的序列至少约60％、至少约65％、至少约70％、至少约75％、至少约80％、至少约85％、至少约90％、至少约95％、至少约96％、至少约97％、至少约98％、至少约99％或约100％同一的序列或由其组成。在一些方面中，aso(或其连续核苷酸部分)选自或包含选自由以下组成的组的序列中的一个：seq id no:989至1088或其至少8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19或20个连续核苷酸的区域。在一些方面中，aso(或其连续核苷酸部分)选自或包含选自由以下组成的组的序列中的一个：seq id no:989至1088或其至少8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19或20个连续核苷酸的区域，其中当与相应的nras转录物相比时，aso(或其连续核苷酸部分)可任选地包含1
个、2个、3个或4个错配。在一些方面中，aso(或其连续核苷酸部分)选自或包含选自由以下组成的组的序列中的一个：seq id no:989至1088，除了1、2、3、4、5、6、7、8、9或10个取代外，其中取代的aso可结合至nras转录物。在一些方面中，aso(或其连续核苷酸部分)选自或包含选自由以下组成的组的序列中的一个：seq id no:989至1088或其至少8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19或20个连续核苷酸的区域，其中aso(或其连续核苷酸部分)可任选地包含与相应的nras转录物互补的1个、2个、3个或4个另外的5'和/或3'核苷酸。
[0580]
在一些方面中，靶向本文公开的nras转录物的aso与编码nras的mrna转录物的结合可降低nras的表达水平和/或活性水平。
[0581]
ii.c.6.靶向kras的aso
[0582]
kras在本领域中以各种名称所已知。此类名称包括：kras原癌基因，gtp酶；v-ki-ras2 kirsten大鼠肉瘤2病毒致癌基因同源物；gtp酶kras；c-ki-ras；k-ras 2；kras2；rask2；v-ki-ras2 kirsten大鼠肉瘤病毒致癌基因同源物；kirsten大鼠肉瘤病毒原癌基因；细胞转化原癌基因；细胞c-ki-ras2原癌基因；转化蛋白p21；pr310c-k-ras致癌基因；c-kirsten-ras蛋白；k-ras p21蛋白；和致癌基因kras2。
[0583]
人kras基因的序列可在染色体位置12p12.1和可公开获得genbank登录号nc_000012(25,204,789
–
25,250,936)下找到。人野生型kras转录物的基因组序列对应于nc_000012的残基25,204,789
–
25,250,936的反向互补序列(seq id no:35)。seq id no:31中提供的kras g12d基因组序列与seq id no:35不同，在于它在核苷酸位置5,587处具有鸟嘌呤至腺嘌呤取代。示例性kras g12d mrna序列提供于seq id no:33中，除了seq id no:33中的核苷酸“t”在mrna中显示为“u”。seq id no:33中提供的kras g12d mrna与野生型mrna序列(例如，genbank登录号nm_004985.5；seq id no:37)的不同，在于它在核苷酸位置225处具有鸟嘌呤至腺嘌呤取代。人kras蛋白的序列可在可公开获得的登录号：p01116(规范序列)、a8k8z5、b0lpf9、p01118和q96d10下找到，其各自以引用的方式整体并入本文。
[0584]
存在由选择性剪接产生的人kras蛋白(p01116)两种同种型。同种型2a(登录号：p01116-1；seq id no:38)是规范序列。它也被称为k-ras4a。同种型2b(登录号：p01116-2；也称为k-ras4b；seq id no:36)与规范序列的不同之处如下：(i)151-153：rve
→
gvd；和(ii)165-189：qyrlkkiskeektpgcvkikkciim(seq id no:599)
→
khkekmskdgkkkkkksktkcvim(seq id no:600)。在一些方面中，本文公开的aso可降低或抑制kras蛋白同种型2a、同种型2b或两者的表达。
[0585]
人kras基因产物的天然变体是已知的。例如，人kras蛋白的天然变体可含有选自以下的一个或多个氨基酸取代：k5e、k5n、g10gg、g10v、g12a、g12c、g12f、g12i、g12l、g12r、g12s、g12v、g13c、g13d、g13e、g13r、g13v、v14i、l19f、t20m、q22e、q22h、q22k、q22r、q25h、n26y、f28l、e31k、d33e、p34l、p34q、p34r、i36m、r41k、d57n、t58i、a59t、g60d、g60r、g60s、g60v、q61a、q61h、q61k、q61l、q61p、q61r、e63k、s65n、r68s、y71h、t74a、l79i、r97i、q99e、m111l、k117n、k117r、d119g、s122f、t144p、a146p、a146t、a146v、k147e、k147t、r149k、l159s、i163s、r164q、i183n、i84m或它们的组合。对kras蛋白同种型2b具有特异性的天然变体含有选自以下的一个或多个氨基酸取代：v152g、d153v、f156i、f156l或它们的组合。本公开的aso可被设计为降低或抑制kras蛋白的一种或多种变体(例如，本领域已知的任何变体)的表达。在一些方面中，kras突变体具有g12d的氨基酸取代。在一些方面中，本公开的
aso靶向一种或多种kras突变体。在其它方面中，aso所靶向的kras突变体是kras g12d(seq id no:32)。kras g12d mrna和kras g12d蛋白的示例性序列提供于seq id no:33和seq id no:32中。
[0586]
在一些方面中，本文公开的aso的靶核酸序列包含kras前体mrna的一个或多个区域。例如，seq id no:31(上文所述)与kras前体mrna序列同一，除了seq id no:31中的核苷酸“t”在前体mrna中显示为“u”。如本文所用，术语“靶核酸序列”是指与本文公开的aso互补的核酸序列。在某些方面中，靶核酸序列包含编码kras蛋白的核酸或其天然存在的变体以及源自其的rna核酸(例如，前体mrna)的外显子区域。在一些方面中，靶核酸序列包含编码kras蛋白的核酸或其天然存在的变体以及源自其的rna核酸(例如，前体mrna)的内含子。在另外的方面中，靶核酸序列包含编码kras蛋白的核酸或其天然存在的变体以及源自其的rna核酸(例如，前体mrna)的外显子-内含子接合点。在一些方面中，例如，当用于研究或诊断学中时，靶核酸可以是源自本文所述的dna或rna核酸靶标的cdna或合成寡核苷酸。在一些方面中，靶核酸包含编码kras蛋白的核酸或其天然存在的变体的非翻译区，例如5'utr、3'utr或两者。
[0587]
因此，在一些方面中，本文公开的aso与kras转录物(例如，seq id no:31或seq id no:33)的外显子区域杂交。在一些方面中，本公开的aso与kras转录物(例如，seq id no:31)的内含子区域杂交。在一些方面中，aso与kras转录物(例如，seq id no:31)的外显子-内含子接合点杂交。在一些方面中，本公开的aso与kras转录物(例如，内含子、外显子或外显子-内含子接合点)，例如seq id no:31内的区域杂交，其中所述aso具有本文别处描述的设计。
[0588]
在一些方面中，本文公开的aso的靶核酸序列是kras mrna，例如seq id no:33。因此，在某些方面中，本文公开的aso可与kras mrna的一个或多个区域杂交。在一些方面中，本公开的aso靶向编码kras蛋白的特定同种型的mrna。在某些方面中，本文公开的aso可靶向kras蛋白的所有同种型，包括其任何变体(例如，本文描述的那些)。在一些方面中，可通过本公开的aso靶向的kras蛋白包含g12d氨基酸取代。靶向kras转录物的非限制性示例性aso显示在图1f中。
[0589]
在一些方面中，aso包含选自由以下组成的组的序列：seq id no:807至820。在一些方面中，aso包含如seq id no:807中列出的序列(例如，aso-kras-0004)。在一些方面中，aso包含如seq id no:808中列出的序列(例如，aso-kras-0005)。在一些方面中，aso包含如seq id no:809中列出的序列(例如，aso-kras-0006)。在一些方面中，aso包含如seq id no:810中列出的序列(例如，aso-kras-0007)。在一些方面中，aso包含如seq id no:811中列出的序列(例如，aso-kras-0008)。在一些方面中，aso包含如seq id no:812中列出的序列(例如，aso-kras-0009)。在一些方面中，aso包含如seq id no:813中列出的序列(例如，aso-kras-0010)。在一些方面中，aso包含如seq id no:814中列出的序列(例如，aso-kras-0011)。在一些方面中，aso包含如seq id no:815中列出的序列(例如，aso-kras-0012)。在一些方面中，aso包含如seq id no:816中列出的序列(例如，aso-kras-0013)。在一些方面中，aso包含如seq id no:817中列出的序列(例如，aso-kras-0014)。在一些方面中，aso包含如seq id no:818中列出的序列(例如，aso-kras-0015)。在一些方面中，aso包含如seq id no:819中列出的序列(例如，aso-kras-0016)。在一些方面中，aso包含如seq id no:820
中列出的序列(例如，aso-kras-0017)。在一些方面中，aso包含选自由以下组成的组的序列：seq id no:821-835。在一些方面中，aso包含如seq id no:821中列出的序列(例如，aso-kras-0018)。在一些方面中，aso包含如seq id no:822中列出的序列(例如，aso-kras-0019)。在一些方面中，aso包含如seq id no:823中列出的序列(例如，aso-kras-0020)。在一些方面中，aso包含如seq id no:824中列出的序列(例如，aso-kras-0021)。在一些方面中，aso包含如seq id no:825中列出的序列(例如，aso-kras-0022)。在一些方面中，aso包含如seq id no:826中列出的序列(例如，aso-kras-0023)。在一些方面中，aso包含如seq id no:827中列出的序列(例如，aso-kras-0024)。在一些方面中，aso包含如seq id no:828中列出的序列(例如，aso-kras-0025)。在一些方面中，aso包含如seq id no:829中列出的序列(例如，aso-kras-0026)。在一些方面中，aso包含如seq id no:830中列出的序列(例如，aso-kras-0027)。在一些方面中，aso包含如seq id no:831中列出的序列(例如，aso-kras-0028)。在一些方面中，aso包含如seq id no:832中列出的序列(例如，aso-kras-0029)。在一些方面中，aso包含如seq id no:833中列出的序列(例如，aso-kras-0030)。在一些方面中，aso包含如seq id no:834中列出的序列(例如，aso-kras-0031)。在一些方面中，aso包含如seq id no:835中列出的序列(例如，aso-kras-0032)。在一些方面中，aso包含选自由以下组成的组的序列：seq id no:836-851。在一些方面中，aso包含如seq id no:836中列出的序列(例如，aso-kras-0033)。在一些方面中，aso包含如seq id no:837中列出的序列(例如，aso-kras-0034)。在一些方面中，aso包含如seq id no:838中列出的序列(例如，aso-kras-0035)。在一些方面中，aso包含如seq id no:839中列出的序列(例如，aso-kras-0036)。在一些方面中，aso包含如seq id no:840中列出的序列(例如，aso-kras-0037)。在一些方面中，aso包含如seq id no:841中列出的序列(例如，aso-kras-0038)。在一些方面中，aso包含如seq id no:842中列出的序列(例如，aso-kras-0039)。在一些方面中，aso包含如seq id no:843中列出的序列(例如，aso-kras-0040)。在一些方面中，aso包含如seq id no:844中列出的序列(例如，aso-kras-0041)。在一些方面中，aso包含如seq id no:845中列出的序列(例如，aso-kras-0042)。在一些方面中，aso包含如seq id no:846中列出的序列(例如，aso-kras-0043)。在一些方面中，aso包含如seq id no:847中列出的序列(例如，aso-kras-0044)。在一些方面中，aso包含如seq id no:848中列出的序列(例如，aso-kras-0045)。在一些方面中，aso包含如seq id no:849中列出的序列(例如，aso-kras-0046)。在一些方面中，aso包含如seq id no:850中列出的序列(例如，aso-kras-0047)。在一些方面中，aso包含如seq id no:851中列出的序列(例如，aso-kras-0048)。在一些方面中，aso包含选自由以下组成的组的序列：seq id no:852-868。在一些方面中，aso包含如seq id no:852中列出的序列(例如，aso-kras-0049)。在一些方面中，aso包含如seq id no:853中列出的序列(例如，aso-kras-0050)。在一些方面中，aso包含如seq id no:854中列出的序列(例如，aso-kras-0051)。在一些方面中，aso包含如seq id no:855中列出的序列(例如，aso-kras-0052)。在一些方面中，aso包含如seq id no:856中列出的序列(例如，aso-kras-0053)。在一些方面中，aso包含如seq id no:857中列出的序列(例如，aso-kras-0054)。在一些方面中，aso包含如seq id no:858中列出的序列(例如，aso-kras-0055)。在一些方面中，aso包含如seq id no:859中列出的序列(例如，aso-kras-0056)。在一些方面中，aso包含如seq id no:860中列出的序列(例如，aso-kras-0057)。在一些方面
中，aso包含如seq id no:861中列出的序列(例如，aso-kras-0058)。在一些方面中，aso包含如seq id no:862中列出的序列(例如，aso-kras-0059)。在一些方面中，aso包含如seq id no:863中列出的序列(例如，aso-kras-0060)。在一些方面中，aso包含如seq id no:864中列出的序列(例如，aso-kras-0061)。在一些方面中，aso包含如seq id no:865中列出的序列(例如，aso-kras-0062)。在一些方面中，aso包含如seq id no:866中列出的序列(例如，aso-kras-0063)。在一些方面中，aso包含如seq id no:867中列出的序列(例如，aso-kras-0064)。在一些方面中，aso包含如seq id no:868中列出的序列(例如，aso-kras-0065)。在一些方面中，aso包含选自由以下组成的组的序列：seq id no:869-888。在一些方面中，aso包含如seq id no:869中列出的序列(例如，aso-kras-0066)。在一些方面中，aso包含如seq id no:870中列出的序列(例如，aso-kras-0067)。在一些方面中，aso包含如seq id no:871中列出的序列(例如，aso-kras-0068)。在一些方面中，aso包含如seq id no:872中列出的序列(例如，aso-kras-0069)。在一些方面中，aso包含如seq id no:873中列出的序列(例如，aso-kras-0070)。在一些方面中，aso包含如seq id no:874中列出的序列(例如，aso-kras-0071)。在一些方面中，aso包含如seq id no:875中列出的序列(例如，aso-kras-0072)。在一些方面中，aso包含如seq id no:876中列出的序列(例如，aso-kras-0073)。在一些方面中，aso包含如seq id no:877中列出的序列(例如，aso-kras-0074)。在一些方面中，aso包含如seq id no:878中列出的序列(例如，aso-kras-0075)。在一些方面中，aso包含如seq id no:879中列出的序列(例如，aso-kras-0076)。在一些方面中，aso包含如seq id no:880中列出的序列(例如，aso-kras-0077)。在一些方面中，aso包含如seq id no:881中列出的序列(例如，aso-kras-0078)。在一些方面中，aso包含如seq id no:882中列出的序列(例如，aso-kras-0079)。在一些方面中，aso包含如seq id no:883中列出的序列(例如，aso-kras-0080)。在一些方面中，aso包含如seq id no:884中列出的序列(例如，aso-kras-0081)。在一些方面中，aso包含如seq id no:885中列出的序列(例如，aso-kras-0082)。在一些方面中，aso包含如seq id no:886中列出的序列(例如，aso-kras-0083)。在一些方面中，aso包含如seq id no:887中列出的序列(例如，aso-kras-0084)。在一些方面中，aso包含如seq id no:888中列出的序列(例如，aso-kras-0085)。
[0590]
在一些方面中，aso包含与seq id no:807至888中列出的序列至少约60％、至少约65％、至少约70％、至少约75％、至少约80％、至少约85％、至少约90％、至少约95％、至少约96％、至少约97％、至少约98％、至少约99％或约100％同一的序列或由其组成。在一些方面中，aso(或其连续核苷酸部分)选自或包含选自由以下组成的组的序列中的一个：seq id no:807至888或其至少8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19或20个连续核苷酸的区域。在一些方面中，aso(或其连续核苷酸部分)选自或包含选自由以下组成的组的序列中的一个：seq id no:807至888或其至少8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19或20个连续核苷酸的区域，其中当与相应的kras转录物相比时，aso(或其连续核苷酸部分)可任选地包含1个、2个、3个或4个错配。在一些方面中，aso(或其连续核苷酸部分)选自或包含选自由以下组成的组的序列中的一个：seq id no:807至888，除了1、2、3、4、5、6、7、8、9或10个取代外，其中取代的aso可结合至kras转录物。在一些方面中，aso(或其连续核苷酸部分)选自或包含选自由以下组成的组的序列中的一个：seq id no:807至888或其至少8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19或20个连续核苷酸的区域，其中aso(或其连续核苷酸部分)可任选地包含
与相应的kras转录物互补的1个、2个、3个或4个另外的5'和/或3'核苷酸。
[0591]
在一些方面中，靶向本文公开的kras转录物的aso与编码kras的mrna转录物的结合可降低kras的表达水平和/或活性水平。
[0592]
ii.c.7靶向pmp22的aso
[0593]
外周髓鞘蛋白22(pmp22)也被称为生长停滞特异性蛋白3(gas-3)，由pmp22基因编码。pmp22是由160个氨基酸组成的22kda的跨膜糖蛋白，并且主要在周围神经系统的雪旺氏细胞中表达。雪旺氏细胞表现出pmp22的高表达，其中它可构成致密髓磷脂中总蛋白含量的2％-5％。致密髓磷脂是周围神经元髓鞘的主体，髓鞘是为神经元轴突提供电绝缘的保护性脂肪层。pmp22的表达水平在成人中枢神经系统中相对较低。
[0594]
在人中，pmp22基因位于染色体17p11.2上并且跨度约为40kb。所述基因含有在人和啮齿动物两者中保守的六个外显子，其中两个是5'非翻译外显子(1a和1b)，并且产生具有相同编码序列的两种不同rna转录物。所述两种转录物的5'非翻译区不同，并且具有它们自己的启动子调控表达。剩余的外显子(2至5)包含pmp22基因的编码区，并在转录后修饰(即选择性剪接)后连接在一起。pmp22蛋白的特征在于四个跨膜结构域、两个细胞外环(ecl1和ecl2)和一个细胞内环。已表明ecl1介导两种pmp22蛋白之间的同嗜性相互作用，而ecl2已显示介导pmp22蛋白与髓鞘蛋白零(mpz或mp0)之间的异嗜性相互作用。
[0595]
pmp22在致密髓磷脂的形成和维持中起重要作用。当雪旺氏细胞与神经元轴突接触时，pmp22的表达显著上调，而pmp22在轴突变性或横断期间下调。pmp22已显示与闭锁小带1和封闭蛋白相关，它们是参与与其它细胞和细胞外基质的粘附并且还支持髓磷脂的功能的蛋白质。除了细胞粘附功能，pmp22在雪旺氏细胞增殖过程中也上调，从而表明在细胞周期调控中起作用。pmp22在非神经组织中是可检测的，其中其表达已显示充当生长停滞特异性(gas-3)功能。
[0596]
pmp22基因的基因剂量不当可导致髓鞘的异常蛋白质合成和功能。由于髓磷脂的组分是按化学计量设定的，所以组分的任何不规则表达可导致髓磷脂的不稳定和神经性病症。pmp22基因表达的改变与多种神经病变相关，如1a型腓骨肌萎缩症(cmt1a)、代-索二氏病(dejerine
–
sottas disease)和遗传性压迫易感性神经病变(hnpp)。过多的pmp22(例如由基因复制引起)导致cmt1a。pmp22的基因复制是cmt的最常见遗传原因，其中pmp22的过度产生导致多种信号传导途径的缺陷和转录因子如knox20、sox10和egr2的功能障碍。
[0597]
人pmp22基因的序列可在可公开获得的ncbi refseq登录号nm_000304下找到。替代refseq mrna转录物分别具有登录号nm_001281455、nm-001281456、nm-153321和nm_153322。人pmp22基因位于染色体位置17p12的15,229,777-15,265,326。
[0598]
人pmp22前体mrna转录物的序列(seq id no:264)对应于染色体位置17p12的残基15,229,777-15,265,326的反向互补序列。pmp22 mrna序列(genbank登录号nm_000304.4)提供于seq id no:58中。人pmp22蛋白的序列可在可公开获得的uniprot登录号q01453下找到(规范序列，seq id no:60)。潜在pmp22同种型分别具有uniprot登录号a8mu75、j3kqw0、a0a2r8y5l5、j3kt36和j3qs08。对应于本文公开的登录号的数据库条目的可公开获得的内容以引用的方式整体并入。
[0599]
人pmp22基因产物的天然变体是已知的。例如，人pmp22蛋白的天然变体可含有选自以下的一个或多个氨基酸取代：l16p、s22f、δ25-26、d37v、v65f、s72l、s79c、g93r、
l105r、g107v、t118n、l147r、h12q、l16p、l19p、m69k、l71p、s72l、s72p、s72w、s76i、s79p、l80p、l80r、δ84、g100e、g100r、l105r、c109r、s149r、g150c、g150d、r157w、s22f、v30m、a67t、s23t、w28r、a67p、δ115-118以及它们的任何组合。
[0600]
本公开的aso可被设计为降低或抑制pmp22蛋白的天然变体的表达。
[0601]
aso的靶核酸序列的一个实例是pmp22前体mrna。seq id no:58表示人pmp22基因组序列(即，染色体17p12的核苷酸15,229,777-15,265,326，互补序列的反向互补序列)。seq id no:58与pmp22前体mrna序列同一，除了seq id no:58中的核苷酸“t”在前体mrna中显示为“u”。
[0602]
在一些方面中，aso包含长度为10至30个核苷酸的连续核苷酸序列，所述连续核苷酸序列与对应于如seq id no:264(pmp22完整mrna转录物)中列出的核苷酸序列的pmp22转录物的核苷酸1至1828或对应于如seq id no:59(pmp22编码序列)中列出的核苷酸序列的pmp22转录物的核苷酸208至690内的核酸序列互补。
[0603]
在一些方面中，所述连续核苷酸序列与pmp22转录物内的核酸序列至少约80％、至少约85％、至少约90％、至少约95％或约100％互补。在一些方面中，aso能够降低人细胞(例如，雪旺氏细胞)中的pmp22蛋白表达，其中所述人细胞表达pmp22蛋白。
[0604]
在一些方面中，与未暴露于aso的人细胞中的pmp22蛋白表达相比，所述pmp22蛋白表达降低至少约30％、至少约35％、至少约40％、至少约45％、至少约50％、至少约55％、至少约60％、至少约65％、至少约70％、至少约75％、至少约80％、至少约85％、至少约90％、至少约95％或约100％。
[0605]
在一些方面中，aso能够降低人细胞(例如，免疫细胞)中的pmp22 mrna的水平，其中所述人细胞表达pmp22 mrna。在一些方面中，与未暴露于aso的人细胞中的pmp22 mrna的水平相比，pmp22 mrna的所述水平降低至少约30％、至少约35％、至少约40％、至少约45％、至少约50％、至少约55％、至少约60％、至少约65％、至少约70％、至少约75％、至少约80％、至少约85％、至少约90％、至少约95％或约100％。
[0606]
在某些方面中，靶核酸包含编码pmp22蛋白的核酸或其天然存在的变体以及源自其的rna核酸(例如，前体mrna)的内含子。在其它方面中，靶核酸包含编码pmp22蛋白的核酸或其天然存在的变体以及源自其的rna核酸(例如，前体mrna)的外显子区域。在其它方面中，靶核酸包含编码pmp22蛋白的核酸或其天然存在的变体以及源自其的rna核酸(例如，前体mrna)的外显子-内含子接合点。在一些方面中，例如当用于研究或诊断时，靶核酸可以是源自上述dna或rna核酸靶标的cdna或合成寡核苷酸。人pmp22编码序列(cds)如seq id no:59所示，并且由pmp22前体mrna中的编码序列编码的蛋白质序列如seq id no:60所示。在其它方面中，靶核酸包含编码pmp22蛋白的核酸或其天然存在的变体的非翻译区，例如5'utr、3'utr或两者。
[0607]
在一些方面中，本公开的aso与pmp22转录物(例如，seq id no:58)的内含子内的区域杂交。在某些方面中，本公开的aso与pmp22转录物(例如，seq id no:58)的外显子内的区域杂交。在其它方面中，本公开的aso与pmp22转录物(例如，seq id no:58)的外显子-内含子接合点内的区域杂交。
[0608]
在一些方面中，aso包含与pmp22转录物内的核酸序列(例如对应于seq id no:264的区域)互补的连续核苷酸序列(例如，长度为10至30个核苷酸，例如，长度为20个核苷酸)。
315、301-316、302-317、303-318、304-319、305-320、306-321、307-322、308-323、309-324、310-325、311-326、312-327、313-328、314-329、315-330、316-331、317-332、318-333、319-334、320-335、321-336、322-337、323-338、324-339、325-340、326-341、327-342、328-343、329-344、330-345、331-346、332-347、333-348、334-349、335-350、336-351、337-352、338-353、339-354、340-355、341-356、342-357、343-358、344-359、345-360、346-361、347-362、348-363、349-364、350-365、351-366、352-367、353-368、354-369、355-370、356-371、357-372、358-373、359-374、360-375、361-376、362-377、363-378、364-379、365-380、366-381、367-382、368-383、369-384、370-385、371-386、372-387、373-388、374-389、375-390、376-391、377-392、378-393、379-394、380-395、381-396、382-397、383-398、384-399、385-400、386-401、387-402、388-403、389-404、390-405、391-406、392-407、393-408、394-409、395-410、396-411、397-412、398-413、399-414、400-415、401-416、402-417、403-418、404-419、405-420、406-421、407-422、408-423、409-424、410-425、411-426、412-427、413-428、414-429、415-430、416-431、417-432、418-433、419-434、420-435、421-436、422-437、423-438、424-439、425-440、426-441、427-442、428-443、429-444、430-445、431-446、432-447、433-448、434-449、435-450、436-451、437-452、438-453、439-454、440-455、441-456、442-457、443-458、444-459、445-460、446-461、447-462、448-463、449-464、450-465、451-466、452-467、453-468、454-469、455-470、456-471、457-472、458-473、459-474、460-475、461-476、462-477、463-478、464-479、465-480、466-481、467-482、468-483、469-484、470-485、471-486、472-487、473-488、474-489、475-490、476-491、477-492、478-493、479-494、480-495、481-496、482-497、483-498、484-499、485-500、486-501、487-502、488-503、489-504、490-505、491-506、492-507、493-508、494-509、495-510、496-511、497-512、498-513、499-514、500-515、501-516、502-517、503-518、504-519、505-520、506-521、507-522、508-523、509-524、510-525、511-526、512-527、513-528、514-529、515-530、516-531、517-532、518-533、519-534、520-535、521-536、522-537、523-538、524-539、525-540、526-541、527-542、528-543、529-544、530-545、531-546、532-547、533-548、534-549、535-550、536-551、537-552、538-553、539-554、540-555、541-556、542-557、543-558、544-559、545-560、546-561、547-562、548-563、549-564、550-565、551-566、552-567、553-568、554-569、555-570、556-571、557-572、558-573、559-574、560-575、561-576、562-577、563-578、564-579、565-580、566-581、567-582、568-583、569-584、570-585、571-586、572-587、573-588、574-589、575-590、576-591、577-592、578-593、579-594、580-595、581-596、582-597、583-598、584-599、585-600、586-601、587-602、588-603、589-604、590-605、591-606、592-607、593-608、594-609、595-610、596-611、597-612、598-613、599-614、600-615、601-616、602-617、603-618、604-619、605-620、606-621、607-622、608-623、609-624、610-625、611-626、612-627、613-628、614-629、615-630、616-631、617-632、618-633、619-634、620-635、621-636、622-637、623-638、624-639、625-640、626-641、627-642、628-643、629-644、630-645、631-646、632-647、633-648、634-649、635-650、636-651、637-652、638-653、639-654、640-655、641-656、642-657、643-658、644-659、645-660、646-661、647-662、648-663、649-664、650-665、651-666、652-667、653-668、654-669、655-670、656-671、657-672、658-673、659-674、660-675、661-676、662-677、663-678、664-679、665-680、666-681、667-682、668-683、669-684、670-685、
671-686、672-687、673-688、674-689、675-690。
[0611]
在一些方面中，靶区域对应于seq id no:58的位置208与690之间的16聚体核苷酸。在一些方面中，靶区域对应于seq id no:58的位置208与690之间的17聚体核苷酸。在一些方面中，靶区域对应于seq id no:58的位置208与690之间的18聚体核苷酸序列。在一些方面中，靶区域对应于seq id no:58的位置208与690之间的19聚体核苷酸序列。在一些方面中，靶区域对应于seq id no:58的位置208与690之间的20聚体核苷酸序列。在一些方面中，靶区域对应于在3'端和/或5'端
±
10、
±
20、
±
30、
±
40、
±
50、
±
60、
±
70、
±
80或
±
90个核苷酸的上文公开的16聚体、17聚体、18聚体、19聚体或20聚体靶区域。
[0612]
在一些方面中，aso不是atcttcaatcaacagc(seq id no:61)。
[0613]
在一些方面中，aso是atcttcaatcaacagc(seq id no:61)。
[0614]
在一些方面中，本公开的aso与pmp22转录物(例如，基因组序列，seq id no:58)内的多个靶区域杂交。在一些方面中，aso与pmp22转录物内的两个不同靶区域杂交。在一些方面中，aso与pmp22转录物内的三个不同靶区域杂交。在一些方面中，相较于与pmp22转录物(例如，基因组序列，seq id no:58)内的单个区域杂交的aso，与pmp22转录物(例如，基因组序列，seq id no:58)内的多个区域杂交的aso在降低pmp22表达方面更有效(例如，具有较低ec50)。
[0615]
在一些方面中，aso能够下调(例如，降低或除去)人和啮齿动物(例如，小鼠或大鼠)两者中的pmp22 mrna或蛋白质的表达。在一些方面中，本文所述的任何aso是缀合物的一部分，所述缀合物包含与至少一个非核苷酸或非多核苷酸共价连接的aso。
[0616]
本公开的aso包含连续核苷酸序列，所述连续核苷酸序列对应于pmp22转录物(例如，对应于seq id no:58的核苷酸序列)的区域的互补序列。
[0617]
在一些方面中，本公开的aso的核苷酸序列或连续核苷酸序列与选自seq id no:62-95或201-270的序列(即，图28和29中的反义序列)具有至少约80％序列同一性，如至少约80％、至少约85％、至少约90％、至少约91％、至少约92％、至少约93％、至少约94％、至少约95％、至少约96％序列同一性、至少约97％序列同一性、至少约98％序列同一性、至少约99％序列同一性，如约100％序列同一性(同源)。在一些方面中，aso具有本文别处描述的设计或本文别处所示的化学结构(即，图28和29中的反义序列)。
[0618]
在一些方面中，aso(或其连续核苷酸部分)选自或包含选自由以下组成的组的序列中的一个：pmp22的seq id no:62-95或201-270或其至少10个连续核苷酸的区域，其中当与相应的pmp22转录物相比时，aso(或其连续核苷酸部分)可任选地包含1个、2个、3个或4个错配。靶向pmp22基因的非限制性示例性aso显示在图28和29中。
[0619]
在一些方面中，aso包含如seq id no:65中列出的序列。在一些方面中，aso包含如seq id no:66中列出的序列。在一些方面中，aso包含如seq id no:67中列出的序列。在一些方面中，aso包含如seq id no:68中列出的序列。在一些方面中，aso包含如seq id no:69中列出的序列。在一些方面中，aso包含如seq id no:70中列出的序列。在一些方面中，aso包含如seq id no:71中列出的序列。在一些方面中，aso包含如seq id no:72中列出的序列。在一些方面中，aso包含如seq id no:73中列出的序列。在一些方面中，aso包含如seq id no:74中列出的序列。在一些方面中，aso包含如seq id no:75中列出的序列。在一些方面中，aso包含如seq id no:76中列出的序列。在一些方面中，aso包含如seq id no:77中列
出的序列。在一些方面中，aso包含如seq id no:78中列出的序列。在一些方面中，aso包含如seq id no:79中列出的序列。在一些方面中，aso包含如seq id no:80中列出的序列。在一些方面中，aso包含如seq id no:81中列出的序列。在一些方面中，aso包含如seq id no:82中列出的序列。在一些方面中，aso包含如seq id no:83中列出的序列。在一些方面中，aso包含如seq id no:84中列出的序列。在一些方面中，aso包含如seq id no:85中列出的序列。在一些方面中，aso包含如seq id no:86中列出的序列。在一些方面中，aso包含如seq id no:87中列出的序列。在一些方面中，aso包含如seq id no:88中列出的序列。在一些方面中，aso包含如seq id no:89中列出的序列。在一些方面中，aso包含如seq id no:90中列出的序列。在一些方面中，aso包含如seq id no:91中列出的序列。在一些方面中，aso包含如seq id no:92中列出的序列。在一些方面中，aso包含如seq id no:93中列出的序列。在一些方面中，aso包含如seq id no:94中列出的序列。在一些方面中，aso包含如seq id no:95中列出的序列。在一些方面中，aso包含如seq id no:201中列出的序列。在一些方面中，aso包含如seq id no:202中列出的序列。在一些方面中，aso包含如seq id no:203中列出的序列。在一些方面中，aso包含如seq id no:204中列出的序列。在一些方面中，aso包含如seq id no:205中列出的序列。在一些方面中，aso包含如seq id no:206中列出的序列。在一些方面中，aso包含如seq id no:207中列出的序列。在一些方面中，aso包含如seq id no:208中列出的序列。在一些方面中，aso包含如seq id no:209中列出的序列。在一些方面中，aso包含如seq id no:210中列出的序列。在一些方面中，aso包含如seq id no:211中列出的序列。在一些方面中，aso包含如seq id no:212中列出的序列。在一些方面中，aso包含如seq id no:213中列出的序列。在一些方面中，aso包含如seq id no:214中列出的序列。在一些方面中，aso包含如seq id no:215中列出的序列。在一些方面中，aso包含如seq id no:216中列出的序列。在一些方面中，aso包含如seq id no:217中列出的序列。在一些方面中，aso包含如seq id no:218中列出的序列。在一些方面中，aso包含如seq id no:219中列出的序列。在一些方面中，aso包含如seq id no:220中列出的序列。在一些方面中，aso包含如seq id no:221中列出的序列。在一些方面中，aso包含如seq id no:222中列出的序列。在一些方面中，aso包含如seq id no:223中列出的序列。在一些方面中，aso包含如seq id no:224中列出的序列。在一些方面中，aso包含如seq id no:225中列出的序列。在一些方面中，aso包含如seq id no:226中列出的序列。在一些方面中，aso包含如seq id no:227中列出的序列。在一些方面中，aso包含如seq id no:228中列出的序列。在一些方面中，aso包含如seq id no:229中列出的序列。在一些方面中，aso包含如seq id no:230中列出的序列。在一些方面中，aso包含如seq id no:231中列出的序列。在一些方面中，aso包含如seq id no:232中列出的序列。在一些方面中，aso包含如seq id no:233中列出的序列。在一些方面中，aso包含如seq id no:234中列出的序列。在一些方面中，aso包含如seq id no:235中列出的序列。在一些方面中，aso包含如seq id no:236中列出的序列。在一些方面中，aso包含如seq id no:237中列出的序列。在一些方面中，aso包含如seq id no:238中列出的序列。在一些方面中，aso包含如seq id no:239中列出的序列。在一些方面中，aso包含如seq id no:240中列出的序列。在一些方面中，aso包含如seq id no:241中列出的序列。在一些方面中，aso包含如seq id no:242中列出的序列。在一些方面中，aso包含如seq id no:243中列出的序列。在一些方面中，aso包含如seq id no:244中列出的序列。在一些方面中，aso包含
如seq id no:245中列出的序列。在一些方面中，aso包含如seq id no:246中列出的序列。在一些方面中，aso包含如seq id no:247中列出的序列。在一些方面中，aso包含如seq id no:248中列出的序列。在一些方面中，aso包含如seq id no:249中列出的序列。在一些方面中，aso包含如seq id no:250中列出的序列。在一些方面中，aso包含如seq id no:251中列出的序列。在一些方面中，aso包含如seq id no:252中列出的序列。在一些方面中，aso包含如seq id no:253中列出的序列。在一些方面中，aso包含如seq id no:254中列出的序列。在一些方面中，aso包含如seq id no:255中列出的序列。在一些方面中，aso包含如seq id no:256中列出的序列。在一些方面中，aso包含如seq id no:257中列出的序列。在一些方面中，aso包含如seq id no:258中列出的序列。在一些方面中，aso包含如seq id no:259中列出的序列。在一些方面中，aso包含如seq id no:260中列出的序列。在一些方面中，aso包含如seq id no:261中列出的序列。在一些方面中，aso包含如seq id no:262中列出的序列。在一些方面中，aso包含如seq id no:263中列出的序列。在一些方面中，aso包含如seq id no:264中列出的序列。在一些方面中，aso包含如seq id no:265中列出的序列。在一些方面中，aso包含如seq id no:266中列出的序列。在一些方面中，aso包含如seq id no:267中列出的序列。在一些方面中，aso包含如seq id no:268中列出的序列。在一些方面中，aso包含如seq id no:269中列出的序列。在一些方面中，aso包含如seq id no:270中列出的序列。
[0620]
在一些方面中，aso包含与seq id no:62-95和201-270中列出的序列至少约60％、至少约65％、至少约70％、至少约75％、至少约80％、至少约85％、至少约90％、至少约95％、至少约96％、至少约97％、至少约98％、至少约99％或约100％同一的序列或由其组成。在一些方面中，aso(或其连续核苷酸部分)选自或包含选自由以下组成的组的序列中的一个：seq id no:62-95和201-270或其至少8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19或20个连续核苷酸的区域。在一些方面中，aso(或其连续核苷酸部分)选自或包含选自由以下组成的组的序列中的一个：seq id no:62-95和201-270或其至少8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19或20个连续核苷酸的区域，其中当与相应的pmp22转录物相比时，aso(或其连续核苷酸部分)可任选地包含1个、2个、3个或4个错配。在一些方面中，aso(或其连续核苷酸部分)选自或包含选自由以下组成的组的序列中的一个：seq id no:62-95和201-270，除了1、2、3、4、5、6、7、8、9或10个取代外，其中取代的aso可结合至pmp22转录物。在一些方面中，aso(或其连续核苷酸部分)选自或包含选自由以下组成的组的序列中的一个：seq id no:62-95和201-270或其至少8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19或20个连续核苷酸的区域，其中aso(或其连续核苷酸部分)可任选地包含与相应的pmp22转录物互补的1个、2个、3个或4个另外的5'和/或3'核苷酸。
[0621]
在一些方面中，靶向本文公开的pmp22转录物的aso与编码pmp22的mrna转录物的结合可降低pmp22的表达水平和/或活性水平。
[0622]
ii.d.ev，例如外泌体
[0623]
本公开的ev(例如，外泌体)可具有介于约20与约300nm之间的直径。在某些方面中，本公开的ev(例如，外泌体)具有介于约20-290nm、20-280nm、20-270nm、20-260nm、20-250nm、20-240nm、20-230nm、20-220nm、20-210nm、20-200nm、20-190nm、20-180nm、20-170nm、20-160nm、20-150nm、20-140nm、20-130nm、20-120nm、20-110nm、20-100nm、20-90nm、20-80nm、20-70nm、20-60nm、20-50nm、20-40nm、20-30nm、30-300nm、30-290nm、30-280nm、
30-270nm、30-260nm、30-250nm、30-240nm、30-230nm、30-220nm、30-210nm、30-200nm、30-190nm、30-180nm、30-170nm、30-160nm、30-150nm、30-140nm、30-130nm、30-120nm、30-110nm、30-100nm、30-90nm、30-80nm、30-70nm、30-60nm、30-50nm、30-40nm、40-300nm、40-290nm、40-280nm、40-270nm、40-260nm、40-250nm、40-240nm、40-230nm、40-220nm、40-210nm、40-200nm、40-190nm、40-180nm、40-170nm、40-160nm、40-150nm、40-140nm、40-130nm、40-120nm、40-110nm、40-100nm、40-90nm、40-80nm、40-70nm、40-60nm、40-50nm、50-300nm、50-290nm、50-280nm、50-270nm、50-260nm、50-250nm、50-240nm、50-230nm、50-220nm、50-210nm、50-200nm、50-190nm、50-180nm、50-170nm、50-160nm、50-150nm、50-140nm、50-130nm、50-120nm、50-110nm、50-100nm、50-90nm、50-80nm、50-70nm、50-60nm、60-300nm、60-290nm、60-280nm、60-270nm、60-260nm、60-250nm、60-240nm、60-230nm、60-220nm、60-210nm、60-200nm、60-190nm、60-180nm、60-170nm、60-160nm、60-150nm、60-140nm、60-130nm、60-120nm、60-110nm、60-100nm、60-90nm、60-80nm、60-70nm、70-300nm、70-290nm、70-280nm、70-270nm、70-260nm、70-250nm、70-240nm、70-230nm、70-220nm、70-210nm、70-200nm、70-190nm、70-180nm、70-170nm、70-160nm、70-150nm、70-140nm、70-130nm、70-120nm、70-110nm、70-100nm、70-90nm、70-80nm、80-300nm、80-290nm、80-280nm、80-270nm、80-260nm、80-250nm、80-240nm、80-230nm、80-220nm、80-210nm、80-200nm、80-190nm、80-180nm、80-170nm、80-160nm、80-150nm、80-140nm、80-130nm、80-120nm、80-110nm、80-100nm、80-90nm、90-300nm、90-290nm、90-280nm、90-270nm、90-260nm、90-250nm、90-240nm、90-230nm、90-220nm、90-210nm、90-200nm、90-190nm、90-180nm、90-170nm、90-160nm、90-150nm、90-140nm、90-130nm、90-120nm、90-110nm、90-100nm、100-300nm、110-290nm、120-280nm、130-270nm、140-260nm、150-250nm、160-240nm、170-230nm、180-220nm或190-210nm之间的直径。本文所述的ev(例如，外泌体)的大小可根据本领域已知的方法测量。
[0624]
本公开的ev(例如，外泌体)包含双脂质膜(“外泌体膜”或“ev膜”)，所述膜包括内表面(腔表面)和外表面。内表面面向ev(例如，外泌体)的内核，即ev的腔。
[0625]
ev或外泌体膜包含脂质和脂肪酸。示例性脂质包括磷脂、糖脂、脂肪酸、鞘脂、磷酸甘油酯、固醇、胆固醇和磷脂酰丝氨酸。ev或外泌体膜包含内部小叶和外部小叶。内部小叶和外部小叶的组成可通过本领域中已知的跨双层分布测定来确定，参见例如，kuypers等人,biohim biophys acta 1985 819:170。
[0626]
在一些方面中，外部小叶的组成是介于约70％-90％之间的胆碱磷脂、介于约0％-15％之间的酸性磷脂和介于约5％-30％之间的磷脂酰乙醇胺。在一些方面中，内部小叶的组成是介于约15％-40％之间的胆碱磷脂、介于约10％-50％之间的酸性磷脂和介于约30％-60％之间的磷脂酰乙醇胺。在一些方面中，ev或外泌体膜包含一种或多种多糖，诸如聚糖。ev或外泌体表面上的聚糖可充当与马来酰亚胺部分的连接或连接聚糖和马来酰亚胺部分的接头。聚糖可存在于ev(例如，外泌体)表面上的一种或多种蛋白质，例如支架x(诸如ptgfrn多肽)上，或存在于ev(例如，外泌体)的脂质膜上。聚糖可被修饰为具有硫代岩藻糖，所述硫代岩藻糖可充当将马来酰亚胺部分连接至聚糖的官能团。在一些方面中，支架x可进行修饰以表达大量聚糖，从而允许ev(例如，外泌体)上的另外连接。
[0627]
ii.d.1.支架部分
[0628]
在一些方面中，生物活性分子通过马来酰亚胺部分连接值ev(例如，外泌体)的表面或腔。在一些方面中，生物活性分子通过马来酰亚胺部分连接至ev(例如，外泌体)的外表面上或腔表面上的支架部分(例如，支架x)。
[0629]
在某些方面中，通过转染将一个或多个部分引入ev(例如，外泌体)中。在一些方面中，可使用合成大分子，诸如阳离子脂质和聚合物，将一个或多个部分引入ev(例如，外泌体)中(papapetrou等人,gene therapy 12:s118-s130(2005))。在某些方面中，诸如磷酸钙、环糊精或聚凝胺的化学物质可用于将一个或多个部分引入ev(例如，外泌体)。
[0630]
在一些方面中，一个或多个支架部分可以是cd47、cd55、cd49、cd40、cd133、cd59、磷脂酰肌醇蛋白聚糖-1、cd9、cd63、cd81、整联蛋白、选择蛋白、凝集素、钙粘蛋白、本领域技术人员已知的其它类似多肽或它们的任何组合。
[0631]
在其它方面中，一个或多个支架部分通过在生产细胞中重组表达所述支架部分而在ev(例如，外泌体)的膜中表达。从生产细胞获得的ev(例如，外泌体)可进行进一步修饰，以与马来酰亚胺部分或接头缀合。在其它方面中，支架部分、支架x和/或支架y是去糖基化的。在一些方面中，支架部分，支架x和/或支架y是高度糖基化的，例如，在相同条件下高于天然存在的支架x和/或支架y。
[0632]
ii.d.1.a.支架x
[0633]
支架部分的各种修饰或片段可用于本公开的方面。例如，经修饰而对结合剂具有增强的亲和力的支架部分可用于产生可使用结合剂纯化的表面工程化ev(例如，外泌体)。可使用经修饰以更有效地靶向ev(例如，外泌体)和/或膜的支架部分。还可使用经修饰以包含特异性且有效地靶向ev(例如，外泌体)膜所需的最小片段的支架部分。在一些方面中，支架部分可与如本文所述的马来酰亚胺部分连接。在其它方面中，支架部分不与马来酰亚胺部分连接。
[0634]
支架部分可合成或重组工程化，例如以表达为融合蛋白，例如支架x与另一个部分的融合蛋白。例如，融合蛋白可包含连接至另一个部分的本文公开的支架部分(例如，支架x，例如ptgfrn、bsg、igsf2、igsf3、igsf8、itgb1、itga4、slc3a2、atp转运蛋白或它们的片段或变体)。在融合蛋白的情况下，第二部分可以是天然肽、重组肽、合成肽或它们的任何组合。在其它方面中，支架部分可以是cd9、cd63、cd81、pdgfr、gpi锚蛋白、乳凝集素、lamp2或lamp2b或它们的任何组合。可用于本公开的其它支架部分的非限制性实例包括：氨基肽酶n(cd13)；脑啡肽酶，aka膜金属内肽酶(mme)；外核苷酸焦磷酸酶/磷酸二酯酶家族成员1(enpp1)；神经纤毛蛋白-1(nrp1)；或它们的任何组合。
[0635]
在一些方面中，本文所述的表面(例如，支架x)工程化的ev(例如，外泌体)与本领域已知的ev(例如，外泌体)相比表现出优异的特征。例如，与天然存在的ev(例如，外泌体)或使用常规ev(例如，外泌体)蛋白产生的ev(例如，外泌体)相比，表面(例如，支架x)工程化在ev(例如，外泌体)的外表面或腔表面上含有富集程度更高的经修饰的蛋白质。此外，与天然存在的ev(例如，外泌体)或使用常规ev(例如，外泌体)蛋白产生的ev(例如，外泌体)相比，本公开的表面(例如，支架x)工程化ev(例如，外泌体)可具有更大、更特异或更可控的生物活性。
[0636]
在一些方面中，支架x包含前列腺素f2受体负调控因子(ptgfrn多肽)。ptgfrn多肽也可称为cd9配偶体1(cd9p-1)、含glu-trp-ile ewi基序的蛋白f(ewi-f)、前列腺素f2-α受
体调控蛋白、前列腺素f2-α受体相关蛋白或cd315。人ptgfrn多肽(uniprot登录号q9p2b2)的全长氨基酸序列在下文示出。
[0637]
ptgfrn多肽(seq id no:301)
[0638][0639]
ptgfrn多肽含有信号肽(seq id no:301的氨基酸1至25)、细胞外结构域(seq id no:26的氨基酸301至832)、跨膜结构域(seq id no:301的氨基酸833至853)和细胞质结构域(seq id no:301的氨基酸854至879)。成熟ptgfrn多肽由不含信号肽的seq id no:301组成，即seq id no:301的氨基酸26至879。在一些方面中，可用于本公开的ptgfrn多肽片段包含ptgfrn多肽的跨膜结构域。在其它方面中，可用于本公开的ptgfrn多肽片段包含ptgfrn多肽的跨膜结构域并且(i)在跨膜结构域的n末端包含至少5、至少10、至少15、至少20、至少25、至少30、至少40、至少50、至少70、至少80、至少90、至少100、至少110、至少120、至少130、至少140、至少150个氨基酸，(ii)在跨膜结构域的c末端包含至少5、至少10、至少15、至少20或至少25个氨基酸，或(i)和(ii)两者。
[0640]
在一些方面中，ptgfrn多肽的片段缺少一个或多个功能性或结构性结构域，诸如igv。
[0641]
在其它方面中，支架x包含与seq id no:301的氨基酸26至879至少约70％、至少约75％、至少约80％、至少约85％、至少约90％、至少约95％、至少约96％、至少约97％、至少约98％、至少约99％或约100％同一的氨基酸序列。在其它方面中，支架x包含与seq id no:302(ptgfrn多肽的片段)至少约70％、至少约75％、至少约80％、至少约85％、至少约90％、至少约95％、至少约96％、至少约97％、至少约98％、至少约99％或约100％同一的氨基酸序列。在其它方面中，除1个氨基酸突变、2个氨基酸突变、3个氨基酸突变、4个氨基酸突变、5个氨基酸突变、6个氨基酸突变或7个氨基酸突变外，支架x包含seq id no:302的氨基酸序列。突变可以是取代、插入、缺失或它们的任何组合。在一些方面中，支架x包含seq id no:302的氨基酸序列并且在seq id no:302的n末端和/或c末端包含1个氨基酸、2个氨基酸、3个氨基酸、4个氨基酸、5个氨基酸、6个氨基酸、7个氨基酸、8个氨基酸、9个氨基酸、10个氨基酸、11个氨基酸、12个氨基酸、13个氨基酸、14个氨基酸、15个氨基酸、16个氨基酸、17个氨基酸、18个氨基酸、19个氨基酸、或20个氨基酸或更多个氨基酸。
[0642]
在其它方面中，支架x包含与seq id no:301的氨基酸26至879、seq id no:301的氨基酸833至853、seq id no:302或seq id no:301至少约70％、至少约75％、至少约80％、至少约85％、至少约90％、至少约95％、至少约96％、至少约97％、至少约98％、至少约99％或约100％同一的氨基酸序列。在其它方面中，除了1个氨基酸突变、2个氨基酸突变、3个氨基酸突变、4个氨基酸突变、5个氨基酸突变、6个氨基酸突变或7七个氨基酸突变外，支架x包
含seq id no:301的氨基酸26至879、seq id no:301的氨基酸833至853、seq id no:302或seq id no:301的氨基酸序列。突变可以是取代、插入、缺失或它们的任何组合。在一些方面中，支架x包含seq id no:301的氨基酸26至879、seq id no:301的氨基酸833至853、seq id no:302或seq id no:301的氨基酸序列并且在seq id no:1的氨基酸26至879、seq id no:301的氨基酸833至853、seq id no:302或seq id no:301的n末端和/c末端包含1个氨基酸、2个氨基酸、3个氨基酸、4个氨基酸、5个氨基酸、6个氨基酸、7个氨基酸、8个氨基酸、9个氨基酸、10个氨基酸、11个氨基酸、12个氨基酸、13个氨基酸、14个氨基酸、15个氨基酸、16个氨基酸、17个氨基酸、18个氨基酸、19个氨基酸、或20个氨基酸或更多个氨基酸。
[0643]
在一些方面中，支架x包含seq id no:301(ptgfrn蛋白)、302(全长ptgfrn的氨基酸687-878)、303(bsg蛋白)、304(igsf8蛋白)、305(itgb1蛋白)、306(itga4蛋白)、307(slc3a2蛋白)中列出的氨基序列或其功能片段，由其组成或基本上由其组成。
[0644]
在其它方面中，支架x包含bsg蛋白、igsf8蛋白、igsf3蛋白、itgb1蛋白、slc3a2蛋白、itga4蛋白、atp1a1蛋白、atp1a2蛋白、atp1a3蛋白、atp1a4蛋白、atp1a5蛋白、atp2b1蛋白、atp2b2蛋白、atp2b3蛋白、atp2b4蛋白或igsf2蛋白，其中支架x包含与相应的成熟bsg蛋白、igsf8蛋白、igsf3蛋白、itgb1蛋白、slc3a2蛋白、itga4蛋白、atp1a1蛋白、atp1a2蛋白、atp1a3蛋白、atp1a4蛋白、atp1a5蛋白、atp2b1蛋白、atp2b2蛋白、atp2b3蛋白、atp2b4蛋白或igsf2蛋白(不含信号肽)至少约70％、至少约75％、至少约80％、至少约85％、至少约90％、至少约95％、至少约96％、至少约97％、至少约98％、至少约99％或约100％同一的氨基酸序列。在一些方面中，bsg蛋白、igsf8蛋白、igsf3蛋白、itgb1蛋白、slc3a2蛋白、itga4蛋白、atp1a1蛋白、atp1a2蛋白、atp1a3蛋白、atp1a4蛋白、atp1a5蛋白、atp2b1蛋白、atp2b2蛋白、atp2b3蛋白、atp2b4蛋白或igsf2蛋白缺乏一个或多个功能性或结构性结构域，诸如igv。
[0645]
其它支架x蛋白的非限制性实例可在2019年2月5日发布的美国专利号us 10,195,290b1中找到，所述专利以引用的方式整体并入，atp转运蛋白：atp1a1、atp1a2、atp1a3、atp1a4、atp1b3、atp2b1、atp2b2和atp2b4)、cd9、cd63、cd81、pdgfr、gpi锚蛋白、乳凝集素、lamp2和lamp2b。
[0646]
在一些方面中，支架x包含basigin(bsg蛋白；seq id no:303)。bsg蛋白也称为5f7、胶原酶刺激因子、细胞外基质金属蛋白酶诱导物(emmprin)、白细胞活化抗原m6、ok血型抗原、肿瘤细胞源性胶原酶刺激因子(tcsf)或cd147。人bsg蛋白的uniprot编号是p35613。bsg蛋白的信号肽是氨基酸1至21。氨基酸138-323是细胞外结构域，氨基酸324至344是跨膜结构域，并且氨基酸345至385是细胞质结构域。
[0647]
在其它方面中，支架x包含与人bsg蛋白的氨基酸22至385至少约70％、至少约75％、至少约80％、至少约85％、至少约90％、至少约95％、至少约96％、至少约97％、至少约98％、至少约99％或约100％同一的氨基酸序列。在一些方面中，basigin多肽的片段缺乏一个或多个功能性或结构性结构域，诸如igv，例如人bsg蛋白的氨基酸221至315。
[0648]
在一些方面中，支架x包含免疫球蛋白超家族成员8(igsf8或igsf8蛋白；seq id no:304)，其也被称为cd81配偶体3、含glu-trp-ile ewi基序的蛋白2(ewi-2)、角质形成细胞相关跨膜蛋白4(kct-4)、lir-d1、前列腺素调控样蛋白(pgrl)或cd316。全长人igsf8蛋白在uniprot中的登录号为q969p0。人igsf8蛋白具有信号肽(人igsf8蛋白的氨基酸1至27)、
细胞外结构域(人igsf8蛋白的氨基酸28至579)、跨膜结构域(人igsf8蛋白的氨基酸580至600)和细胞质结构域(人igsf8蛋白的氨基酸601至613)。
[0649]
在其它方面中，支架x包含与人igsf8蛋白的氨基酸28至613至少约70％、至少约75％、至少约80％、至少约85％、至少约90％、至少约95％、至少约96％、至少约97％、至少约98％、至少约99％或约100％同一的氨基酸序列。在一些方面中，igsf8蛋白缺少一个或多个功能性或结构性结构域，诸如igv。在其它方面中，除1个氨基酸突变、2个氨基酸突变、3个氨基酸突变、4个氨基酸突变、5个氨基酸突变、6个氨基酸突变或7个氨基酸突变外，支架x包含人igsf8蛋白的氨基酸序列。突变可以是取代、插入、缺失或它们的任何组合。在一些方面中，支架x包含人igsf8蛋白的氨基酸序列并且在人igsf8蛋白的n末端和/或c末端包含1个氨基酸、2个氨基酸、3个氨基酸、4个氨基酸、5个氨基酸、6个氨基酸、7个氨基酸、8个氨基酸、9个氨基酸、10个氨基酸、11个氨基酸、12个氨基酸、13个氨基酸、14个氨基酸、15个氨基酸、16个氨基酸、17个氨基酸、18个氨基酸、19个氨基酸、或20个氨基酸或更多个氨基酸。
[0650]
在一些方面中，本公开的支架x包含免疫球蛋白超家族成员3(igsf3或igsf3蛋白；seq id no:309)，其也被称为含glu-trp-ile ewi基序的蛋白3(ewi-3)。人igsf3蛋白具有信号肽(igsf3蛋白的氨基酸1至19)、细胞外结构域(igsf3蛋白的氨基酸20至1124)、跨膜结构域(igsf3蛋白的氨基酸1125至1145)和细胞质结构域(igsf3蛋白的氨基酸1146至1194)。
[0651]
在其它方面中，支架x包含与igsf3蛋白的氨基酸28至613至少约70％、至少约75％、至少约80％、至少约85％、至少约90％、至少约95％、至少约96％、至少约97％、至少约98％、至少约99％或约100％同一的氨基酸序列。在一些方面中，igsf3蛋白缺少一个或多个功能性或结构性结构域，诸如igv。
[0652]
在一些方面中，用于本公开的支架x包含整联蛋白β-1(itgb1蛋白；seq id no:305)(其也被称为纤连蛋白受体亚基β)、糖蛋白iia(gpiia)、vla-4亚基β或cd29。人itgb1蛋白具有信号肽(人itgb1蛋白的氨基酸1至20)、细胞外结构域(人itgb1蛋白的氨基酸21至728)、跨膜结构域(人itgb1蛋白的氨基酸729至751)和细胞质结构域(人itgb1蛋白的氨基酸752至798)。
[0653]
在其它方面中，支架x包含与人itgb1蛋白的氨基酸21至798至少约70％、至少约75％、至少约80％、至少约85％、至少约90％、至少约95％、至少约96％、至少约97％、至少约98％、至少约99％或约100％同一的氨基酸序列。在一些方面中，itgb1蛋白蛋白缺少一个或多个功能性或结构性结构域，诸如igv。
[0654]
在其它方面中，支架x包含itga4蛋白(seq id no:306)，其包含与人itgb1蛋白至少约70％、至少约75％、至少约80％、至少约85％、至少约90％、至少约95％、至少约96％、至少约97％、至少约98％、至少约99％或约100％同一但不含信号肽(人itgb1蛋白的氨基酸1至33)的氨基酸序列。在一些方面中，itga4蛋白缺少一个或多个功能性或结构性结构域，诸如igv。
[0655]
在其它方面中，支架x包含slc3a2蛋白(seq id no:307)，其包含与slc3a2蛋白至少约70％、至少约75％、至少约80％、至少约85％、至少约90％、至少约95％、至少约96％、至少约97％、至少约98％、至少约99％或约100％同一但不含信号肽的氨基酸序列。
[0656]
在一些方面中，slc3a2蛋白缺少一个或多个功能性或结构性结构域，诸如igv。
[0657]
在其它方面中，支架x包含atp1a1蛋白(seq id no:310)，其包含与atp1a1蛋白至
少约70％、至少约75％、至少约80％、至少约85％、至少约90％、至少约95％、至少约96％、至少约97％、至少约98％、至少约99％或约100％同一但不含信号肽的氨基酸序列。
[0658]
在一些方面中，atp1a1蛋白缺少一个或多个功能性或结构性结构域，诸如igv。
[0659]
在其它方面中，支架x包含atp1a2蛋白(seq id no:311)，其包含与atp1a2蛋白至少约70％、至少约75％、至少约80％、至少约85％、至少约90％、至少约95％、至少约96％、至少约97％、至少约98％、至少约99％或约100％同一但不含信号肽的氨基酸序列。
[0660]
在一些方面中，atp1a2蛋白缺少一个或多个功能性或结构性结构域，诸如igv。
[0661]
在其它方面中，支架x包含atp1a3蛋白(seq id no:312)，其包含与atp1a3蛋白至少约70％、至少约75％、至少约80％、至少约85％、至少约90％、至少约95％、至少约96％、至少约97％、至少约98％、至少约99％或约100％同一但不含信号肽的氨基酸序列。
[0662]
在一些方面中，atp1a3蛋白缺少一个或多个功能性或结构性结构域，诸如igv。
[0663]
在其它方面中，支架x包含atp1a4蛋白(seq id no:313)，其包含与atp1a4蛋白至少约70％、至少约75％、至少约80％、至少约85％、至少约90％、至少约95％、至少约96％、至少约97％、至少约98％、至少约99％或约100％同一但不含信号肽的氨基酸序列。
[0664]
在一些方面中，atp1a4蛋白缺少一个或多个功能性或结构性结构域，诸如igv。
[0665]
在其它方面中，支架x包含atp1b3蛋白(seq id no:314)，其包含与atp1a5蛋白至少约70％、至少约75％、至少约80％、至少约85％、至少约90％、至少约95％、至少约96％、至少约97％、至少约98％、至少约99％或约100％同一但不含信号肽的氨基酸序列。
[0666]
在一些方面中，atp1a5蛋白缺少一个或多个功能性或结构性结构域，诸如igv。
[0667]
在其它方面中，支架x包含atp2b1蛋白(seq id no:315)，其包含与atp2b1蛋白至少约70％、至少约75％、至少约80％、至少约85％、至少约90％、至少约95％、至少约96％、至少约97％、至少约98％、至少约99％或约100％同一但不含信号肽的氨基酸序列。
[0668]
在一些方面中，atp2b1蛋白缺少一个或多个功能性或结构性结构域，诸如igv。
[0669]
在其它方面中，支架x包含atp2b2蛋白(seq id no:316)，其包含与atp2b2蛋白至少约70％、至少约75％、至少约80％、至少约85％、至少约90％、至少约95％、至少约96％、至少约97％、至少约98％、至少约99％或约100％同一但不含信号肽的氨基酸序列。
[0670]
在一些方面中，atp2b2蛋白缺少一个或多个功能性或结构性结构域，诸如igv。
[0671]
在其它方面中，支架x包含atp2b3蛋白(seq id no:317)，其包含与atp2b3蛋白至少约70％、至少约75％、至少约80％、至少约85％、至少约90％、至少约95％、至少约96％、至少约97％、至少约98％、至少约99％或约100％同一但不含信号肽的氨基酸序列。
[0672]
在一些方面中，atp2b3蛋白缺少一个或多个功能性或结构性结构域，诸如igv。
[0673]
在其它方面中，支架x包含atp2b4蛋白(seq id no:318)，其包含与atp2b4蛋白至少约70％、至少约75％、至少约80％、至少约85％、至少约90％、至少约95％、至少约96％、至少约97％、至少约98％、至少约99％或约100％同一但不含信号肽的氨基酸序列。在一些方面中，atp2b4蛋白缺少一个或多个功能性或结构性结构域，诸如igv。
[0674]
在其它方面中，支架x包含igsf2蛋白(seq id no:308)，其包含与igsf2蛋白至少约70％、至少约75％、至少约80％、至少约85％、至少约90％、至少约95％、至少约96％、至少约97％、至少约98％、至少约99％或约100％同一但不含信号肽的氨基酸序列。在一些方面中，igsf2蛋白缺少一个或多个功能性或结构性结构域，诸如igv。
[0675]
其它支架x蛋白的非限制性实例可在2019年2月5日发布的美国专利号us10195290b1中找到，所述专利以引用的方式整体并入。
[0676]
在一些方面中，所述序列编码支架部分的片段，所述片段缺少来自天然蛋白质的n末端的至少5、10、50、100、200、300、400、500、600、700或800个氨基酸。在一些方面中，所述序列编码支架部分的片段，所述片段缺少来自天然蛋白质的c末端的至少5、10、50、100、200、300、400、500、600、700或800个氨基酸。在一些方面中，所述序列编码支架部分的片段，所述片段缺少来自天然蛋白质的n末端和c末端的至少5、10、50、100、200、300、400、500、600、700或800个氨基酸。在一些方面中，所述序列编码支架部分的片段，所述片段缺少天然蛋白质的一个或多个功能性或结构性结构域。
[0677]
在一些方面中，支架部分，例如支架x(例如ptgfrn蛋白)与一种或多种异源蛋白连接。一种或多种异源蛋白质可与支架部分的n末端连接。一种或多种异源蛋白质可与支架部分的c末端连接。在一些方面中，一种或多种异源蛋白质与支架部分的n末端和c末端连接。在一些方面中，异源蛋白质是哺乳动物蛋白质。在一些方面中，异源蛋白质是人蛋白质。
[0678]
在一些方面中，支架x可用于将任何部分同时连接至ev(例如，外泌体)的腔表面和外表面。例如，ptgfrn多肽可用于将一种或多种生物活性分子通过马来酰亚胺部分间接连接或直接连接至马来酰亚胺部分或通过接头除了连接至ev(例如，外泌体)的外表面还连接至腔表面。因此，在某些方面中，本文公开的支架x可用于双重目的。
[0679]
在其它方面中，与天然存在的ev(例如，外泌体)相比，本公开的ev(例如，外泌体)包含更高数量的支架x蛋白。在一些方面中，与天然存在的ev(例如，外泌体)相比，本公开的ev(例如，外泌体)包含数量高至少约5倍、至少约10倍、至少约20倍、至少约30倍、至少约40倍、至少约50倍、至少约60倍、至少约70倍、至少约80倍、至少约90倍、至少约100倍、至少约110倍、至少约120倍、至少约130倍、至少约140倍、至少约150倍、至少约160倍、至少约170倍、至少约180倍、至少约190倍、至少约200倍、至少约210倍、至少约220倍、至少约230倍、至少约240倍、至少约250倍、至少约260倍、至少约270倍的支架x(例如，ptgfrn多肽)。本公开的ev(例如,外泌体)上的支架x(例如，ptgfrn多肽)的数量是至少约100、至少约200、至少约300、至少约400、至少约500、至少约600、至少约700、至少约800、至少约900、至少约1000、至少约1100、至少约1200、至少约1300、至少约1400、至少约1500、至少约1600、至少约1700、至少约1800、至少约1900、至少约2000、至少约2100、至少约2200、至少约2300、至少约2400、至少约2500、至少约2600、至少约2700、至少约2800、至少约2900、至少约3000、至少约4000、至少约5000、至少约6000、至少约7000、至少约8000、至少约9000或至少约10000。在一些方面中，本公开的ev(例如，外泌体)上的支架x(例如，ptgfrn多肽)的数量是约100至约100,000、约200至约9000、约300至约9000、约400至约9000、约500至约9000、约600至约8000、约800至约8000、约900至约8000、约1000至约8000、约1100至约8000、约1200至约8000、约1300至约8000、约1400至约8000、约1500至约8000、约1600至约8000、约1700至约8000、约1800至约8000、约1900至约8000、约2000至约8000、约2100至约8000、约2200至约8000、约2300至约8000、约2400至约8000、约2500至约8000、约2600、约2700至约8000、约2800至约8000、约2900至约8000、约3000至约8000、约4000至约8000、约5000至约8000、约6000至约8000、约7000至约8000、约8000、7000至约9000或约6000至约10000。在一些方面中，本公开的ev(例如，外泌体)上的支架x(例如，ptgfrn多肽)的数量是约5000至约8000，例如约5000、约6000、
约7000或约8000。在一些方面中，本公开的ev(例如，外泌体)上的支架x(例如，ptgfrn多肽)的数量是约6000至约8000，例如约6000、约7000或约8000。在一些方面中，本公开的ev(例如，外泌体)上的支架x(例如，ptgfrn多肽)的数量是约4000至约9000，例如约4000、约5000、约6000、约7000、约8000、约9000。
[0680]
在一些方面中，支架x是或包含seq id no:319、320、321、322、323或324的ptgfrn蛋白片段；seq id no:326、327或328的bsg蛋白片段；或seq id no:330、331、332或333的igsf8蛋白片段。在一些方面中，支架x是或包含不含其信号肽的ptgfrn蛋白，即不含其21个n末端氨基酸(mgrlasrplllallslalcrg；seq id no:325)的ptgfrn蛋白或其片段。在一些方面中，支架x是或包含不含其信号肽的bsg蛋白，即不含其18个n末端氨基酸(maaalfvllgfallgthg；seq id no:329)的bsg蛋白或其片段。在一些方面中，支架x是或包含不含其信号肽的igsf8蛋白，即不含其27个n末端氨基酸(mgalrptllppslplllllmlgmgcwa；seq id no:334)的igsf8蛋白或其片段。
[0681]
支架x蛋白及其片段在序列表中公开。
[0682]
ii.d.1.b.支架y
[0683]
在一些方面中，本公开的ev(例如，外泌体)包含不同于天然存在的ev(例如，外泌体)的内部空间的内部空间(即，腔)。例如，可改变ev(例如，外泌体)，使得ev(例如，外泌体)的腔表面上的组成具有与天然存在的ev(例如，外泌体)的蛋白质、脂质或聚糖含量不同的蛋白质、脂质或聚糖含量。
[0684]
在一些方面中，可从用编码支架部分(例如，外泌体蛋白，例如，支架y)或改变外泌体的腔表面的组成或内容物的支架部分的修饰或片段的外源序列转化的细胞产生工程化ev(例如，外泌体)。可在ev(例如，外泌体)的腔表面上表达的ev(例如，外泌体)蛋白质的各种修饰或片段可用于本公开的方面。
[0685]
在一些方面中，可改变ev(例如，外泌体)的腔表面的ev(例如，外泌体)蛋白质包括但不限于marcks蛋白、marcksl1蛋白、basp1蛋白或它们的任何组合。在一些方面中，支架y包含脑酸可溶性蛋白1(basp1蛋白)。basp1蛋白也称为22kda神经元组织富集的酸性蛋白或神经元轴突膜蛋白nap-22。全长人basp1蛋白序列(异构体1)在下文示出。通过选择性剪接产生的异构体缺失来自seq id no:403的basp1蛋白的氨基酸88至141。
[0686]
basp1蛋白(seq id no:403)
[0687][0688]
成熟basp1蛋白序列缺失seq id no:403的第一个met，并且因此含有seq id no:403的氨基酸2至227。
[0689]
在一些方面中，可用于本公开的支架y包含与seq id no:403的氨基酸2至227至少约70％、至少约75％、至少约80％、至少约85％、至少约90％、至少约95％、至少约96％、至少约97％、至少约98％、至少约99％或约100％同一的氨基酸序列。在一些方面中，支架x包含与seq id no:403至少约70％、至少约75％、至少约80％、至少约85％、至少约90％、至少约95％、至少约96％、至少约97％、至少约98％、至少约99％或约100％同一的氨基酸序列。在
其它方面中，除1个氨基酸突变、2个氨基酸突变、3个氨基酸突变、4个氨基酸突变、5个氨基酸突变、6个氨基酸突变或7个氨基酸突变外，可用于本公开的支架y包含seq id no:403的氨基酸序列。突变可以是取代、插入、缺失或它们的任何组合。在一些方面中，可用于本公开的支架y包含seq id no:403的氨基酸序列并且在seq id no:403的n末端和/或c末端包含1个氨基酸、2个氨基酸、3个氨基酸、4个氨基酸、5个氨基酸、6个氨基酸、7个氨基酸、8个氨基酸、9个氨基酸、10个氨基酸、11个氨基酸、12个氨基酸、13个氨基酸、14个氨基酸、15个氨基酸、16个氨基酸、17个氨基酸、18个氨基酸、19个氨基酸或20个氨基酸或更多个氨基酸。
[0690]
在某些方面中，在pct/us2018/061679中公开的seq id no:1-109中的任一个的蛋白质序列足以成为本公开的支架y(例如，连接至接头的支架部分)。
[0691]
在某些方面中，可用于本公开的支架y包含具有mgxklskkk或gxklskkk的肽，其中x是丙氨酸或任何其它氨基酸(seq id no:404)。在一些方面中，ev(例如，外泌体)包含具有序列m)(g)(π)(ξ)(φ/π)(s/a/g/n)(+)(+)或(g)(π)(ξ)(φ/π)(s/a/g/n)(+)(+)的肽，其中每个括号位置代表氨基酸，并且其中π是选自由(pro、gly、ala、ser)组成的组的任何氨基酸，ξ是选自由(asn、gln、ser、thr、asp、glu、lys、his、arg)组成的组的任何氨基酸，φ是选自由(val、ile、leu、phe、trp、tyr、met)组成的组的任何氨基酸，并且(+)是选自由(lys、arg、his)组成的组的任何氨基酸；并且其中位置5不是(+)并且位置6既不是(+)也不是(asp或glu)。在另外的方面中，本文所述的ev(例如，外泌体)(例如，工程化外泌体)包含具有序列(m)(g)(π)(x)(φ/π)(π)(+)(+)或(g)(π)(x)(φ/π)(π)(+)(+)的肽，其中每个括号位置代表氨基酸，并且其中π是选自由(pro、gly、ala、ser)组成的组的任何氨基酸，x是任何氨基酸，φ是选自由(val、ile、leu、phe、trp、tyr、met)组成的组的任何氨基酸，并且(+)是选自由(lys、arg、his)组成的组的任何氨基酸；并且其中位置5不是(+)并且位置6既不是(+)也不是(asp或glu)。关于氨基酸命名法，参见aasland等人,febs letters 513(2002)141-144。
[0692]
在其它方面中，支架y包含与2019年2月5日发布的us10,195,290b1中公开的序列中的任一者至少约70％、至少约75％、至少约80％、至少约85％、至少约90％、至少约95％、至少约96％、至少约97％、至少约98％、至少约99％或约100％同一的氨基酸序列。
[0693]
本文所述的支架y-工程化外泌体可从用pct/us2018/061679中列出的任何序列(seq id no:4-109)转化的细胞产生。
[0694]
在其它方面中，与天然存在的ev(例如，外泌体)相比，本公开的ev(例如，外泌体)包含更高数量的支架y蛋白。在一些方面中，与天然存在的ev(例如，外泌体)相比，本公开的ev(例如，外泌体)包含数量高至少约5倍、至少约10倍、至少约20倍、至少约30倍、至少约40倍、至少约50倍、至少约60倍、至少约70倍、至少约80倍、至少约90倍、至少约100倍、至少约110倍、至少约120倍、至少约130倍、至少约140倍、至少约150倍、至少约160倍、至少约170倍、至少约180倍、至少约190倍、至少约200倍、至少约210倍、至少约220倍、至少约230倍、至少约240倍、至少约250倍、至少约260倍、至少约270倍的支架y(例如，basp-1多肽)。本公开的ev(例如,外泌体)上的支架y(例如，basp-1多肽)的数量是至少约100、至少约200、至少约300、至少约400、至少约500、至少约600、至少约700、至少约800、至少约900、至少约1000、至少约1100、至少约1200、至少约1300、至少约1400、至少约1500、至少约1600、至少约1700、至少约1800、至少约1900、至少约2000、至少约2100、至少约2200、至少约2300、至少约2400、至
少约2500、至少约2600、至少约2700、至少约2800、至少约2900、至少约3000、至少约4000、至少约5000、至少约6000、至少约7000、至少约8000、至少约9000或至少约10000。在一些方面中，本公开的ev(例如，外泌体)上的支架y(例如，basp-1多肽)的数量是约100至约100,000、约200至约9000、约300至约9000、约400至约9000、约500至约9000、约600至约8000、约800至约8000、约900至约8000、约1000至约8000、约1100至约8000、约1200至约8000、约1300至约8000、约1400至约8000、约1500至约8000、约1600至约8000、约1700至约8000、约1800至约8000、约1900至约8000、约2000至约8000、约2100至约8000、约2200至约8000、约2300至约8000、约2400至约8000、约2500至约8000、约2600、约2700至约8000、约2800至约8000、约2900至约8000、约3000至约8000、约4000至约8000、约5000至约8000、约6000至约8000、约7000至约8000、约8000、7000至约9000或约6000至约10000。在一些方面中，本公开的ev(例如，外泌体)上的支架y(例如，basp-1多肽)的数量是约5000至约8000，例如约5000、约6000、约7000或约8000。在一些方面中，本公开的ev(例如，外泌体)上的支架y(例如，basp-1多肽)的数量是约6000至约8000，例如约6000、约7000或约8000。在一些方面中，本公开的ev(例如，外泌体)上的支架y(例如，basp-1多肽)的数量是约4000至约9000，例如约4000、约5000、约6000、约7000、约8000、约9000。
[0695]
在一些方面中，可用于本公开的支架y包含“n末端结构域”(nd)和“效应结构域”(ed)，其中所述nd和/或ed与ev(例如，外泌体)的腔表面缔合。在一些方面中，可用于本公开的支架y包含细胞内结构域、跨膜结构域和细胞外结构域；其中所述细胞内结构域包含“n末端结构域”(nd)和“效应结构域”(ed)；其中所述nd和/或ed与ev(例如，外泌体)的腔表面缔合。如本文所用，术语“与
……
缔合”是指本公开的支架蛋白与ev(例如，和外泌体)的腔表面之间的相互作用，所述相互作用不涉及与膜组分的共价连接。例如，可用于本公开的支架可例如通过脂质锚(例如，肉豆蔻酸)和/或与膜磷脂的带负电荷头部静电相互作用的多元结构域与ev的腔表面缔合。在其它方面中，支架y包含n末端结构域(nd)和效应结构域(ed)，其中所述nd与ev的腔表面缔合，并且所述ed通过离子相互作用与ev的腔表面缔合，其中所述ed包含按顺序的至少两个、至少三个、至少四个、至少五个、至少六个或至少七个连续碱性氨基酸，例如赖氨酸(lys)。
[0696]
在其它方面中，支架y包含n末端结构域(nd)和效应结构域(ed)，其中所述nd与ev的腔表面缔合，并且所述ed通过离子相互作用与ev的腔表面缔合，其中所述ed包含按顺序的至少两个、至少三个、至少四个、至少五个、至少六个或至少七个连续赖氨酸(lys)。
[0697]
在一些方面中，nd通过脂化，例如通过肉豆蔻酰化与ev(例如，外泌体)的腔表面缔合。在一些方面中，nd在n末端具有gly。在一些方面中，n末端gly是肉豆蔻酰化的。
[0698]
在一些方面中，ed通过离子相互作用与ev(例如，外泌体)的腔表面缔合。在一些方面中，ed通过静电相互作用，特别是吸引静电相互作用与ev(例如，外泌体)的腔表面缔合。
[0699]
在一些方面中，ed包含(i)碱性氨基酸(例如，赖氨酸)，或(ii)在多肽序列中彼此相邻的两个或更多个碱性氨基酸(例如，赖氨酸)。在一些方面中，碱性氨基酸是赖氨酸(lys；k)、精氨酸(arg，r)或组氨酸(his，h)。在一些方面中，碱性氨基酸是(lys)n，其中n是介于1与10之间的整数。
[0700]
在其它方面中，如果ed的n末端与nd的c末端的赖氨酸直接连接，即赖氨酸在ed的n末端中并且与nd的c末端中的赖氨酸融合，则ed包含至少一个赖氨酸并且nd在c末端包含赖
氨酸。在其它方面中，当ed的n末端通过接头(例如一个或多个氨基酸)与nd的c末端连接时，ed包含至少两个赖氨酸、至少三个赖氨酸、至少四个赖氨酸、至少五个赖氨酸、至少六个赖氨酸或至少七个赖氨酸。
[0701]
在一些方面中，ed包含k、kk、kkk、kkkk(seq id no:405)、kkkkk(seq id no:406)、r、rr、rrr、rrrr(seq id no:407)、rrrrr(seq id no:408)、kr、rk、kkr、krk、rkk、krr、rrk、(k/r)(k/r)(k/r)(k/r)(seq id no:409)、(k/r)(k/r)(k/r)(k/r)(k/r)(seq id no:410)或它们的任何组合。在一些方面中，ed包含kk、kkk、kkkk(seq id no:405)、kkkkk(seq id no:406)或它们的任何组合。在一些方面中，nd包含如g:x2:x3:x4:x5:x6中列出的氨基酸序列，其中g表示gly；其中“:”表示肽键，其中x2至x6中的每一者独立地表示氨基酸，并且其中x6表示碱性氨基酸。在一些方面中，x6氨基酸选自由以下组成的组：lys、arg和his。在一些方面中，x5氨基酸选自由以下组成的组：pro、gly、ala和ser。在一些方面中，x2氨基酸选自由以下组成的组：pro、gly、ala和ser。在一些方面中，x4选自由以下组成的组：pro、gly、ala、ser、val、ile、leu、phe、trp、tyr、gln和met。
[0702]
在一些方面中，支架y包含n末端结构域(nd)和效应结构域(ed)，其中nd包含如g:x2:x3:x4:x5:x6中列出的氨基酸序列，其中g表示gly；其中“:”表示肽键；其中x2至x6中的每一者独立地是氨基酸；其中x6包含碱性氨基酸，并且其中ed通过肽键与x6连接并且在ed的n末端包含至少一个赖氨酸。
[0703]
在一些方面中，支架y的nd包含氨基酸序列g:x2:x3:x4:x5:x6，其中g表示gly；“:”代表肽键；x2表示选自由以下组成的组的氨基酸：pro、gly、ala和ser；x3表示任何氨基酸；x4表示选自由以下组成的组的氨基酸：pro、gly、ala、ser、val、ile、leu、phe、trp、tyr、gln和met；x5表示选自由以下组成的组的氨基酸：pro、gly、ala和ser；并且x6表示选自由以下组成的组的氨基酸：lys、arg和his。
[0704]
在一些方面中，x3氨基酸选自由以下组成的组：asn、gln、ser、thr、asp、glu、lys、his和arg。
[0705]
在一些方面中，nd和ed通过接头连接。在一些方面中，接头包含一个或多个氨基酸。在一些方面中，术语“接头”是指肽或多肽序列(例如，合成肽或多肽序列)或非多肽，例如烷基链。在一些方面中，可将两个或更多个接头串联连接。一般来说，接头提供了灵活性或防止/改善了空间位阻。接头通常不被裂解；然而，在某些方面中，这种裂解可以是合乎需要的。因此，在一些方面中，接头可包含一个或多个蛋白酶可裂解位点，其可位于接头序列内或在接头序列的任一端侧接所述接头。当nd和ed通过接头连接时，ed包含至少两个赖氨酸、至少三个赖氨酸、至少四个赖氨酸、至少五个赖氨酸、至少六个赖氨酸或至少七个赖氨酸。
[0706]
在一些方面中，接头是肽接头。在一些方面中，肽接头可包含至少约2、至少约3、至少约4、至少约5、至少约10、至少约15、至少约20、至少约25、至少约30、至少约35、至少约40、至少约45、至少约50、至少约55、至少约60、至少约65、至少约70、至少约75、至少约80、至少约85、至少约90、至少约95或至少约100个氨基酸。
[0707]
在一些方面中，接头是甘氨酸/丝氨酸接头。在一些方面中，肽接头是根据式[(gly)n-ser]m的甘氨酸/丝氨酸接头，其中n是1至100的任何整数并且m是1至100的任何整数。在其它方面中，甘氨酸/丝氨酸接头是根据式[(gly)x-sery]z，其中x是1至4的整数，y是
0或1，并且z是1至50的整数。在一些方面中，肽接头包含序列gn，其中n可以是1至100的整数。在一些方面中，肽接头可包含序列(glyala)n，其中n是介于1与100之间的整数。在其它方面中，肽接头可包含序列(glyglyser)n，其中n是介于1与100之间的整数。
[0708]
在一些方面中，肽接头是合成的，即非天然存在的。在一个方面中，肽接头包含肽(或多肽)(例如，天然或非天然存在的肽)，所述肽包含将第一线性氨基酸序列与第二线性氨基酸序列连接或遗传融合，所述第一线性氨基酸序列在自然界中与所述第二线性氨基酸序列不是天然连接或遗传融合的。例如，在一个方面中，肽接头可包含非天然存在的多肽，所述多肽是天然存在的多肽的经修饰形式(例如，包含突变诸如添加、取代或缺失)。
[0709]
在其它方面中，肽接头可包含非天然存在的氨基酸。在其它方面中，肽接头可包括在自然界中不存在的线性序列中存在的天然存在的氨基酸。在其它方面中，肽接头可包含天然存在的多肽序列。
[0710]
在一些方面中，支架y包含nd—ed，其中：nd包含g:x2:x3:x4:x5:x6；其中：g表示gly；“:”表示肽键；x2表示选自由以下组成的组的氨基酸：pro、gly、ala和ser；x3表示任何氨基酸；x4表示选自由以下组成的组的氨基酸：pro、gly、ala、ser、val、ile、leu、phe、trp、tyr、glu和met；x5表示选自由以下组成的组的氨基酸：pro、gly、ala和ser；x6表示选自由以下组成的组的氨基酸：lys、arg和his；“—”表示任选的接头；并且ed是包含(i)至少两个连续赖氨酸(lys)的效应结构域，其通过肽键或一个或多个氨基酸与x6连接；或(ii)至少一个赖氨酸的效应结构域，其通过肽键直接连接至x6。
[0711]
在一些方面中，x2氨基酸选自由以下组成的组：gly和ala。在一些方面中，x3氨基酸是lys。在一些方面中，x4氨基酸是leu或glu。在一些方面中，x5氨基酸选自由以下组成的组：ser和ala。在一些方面中，x6氨基酸是lys。在一些方面中，x2氨基酸是gly、ala或ser；x3氨基酸是lys或glu；x4氨基酸是leu、phe、ser或glu；x5氨基酸是ser或ala；并且x6氨基酸是lys。在一些方面中，“—”接头包含肽键或一个或多个氨基酸。
[0712]
在一些方面中，支架蛋白中的ed包含lys(k)、kk、kkk、kkkk(seq id no:405)、kkkkk(seq id no:406)、arg(r)、rr、rrr、rrrr(seq id no:407)、rrrrr(seq id no:408)、kr、rk、kkr、krk、rkk、krr、rrk、(k/r)(k/r)(k/r)(k/r)(seq id no:409)、(k/r)(k/r)(k/r)(k/r)(k/r)(seq id no:410)或它们的任何组合。
[0713]
在一些方面中，支架y包含选自由以下组成的组的氨基酸序列：(i)ggklskk(seq id no:411)、(ii)gaklskk(seq id no:412)、(iii)ggkqskk(seq id no:413)、(iv)ggklakk(seq id no:414)或(v)它们的任何组合。
[0714]
在一些方面中，支架y中的nd包含选自由以下组成的组的氨基酸序列：(i)ggklsk(seq id no:415)、(ii)gaklsk(seq id no:416)、(iii)ggkqsk(seq id no:417)、(iv)ggklak(seq id no:418)或(v)它们的任何组合，并且支架蛋白中的ed包含(i)k、kk、kkk、kkkg(seq id no:419)、kkkgy(seq id no:420)、kkkgyn(seq id no:421)、kkkgynv(seq id no:422)、kkkgynvn(seq id no:423)、kkkgys(seq id no:424)、kkkgyg(seq id no:425)、kkkgygg(seq id no:426)、kkkgs(seq id no:427)、kkkgsg(seq id no:428)、kkkgsgs(seq id no:429)、kkks(seq id no:430)、kkksg(seq id no:431)、kkksgg(seq id no:432)、kkksggs(seq id no:433)、kkksggsg(seq id no:434)、kksggsgg(seq id no:435)、kkksggsggs(seq id no:436)、krfsfkks(seq id no:437)。
[0715]
在一些方面中，可用于本公开的支架y的多肽序列由选自由以下组成的组的氨基酸序列组成：(i)ggklskk(seq id no:411)、(ii)gaklskk(seq id no:412)、(iii)ggkqskk(seq id no:413)、(iv)ggklakk(seq id no:414)或(v)它们的任何组合。
[0716]
在一些方面中，支架y包含选自由以下组成的组的氨基酸序列：(i)ggklskkk(seq id no:438)、(ii)ggklskks(seq id no:439)、(iii)gaklskkk(seq id no:440)、(iv)gaklskks(seq id no:441)、(v)ggkqskkk(seq id no:442)、(vi)ggkqskks(seq id no:443)、(vii)ggklakkk(seq id no:444)、(viii)ggklakks(seq id no:445)和(ix)它们的任何组合。
[0717]
在一些方面中，可用于本公开的支架y的多肽序列由选自由以下组成的组的氨基酸序列组成：(i)ggklskkk(seq id no:438)、(ii)ggklskks(seq id no:439)、(iii)gaklskkk(seq id no:440)、(iv)gaklskks(seq id no:441)、(v)ggkqskkk(seq id no:442)、(vi)ggkqskks(seq id no:443)、(vii)ggklakkk(seq id no:444)、(viii)ggklakks(seq id no:445)和(ix)它们的任何组合。
[0718]
在一些方面中，支架y的长度是至少约8、至少约9、至少约10、至少约11、至少约12、至少约13、至少约14、至少约15、至少约16、至少约17、至少约18、至少约19、至少约20、至少约21、至少约22、至少约23、至少约24、至少约25、至少约26、至少约27、至少约28、至少约29、至少约30、至少31、至少约32、至少约33、至少约34、至少约35、至少约36、至少约37、至少约38、至少约39、至少约39、至少约40、至少约41、至少约42、至少约43、至少约44、至少约50、至少约46、至少约47、至少约48、至少约49、至少约50、至少约55、至少约60、至少约65、至少约70、至少约75、至少约80、至少85、至少约90、至少约95、至少约100、至少约105、至少约110、至少约115、至少约120、至少约125、至少约130、至少约135、至少约140、至少约145、至少约150、至少约155、至少约160、至少约165、至少约170、至少约175、至少约180、至少约185、至少约190、至少约195、至少约200、至少约205、至少约210、至少约215、至少约220、至少约225、至少约230、至少约235、至少约240、至少约245、至少约250、至少约255、至少约260、至少约265、至少约270、至少约275、至少约280、至少约285、至少约290、至少约295、至少约300、至少约305、至少约310、至少约315、至少约320、至少约325、至少约330、至少约335、至少约340、至少约345或至少约350个氨基酸。
[0719]
在一些方面中，支架y的长度介于约5与约10、介于约10与约20、介于约20与约30、介于约30与约40、介于约40与约50、介于约50与约60、介于约60与约70、介于约70与约80、介于约80与约90、介于约90与约100、介于约100与约110、介于约110与约120、介于约120与约130、介于约130与约140、介于约140与约150、介于约150与约160、介于约160与约170、介于约170与约180、介于约180与约190、介于约190与约200、介于约200与约210、介于约210与约220、介于约220与约230、介于约230与约240、介于约240与约250、介于约250与约260、介于约260与约270、介于约270与约280、介于约280与约290、介于约290与约300、介于约300与约310、介于约310与约320、介于约320与约330、介于约330与约340或介于约340与约250个氨基酸之间。
[0720]
在一些方面中，支架y包含(i)ggklskkkkgynvn(seq id no:446)、(ii)gaklskkkkgynvn(seq id no:447)、(iii)ggkqskkkkgynvn(seq id no:448)、(iv)ggklakkkkgynvn(seq id no:449)、(v)ggklskkkkgysgg(seq id no:450)、(vi)
ggklskkkkgsggs(seq id no:451)、(vii)ggklskkkksggsg(seq id no:452)、(viii)ggklskkksggsgg(seq id no:453)、(ix)ggklskksggsggs(seq id no:454)、(x)ggklsksggsggsv(seq id no:455)或(xi)gakkskkrfsfkks(seq id no:456)。
[0721]
在一些方面中，可用于本公开的支架y的多肽序列由以下组成：(i)ggklskkkkgynvn(seq id no:446)、(ii)gaklskkkkgynvn(seq id no:447)、(iii)ggkqskkkkgynvn(seq idno:448)、(iv)ggklakkkkgynvn(seq id no:449)、(v)ggklskkkkgysgg(seq id no:450)、(vi)ggklskkkkgsggs(seq id no:451)、(vii)ggklskkkksggsg(seq id no:452)、(viii)ggklskkksggsgg(seq id no:453)、(ix)ggklskksggsggs(seq id no:454)、(x)ggklsksggsggsv(seq id no:455)或(xi)gakkskkrfsfkks(seq id no:465)。
[0722]
下文列出了可用于本公开的支架y的非限制性实例。在一些方面中，支架y包含seq id no:457至567中列出的氨基酸序列。在一些方面中，支架y由seq id no:457至567中列出的氨基酸序列组成。
[0723]
在一些方面中，可用于本公开的支架y不包含n末端met。在一些方面中，支架y在支架蛋白的n末端包含脂化氨基酸，例如肉豆蔻酰化氨基酸，其用作脂质锚。在一些方面中，支架蛋白n末端的氨基酸残基是gly。n末端gly的存在是n-肉豆蔻酰化的绝对要求。在一些方面中，支架蛋白n末端的氨基酸残基是合成的。在一些方面中，支架蛋白n末端的氨基酸残基是甘氨酸类似物，例如烯丙基甘氨酸、丁基甘氨酸或炔丙基甘氨酸。
[0724]
在其它方面中，脂质锚可以是本领域已知的任何脂质锚，例如棕榈酸或糖基磷脂酰肌醇。在不寻常的情况下，例如，通过使用限制肉豆蔻酸的培养基，一些其它脂肪酸(包括短链和不饱和脂肪酸)可连接至n末端甘氨酸。例如，据报告，在bk通道中，肉豆蔻酸通过羟基酯键联在翻译后连接至内部丝氨酸/苏氨酸或酪氨酸残基。本领域已知的膜锚在下表中呈现。
[0725][0726]
iii.制备方法
[0727]
本发明的ev(例如，外泌体)可通过化学合成、重组dna技术、较大分子的生物化学或酶促片段化、上述的组合或通过任何其它方法来产生。在一个方面中，本公开提供了一种将生物活性分子与ev(例如，外泌体)缀合的方法。所述方法包括通过如上所述的马来酰亚胺部分将生物活性分子连接至ev(例如，外泌体)。
[0728]
除了胺反应性化合物外，具有与巯基(-sh)形成键的化学基团的那些是用于蛋白质和其它生物缀合物技术的最常见交联剂和修饰剂。巯基，也称为硫醇，存在于半胱氨酸(cys，c)氨基酸侧链中的蛋白质中。半胱氨酸巯基对通常通过多肽链内或多肽链之间的二硫键(-s-s-)连接，作为天然三级或四级蛋白质结构的基础。通常，只有游离或还原的巯基(-sh)[而不是二硫键中的硫原子]可用于与硫醇反应性化合物反应。
[0729]
巯基是用于蛋白质缀合和标记的有用靶标。首先，巯基存在于大多数蛋白质中，但不如伯胺多；因此，通过巯基交联更具选择性和精确性。其次，蛋白质中的巯基通常参与二硫键，因此在这些位点交联通常不会显著改变潜在蛋白质结构或阻断结合位点。第三，可用(即，游离)巯基的数量可很容易地控制或修改；它们可通过还原天然二硫键生成，或者它们可通过使用巯基加成试剂(诸如2-亚氨基硫杂环戊烷(特劳特试剂)、sata、satp或sat(peg))与伯胺反应而引入分子中。最后，将巯基反应性基团与胺反应性基团结合以制备异双功能交联剂提供更大的灵活性和对交联程序的控制。例如，使用含有马来酰亚胺基团和nhs酯的3-马来酰亚胺基-丙酸nhs酯，nhs酯可用于标记蛋白质的伯胺(-nh2)、胺修饰的寡核苷酸和其它含胺分子。马来酰亚胺基团将与硫醇基团反应而形成共价键，从而使生物分子与硫醇连接。
[0730]
当反应混合物的ph介于6.5与7.5之间时，马来酰亚胺基团与巯基特异性地反应；
结果是形成不可逆的稳定硫醚键联(即，所述键不能用还原剂裂解)。在更碱性的条件下(ph》8.5)，所述反应有利于伯胺，并且还增加了马来酰亚胺基团水解为非反应性马来酰胺酸的速率。马来酰亚胺不与酪氨酸、组氨酸或甲硫氨酸反应。
[0731]
必须从与马来酰亚胺一起使用的反应缓冲剂中排除含硫醇的化合物，如二硫苏糖醇(dtt)和β-巯基乙醇(bme)，因为它们将竞争偶联位点。例如，如果使用dtt来还原蛋白质中的二硫化物以使巯基可用于缀合，则必须在开始马来酰亚胺反应之前使用脱盐柱彻底除去dtt。令人感兴趣地，二硫化物还原剂tcep不含硫醇，并且不必在涉及马来酰亚胺试剂的反应之前除去。
[0732]
过量的马来酰亚胺可在反应结束时通过添加游离硫醇来淬灭。edta可包含在偶联缓冲剂中以螯合杂散的二价金属，所述杂散的二价金属否则会促进巯基的氧化(非反应性)。
[0733]
在一个方面中，连接包括用还原剂处理ev(例如，外泌体)。合适的还原剂包括例如tcep(三(2-羧乙基)膦)、dtt(二硫苏糖醇)、bme(2-巯基乙醇)、硫醇化剂以及它们的任何组合。硫醇化剂可包括例如特劳特试剂(2-亚氨基硫杂环戊烷)。
[0734]
在用还原剂处理之后，连接反应进一步包括使还原的ev(例如，外泌体)与马来酰亚胺部分接触。在一个方面中，马来酰亚胺部分在连接至ev(例如，外泌体)之前连接至生物活性分子。在一些方面中，马来酰亚胺部分进一步连接至接头以将马来酰亚胺部分连接至生物活性分子。因此，在一些方面中，一个或多个接头或间隔子插入在马来酰亚胺部分与生物活性分子之间。
[0735]
在一些方面中，本文公开的ev(例如，外泌体)可从体外生长的细胞或受试者的体液中产生。当由体外细胞培养物产生外泌体时，可使用各种生产细胞，例如hek293细胞、cho细胞和msc。在某些方面中，生产细胞是hek293细胞。在一些方面中，生产细胞不是树突细胞、巨噬细胞、b细胞、肥大细胞、嗜中性粒细胞、kupffer-browicz细胞、源自这些细胞中的任一者的细胞或它们的任何组合。
[0736]
人胚肾293细胞，通常也称为hek 293、hek-293、293细胞，或者不太准确地称为hek细胞，是最初来源于在组织培养物中生长的人胚肾细胞的特定细胞系。
[0737]
hek 293细胞是1973年在荷兰莱顿的alex van der eb实验室通过用剪切的腺病毒5dna转染正常人胚胎肾细胞培养物而产生的。培养细胞并用腺病毒转染。随后的分析表明，所述转化是通过从病毒基因组的左臂插入约4.5千碱基来实现的，其被整合至人染色体19中。
[0738]
对hek293和五种衍生细胞系的基因组和转录组的综合研究将hek 293转录组与人肾脏、肾上腺、垂体和中枢神经组织的基因组和转录组进行了比较。hek 293模式与肾上腺细胞最相似，肾上腺细胞具有许多神经元特性。
[0739]
hek 293细胞具有复杂的核型，每个染色体有两个或更多个拷贝，并且染色体模式数为64。它们被描述为亚三倍体，含有的染色体数量少于单倍体人配子的三倍。染色体异常包括x染色体的总计三个拷贝的以及染色体17和染色体22的四个拷贝。
[0740]
可用于产生ev的hek293细胞的变体包括但不限于hek 293f、hek 293ft和hek 293t。
[0741]
iv.治疗用途
[0742]
本公开提供了治疗有需要的受试者的疾病或疾患的方法，所述方法包括向所述受试者施用包含本公开的ev(例如，外泌体)的组合物。本公开还提供了预防或改善有需要的受试者的疾病或疾患的症状的方法，所述方法包括向所述受试者施用包含本公开的ev(例如，外泌体)的组合物。还提供了诊断有需要的受试者的疾病或疾患的方法，所述方法包括向所述受试者施用包含本公开的ev(例如，外泌体)的组合物。
[0743]
在一个方面中，疾病或病症是癌症、炎症性疾病、神经变性病症、中枢神经疾病或代谢疾病。
[0744]
本公开还提供了预防和/或治疗有需要的受试者的疾病或病症的方法，所述方法包括向所述受试者施用本文公开的ev(例如，外泌体)。在一些方面中，可用本发明方法治疗的疾病或病症包括癌症、移植物抗宿主病(gvhd)、自身免疫性疾病、感染性疾病或纤维化疾病。在一些方面中，治疗是预防性的。在其它方面中，用于本公开的ev(例如，外泌体)用于诱导免疫反应。在其它方面中，用于本公开的ev(例如，外泌体)用于对受试者进行疫苗接种。
[0745]
在一些方面中，疾病或疾患是癌症。当施用于患有癌症的受试者时，在某些方面中，本公开的ev(例如，外泌体)可上调免疫反应并增强受试者免疫系统的肿瘤靶向。在一些方面中，所治疗的癌症的特征在于白细胞(t细胞、b细胞、巨噬细胞、树突细胞、单核细胞)浸润至肿瘤微环境中，或所谓的“热肿瘤(hot tumor)”或“炎性肿瘤(inflammatory tumor)”。在一些方面中，所治疗的癌症的特征在于低水平或不可检测的水平的白细胞浸润至肿瘤微环境中，或所谓的“冷肿瘤(cold tumor)”或“非炎性肿瘤”。在一些方面中，以足以将“冷肿瘤”转化为“热肿瘤”的量和持续时间施用ev(例如，外泌体)，即，所述施用导致白细胞(诸如t细胞)浸润至肿瘤微环境中。在某些方面中，癌症包括膀胱癌、宫颈癌、肾细胞癌、睾丸癌、结肠直肠癌、肺癌、头颈癌和卵巢癌、淋巴瘤、肝癌、成胶质细胞瘤、黑素瘤、骨髓瘤、白血病、胰腺癌或它们的组合。在其它，术语“远端肿瘤(distal tumor)”或“远处肿瘤(distant tumor)”是指从原始(或原发)肿瘤扩散至远处器官或远处组织例如淋巴结的肿瘤。在一些方面中，本公开的ev(例如，外泌体)治疗转移扩散后的肿瘤。
[0746]
在一些方面中，疾病或病症是移植物抗宿主病(gvhd)。在一些方面中，可用本公开治疗的疾病或病症是自身免疫性疾病。自身免疫性疾病的非限制性实例包括：多发性硬化症、外周神经炎、斯耶格伦综合征(sjogren's syndrome)、类风湿性关节炎、脱发、自身免疫性胰腺炎、白塞氏病(behcet's disease)、大疱性类天疱疮、乳糜泻、德维克氏病(devic's disease)(视神经脊髓炎)、肾小球肾炎、iga肾病、混杂血管炎、硬皮病、糖尿病、动脉炎、白癜风、溃疡性结肠炎、肠易激综合征、银屑病、葡萄膜炎、系统性红斑狼疮以及它们的组合。
[0747]
在一些方面中，疾病或病症是感染性疾病。在某些方面中，疾病或病症是致癌病毒。在一些方面中，可用本公开治疗的感染性疾病包括但不限于人γ疱疹病毒4(爱泼斯坦巴尔病毒)、甲型流感病毒、乙型流感病毒、巨细胞病毒、金黄色葡萄球菌、结核分枝杆菌、沙眼衣原体、hiv-1、hiv-2、冠状病毒(例如，mers-cov和sars cov)、丝状病毒(例如，马尔堡病毒和埃博拉病毒)、酿脓链球菌、肺炎链球菌、疟原虫种类(例如，间日疟原虫和恶性疟原虫)、chikunga病毒、人乳头瘤病毒(hpv)、乙型肝炎、丙型肝炎、人疱疹病毒8、单纯疱疹病毒2(hsv2)、克雷伯氏菌属、铜绿假单胞菌、肠球菌属、变形杆菌属、肠杆菌属、放线杆菌属、凝固酶-阴性葡萄球菌(cons)、支原体属或它们的组合。
[0748]
在一些方面中，将ev(例如，外泌体)静脉内施用于受试者的循环系统。在一些方面
中，将ev(例如，外泌体)输注在合适的液体中并且施用至受试者的静脉中。
[0749]
在一些方面中，将ev(例如，外泌体)动脉内施用于受试者的循环系统。在一些方面中，将ev(例如，外泌体)输注在合适的液体中并且施用至受试者的动脉中。
[0750]
在一些方面中，通过鞘内施用将ev(例如，外泌体)施用于受试者。在一些方面中，将ev(例如，外泌体)经由注射剂施用至椎管中，或施用至蛛网膜下腔中以使其到达脑脊液(csf)。
[0751]
在一些方面中，将ev(例如，外泌体)瘤内施用至受试者的一个或多个肿瘤中。
[0752]
在一些方面中，通过鼻内施用将ev(例如，外泌体)施用于受试者。在一些方面中，可以局部施用或全身性施用的形式经由鼻吹入ev(例如，外泌体)。在某些方面中，ev(例如，外泌体)作为鼻喷雾剂施用。
[0753]
在一些方面中，通过腹膜内施用将ev(例如，外泌体)施用于受试者。在一些方面中，将ev(例如，外泌体)输注在合适的液体中并且注射至受试者的腹膜中。在一些方面中，腹膜内施用使得ev(例如，外泌体)分布至淋巴管。在一些方面中，腹膜内施用使得ev(例如，外泌体)分布至胸腺、脾脏和/或骨髓。在一些方面中，腹膜内施用使得ev(例如，外泌体)分布至一个或多个淋巴结。在一些方面中，腹膜内施用使得ev(例如，外泌体)分布至颈部淋巴结、腹股淋巴结、纵隔淋巴结或胸骨淋巴结中的一者或多者。在一些方面中，腹膜内施用使得ev(例如，外泌体)分布至胰腺。
[0754]
在一些方面中，通过眼周施用将ev(例如，外泌体)施用于受试者。在一些方面中，将ev(例如，外泌体)注射至眼周组织中。眼周药物施用包括结膜下、前房眼球筋膜囊下、后房眼球筋膜囊下和眼球后施用途径。
[0755]
v.药物组合物和施用方法
[0756]
本公开还提供了包含本文所述的ev(例如，外泌体)的药物组合物，所述药物组合物适合施用于受试者。药物组合物通常包含呈适合施用于受试者的形式的多个ev(例如，外泌体)，所述多个ev包含通过马来酰亚胺部分与所述多个ev(例如，外泌体)共价连接的生物活性分子；以及药学上可接受的赋形剂或载体。药学上可接受的赋形剂或载体部分地由所施用的特定组合物以及由用于施用组合物的特定方法决定。因此，存在很多种合适的药物组合物制剂，所述药物组合物制剂包含多个ev(例如，外泌体)。(参见例如，remington's pharmaceutical sciences,mack publishing co.,easton,pa.第18版(1990))。药物组合物通常被配制为无菌并且完全遵循美国食品与药品管理局的所有良好生产规范(gmp)条例。在一些方面中，药物组合物包含一种或多种化学化合物，诸如例如与本文所述的ev(例如，外泌体)共价连接的小分子。
[0757]
在一些方面中，药物组合物包含一种或多种治疗剂和本文所述的ev(例如，外泌体)。在某些方面中，ev(例如，外泌体)与一种或多种另外的治疗剂在药学上可接受的载体中共同施用。在一些方面中，包含ev(例如，外泌体)的药物组合物在施用另外的治疗剂之前施用。在其它方面中，包含ev(例如，外泌体)的药物组合物在施用另外的治疗剂之后施用。在另外的方面中，包含ev(例如，外泌体)的药物组合物与另外的治疗剂同时施用。
[0758]
本文提供了呈适合施用于受试者的形式的药物组合物，所述药物组合物包含具有所需纯度的本公开的ev(例如，外泌体)和药学上可接受的载体或赋形剂。药学上可接受的赋形剂或载体可部分地由所施用的特定组合物以及由用于施用组合物的特定方法决定。因
此，存在多种多样的包含多个细胞外囊泡的药物组合物的合适制剂。(参见例如，remington's pharmaceutical sciences,mack publishing co.,easton,pa.第21版(2005))。药物组合物通常被配制为无菌并且完全遵循美国食品与药品管理局的所有良好生产规范(gmp)条例。
[0759]
在一些方面中，药物组合物包含一种或多种治疗剂和本文所述的ev(例如，外泌体)。在某些方面中，ev(例如，外泌体)与一种或多种另外的治疗剂在药学上可接受的载体中共同施用。在一些方面中，包含ev(例如，外泌体)的药物组合物在施用另外的治疗剂之前施用。在其它方面中，包含ev(例如，外泌体)的药物组合物在施用另外的治疗剂之后施用。在另外的方面中，包含ev(例如，外泌体)的药物组合物与另外的治疗剂同时施用。
[0760]
可接受的载体、赋形剂或稳定剂在采用的剂量和浓度下对接受者(例如，动物或人)是无毒的，并且包括缓冲液如磷酸盐、柠檬酸盐和其它有机酸；抗氧化剂，包括抗坏血酸和甲硫氨酸；防腐剂(如十八烷基二甲基苄基氯化铵；氯化六烃季铵；苯扎氯铵；苄索氯铵；苯酚、丁醇或苄醇；对羟基苯甲酸烷基酯如对羟基苯甲酸甲酯或对羟基苯甲酸丙酯；儿茶酚；间苯二酚；环己醇；3-戊醇；和间甲酚)；低分子量(小于约10个残基)的多肽；蛋白质如血清白蛋白、明胶或免疫球蛋白；亲水性聚合物如聚乙烯吡咯烷酮；氨基酸如甘氨酸、谷氨酰胺、天冬酰胺、组氨酸、精氨酸或赖氨酸；单糖、二糖和其它碳水化合物(包括葡萄糖、甘露糖或糊精)；螯合剂如edta；糖类如蔗糖、甘露醇、海藻糖或山梨糖醇；成盐抗衡离子如钠；金属络合物(例如zn-蛋白质络合物)；和/或非离子型表面活性剂如tween
tm
、pluronics
tm
或聚乙二醇(peg)。
[0761]
载体或稀释剂的实例包括但不限于水、盐水、林格氏溶液、右旋糖溶液和5％人血清白蛋白。此类介质和化合物用于药物活性物质的用途在本领域中众所周知。除非任何常规介质或化合物与本文所述的细胞外囊泡不相容，否则考虑其在组合物中的使用。还可将补充治疗剂掺入组合物中。通常，将药物组合物配制成可与其预期施用途径相容。本公开的ev(例如，外泌体)可通过胃肠外、局部、静脉内、经口、皮下、动脉内、皮内、经皮、经直肠、颅内、腹膜内、鼻内、瘤内、肌内途径施用或以吸入剂形式施用。在某些方面中，静脉内施用(例如，通过注射)包含ev(例如，外泌体)的药物组合物。ev(例如，外泌体)可任选地与在治疗所述ev(例如，外泌体)所要治疗的疾病、病症或疾患方面至少部分有效的其它治疗剂组合施用。
[0762]
溶液或悬浮液可包含以下组分：诸如水、盐水溶液、固定油、聚乙二醇、甘油、丙二醇或其它合成溶剂的无菌稀释剂；诸如苄醇或对羟基苯甲酸甲酯的抗菌化合物；诸如抗坏血酸或亚硫酸氢钠的抗氧化剂；诸如乙二胺四乙酸(edta)的螯合化合物；诸如乙酸酯、柠檬酸酯或磷酸酯的缓冲剂；以及诸如氯化钠或右旋糖的用于调整张力的化合物。可用诸如盐酸或氢氧化钠的酸或碱来调节ph。制剂可封闭在安瓿、一次性注射器或由玻璃或塑料制成的多剂量小瓶中。
[0763]
适用于可注射用途的药物组合物包括无菌水溶液(如果是水溶性)或分散液和无菌粉末。对于静脉内施用，合适的载体包括生理盐水、抑菌水、cremophor el
tm
(basf,parsippany,n.j.)或磷酸盐缓冲盐水(pbs)。组合物通常是无菌的并且具有达到容易注射的程度的流动性。载体可以是含有例如水、乙醇、多元醇(例如甘油、丙二醇和液体聚乙二醇等)以及它们的合适混合物的溶剂或分散介质。可例如通过使用诸如卵磷脂的包衣、通过在
分散液的情况下维持所需粒度以及通过使用表面活性剂来维持适当的流动性。微生物作用的预防可通过各种抗菌和抗真菌化合物(例如，对羟基苯甲酸酯、氯丁醇、苯酚、抗坏血酸、硫柳汞等)来实现。如果需要，可向组合物中添加等渗化合物，例如，糖、多元醇如甘露醇、山梨糖醇和氯化钠。可注射组合物的延长吸收可通过在组合物中包含延迟吸收的化合物(例如，单硬脂酸铝和明胶)来实现。
[0764]
根据需要，可通过将有效量的本公开的ev(例如，外泌体)在合适的溶剂中与本文列举的成分之一或其组合混合来制备无菌注射溶液。一般来说，通过将ev(例如，外泌体)并入含有基础分散介质和任何所需其它成分的无菌媒介物中来制备分散体。在用于制备无菌注射溶液的无菌粉末的情况下，制备方法是真空干燥和冷冻干燥，此举产生活性成分加来自其前述无菌过滤溶液的任何另外所需成分的粉末。可将ev(例如，外泌体)以贮库注射或植入制剂的形式施用，所述制剂可以允许ev(例如，外泌体)的持续或脉冲释放的方式配制。
[0765]
包含本公开的ev(例如，外泌体)的组合物的全身施用也可通过经粘膜方式进行。对于经粘膜施用，在制剂中使用适合于待渗透的障壁的渗透剂。此类渗透剂在本领域中通常是已知的，并且对于经粘膜施用，包括例如清洁剂、胆汁盐和梭链孢酸衍生物。经粘膜施用可通过使用例如鼻喷剂来实现。
[0766]
在某些方面中，将本公开的包含ev(例如，外泌体)的药物组合物静脉内施用于将从药物组合物受益的受试者中。在某些其它方面中，例如通过淋巴管内注射或通过结节内注射(参见例如，senti等人,pnas 105(46):17908(2008))或通过肌内注射、通过皮下施用、通过瘤内注射、通过直接注射至胸腺中或至肝脏中来将组合物施用至淋巴系统。
[0767]
在某些方面中，包含本公开的ev(例如，外泌体)的药物组合物以液体悬浮液形式施用。在某些方面中，药物组合物以能够在施用后形成贮库的制剂的形式施用。在某些优选的方面中，贮库将ev(例如，外泌体)缓慢地释放至循环中，或保持呈贮库形式。
[0768]
通常，药学上可接受的组合物被高度纯化为不含污染物，具有生物相容性并且不具有毒性，并且适合于向受试者施用。如果水是载体的成分，则水经高度纯化并且被加工为不含例如内毒素的污染物。
[0769]
药学上可接受的载体可以是乳糖、右旋糖、蔗糖、山梨糖醇、甘露糖醇、淀粉、阿拉伯树胶、磷酸钙、藻酸盐、明胶、硅酸钙、微晶纤维素、聚乙烯吡咯啶酮、纤维素、水、糖浆、甲基纤维素、苯甲酸甲基羟酯、苯甲酸丙基羟酯、滑石、硬脂酸镁和/或矿物油，但不限于此。药物组合物还可包含润滑剂、润湿剂、甜味剂、香味增强剂、乳化剂、悬浮剂和/或防腐剂。
[0770]
本文所述的药物组合物包含本文所述的ev(例如，外泌体)和任选的药物活性剂或治疗剂。治疗剂可以是生物剂、小分子剂或核酸剂。
[0771]
提供了包含药物组合物的剂型，所述药物组合物包含本文所述的ev(例如，外泌体)。在一些方面中，剂型被配制为液体悬浮液以用于静脉内注射。在一些方面中，剂型被配制为液体悬浮液以用于瘤内注射。
[0772]
在某些方面中，使本公开的ev(例如，外泌体)的制剂经受例如x射线、γ射线、β粒子、α粒子、中子、质子、元素核、uv射线的放射以便损坏残余具有复制能力的核酸。
[0773]
在某些方面中，使用超过1、5、10、15、20、25、30、35、40、50、60、70、80、90、100或超过100kgy的照射剂量使本公开的ev(例如，外泌体)的制剂经受γ照射。
[0774]
在某些方面中，使用超过0.1、0.5、1、5、10、15、20、25、30、35、40、50、60、70、80、90、
100、200、300、400、500、600、700、800、900、1000、2000、3000、4000、5000、6000、7000、8000、9000、10000或的照射剂量使本公开的ev(例如，外泌体)的制剂经受x射线照射。
[0775]
本公开的ev(例如，外泌体)可与其它药物同时使用。具体而言，本发明的ev(例如，外泌体)可与诸如激素治疗剂、化学治疗剂、免疫治疗剂、抑制细胞生长因子或细胞生长因子受体作用的药物等的药物一起使用。
[0776]
vi.药盒
[0777]
本公开还提供了包括本公开的一个或多个ev(例如，外泌体)和任选的使用说明书的药盒或制造产品。在一些方面中，药盒或制造产品含有本文所述的药物组合物，所述药物组合物包含本公开的至少一个ev(例如，外泌体)；和使用说明书。在一些方面中，药盒或制造产品包括在一个或多个容器中的本公开的至少一个ev(例如，外泌体)或包含所述ev(例如，外泌体)的药物组合物。本领域技术人员将容易地认识到，本公开的ev(例如，外泌体)、包含本公开的ev(例如，外泌体)的药物组合物或它们的组合可容易地并入至本领域熟知的已确定的药盒形式中的一种中。
[0778]
在一些方面中，药盒或制造产品包括ev(例如，外泌体)、一种或多种生物活性分子、通过马来酰亚胺部分将所述一种或多种生物活性分子共价连接至所述ev(例如，外泌体)的试剂或它们的任何组合，以及进行反应以通过马来酰亚胺部分将所述一种或多种生物活性分子共价连接至所述ev(例如，外泌体)的说明书。
[0779]
在一些方面中，药盒包括通过马来酰亚胺部分将生物活性分子与ev(例如，外泌体)缀合的试剂，以及进行缀合的说明书。
[0780]
除非另外指出，否则本公开的实践将采用细胞生物学、细胞培养、分子生物学、转基因生物学、微生物学、重组dna以及免疫学的常规技术，所述技术处于本领域的技能之内。此类技术在文献中进行了充分解释。参见例如，sambrook等人,编辑(1989)molecular cloning a laboratory manual(第2版；cold spring harbor laboratory press)；sambrook等人,编辑(1992)molecular cloning:a laboratory manual,(cold springs harbor laboratory,ny)；d.n.glover编辑,(1985)dna cloning,第i和ii卷；gait,编辑(1984)oligonucleotide synthesis；mullis等人美国专利号4,683,195；hames和higgins,编辑(1984)nucleic acid hybridization；hames和higgins,编辑(1984)transcription and translation；freshney(1987)culture of animal cells(alan r.liss,inc.)；immobilized cells and enzymes(irl press)(1986)；perbal(1984)a practical guide to molecular cloning；the treatise,methods in enzymology(academic press,inc.,n.y.)；miller和calos编辑(1987)gene transfer vectors for mammalian cells,(cold spring harbor laboratory)；wu等人,编辑,methods in enzymology,第154和155卷；mayer和walker,编辑(1987)immunochemical methods in cell and molecular biology(academic press,london)；weir和blackwell,编辑,(1986)handbook of experimental immunology,第i-iv卷；manipulating the mouse embryo,cold spring harbor laboratory press,cold spring harbor,n.y.,(1986)；)；crooke,antisense drug technology:principles,strategies and applications,第2版crc press(2007)；以及ausubel等人(1989)current protocols in molecular biology(john wiley and sons,baltimore,md.)。
[0781]
以上引用的所有参考文献，以及本文引用的所有参考文献以引用的方式整体并入本文。
[0782]
通过说明而不是通过限制的方式提供以下实例。
[0783]
实施例
[0784]
以下实施例仅出于说明的目的而提供，并且不应被解释为以任何方式限制本发明的范围或内容。除非另有说明，否则本发明的实践将采用本领域技术范围内的蛋白质化学、生物化学、重组dna技术和药理学的常规方法。此类技术在文献中有充分的解释。参见例如，t.e.creighton,proteins:structures and molecular properties(w.h.freeman and company,1993)；green和sambrook等人，molecular cloning:a laboratory manual，第4版(cold spring harbor laboratory press,2012)；colowick和kaplan,methods in enzymology(academic press)；remington:the science and practice of pharmacy，第22版(pharmaceutical press,2012)；sundberg和carey,advanced organic chemistry:a和b部分，第5版(springer,2007)。
[0785]
实施例1
[0786]
为了产生本文所述的外泌体，将使用人胚肾(hek)细胞系(hek293sf)。细胞将用与目标剂(例如抗原、佐剂或免疫调节剂)连接的支架x和/或支架y稳定转染。例如，可通过用cd40l-gfp ptgfrn融合分子转染hek293sf细胞来产生表达cd40l的外泌体，所述融合分子以单体或强制三聚体形式表达。
[0787]
在转染后，hek293sf细胞将在化学成分确定的培养基中生长至高密度持续7天。然后将收集条件细胞培养基，并在室温下以300
–
800xg离心5分钟，以除去细胞和大碎片。将用1000u/l补充培养基上清液，并在37℃下在水浴中孵育1小时。将收集上清液，并在4℃下以16,000xg离心30分钟，以除去残留的细胞碎片和其它大的污染物。上清液然后将以133,900xg于4℃超速离心3小时，以沉淀出外泌体。将弃去上清液，并且将从管底部吸取任何残留的培养基。沉淀将重悬于200
–
1000μl pbs(-ca-mg)中。
[0788]
为了进一步富集外泌体群体，将通过密度梯度纯化(蔗糖或optiprep
tm
)加工沉淀。
[0789]
梯度将在4℃下以200,000xg在置于sw 41 ti转子中的12ml ultra-clear(344059)管中旋转16小时，以分离外泌体级分。
[0790]
然后将从顶层轻轻取出外泌体层，并将其在38.5ml ultra-clear(344058)管中稀释于约32.5ml pbs中，并在4℃下以133,900xg再次超速离心3小时，以沉淀纯化的外泌体。所得沉淀将重悬于最小体积的pbs(约200μl)中，并在4℃下储存。
[0791]
对于optiprep
tm
梯度，将在用于sw 41 ti转子的12ml ultra-clear(344059)管中，用等体积的10％、30％和45％optiprep
tm
制备3层无菌梯度。沉淀将添加至optiprep
tm
梯度中，并在4℃下以200,000xg超速离心16小时，以分离外泌体级分。然后将从管的顶部约3ml轻轻收集外泌体层。
[0792]
外泌体级分将在38.5ml ultra-clear(344058)管中稀释于约32ml pbs中，并在4℃下以133,900xg超速离心3小时，以沉淀出纯化的外泌体。成团外泌体然后将重悬于最小体积的pbs(约200μl)中并且储存在4℃下直到准备使用。
[0793]
实施例2
[0794]
kras mrna和/或kras蛋白减少的体外分析
[0795]
本文公开的示例性aso被设计为特异性地靶向编码具有g12d突变的kras蛋白的kras转录物。参见图1f。靶向本文公开的任何其它靶基因(例如，nlrp3、stat6、cebp/β、stat3或nras)的aso也可用于类似方法。将测试所公开的aso在报告细胞系中敲低kras mrna和/或kras蛋白表达的能力，所述报告细胞系在海肾荧光素酶上游含有人kras mrna的野生型(wt)或g12d等位基因。为了控制总体细胞毒性，细胞系还将含有萤火虫荧光素酶。kras特异性sirna将用作阳性对照。
[0796]
简言之，表达wt或g12d突变体kras蛋白的报告细胞系将在细胞培养基中生长并接种到96孔板上。然后，将用包含本文公开的一种或多种aso的不同浓度的ev(例如，外泌体)(“ev-aso”)处理细胞。ev-aso处理后大约3天，将收获细胞并且将从细胞中纯化rna和/或蛋白质。然后，将使用诸如qpcr和蛋白质印迹的测定来定量细胞中的kras mrna和/或kras蛋白表达水平。
[0797]
实施例3
[0798]
kras mrna/kras蛋白减少的体内分析
[0799]
为了评估包含本文公开的一种或多种aso的ev(例如，外泌体)在体内降低kras mrna和/或kras蛋白水平的效力，将使用肿瘤小鼠模型。靶向本文公开的任何其它靶基因(例如，nlrp3、stat6、cebp/β、stat3或nras)的aso也可用于类似方法。本文公开的aso将以各种给药方案施用于肿瘤小鼠。将定期监测小鼠的肿瘤生长。将最终处死小鼠，并且将评估各种细胞中的kras mrna和/或kras蛋白水平。
[0800]
实施例4
[0801]
nlrp3 mrna和/或nlrp3蛋白减少的体外分析
[0802]
本文公开的示例性aso被设计为特异性地靶向nlrp3转录物。参见图1a。将测试所公开的aso在报告细胞系中敲低nlrp3 mrna和/或nlrp3蛋白表达的能力，所述报告细胞系在报告基因上游含有人nlrp3编码序列。nlrp3特异性sirna将用作阳性对照。
[0803]
简言之，表达nlrp3的报告细胞系将在细胞培养基中生长并接种到96孔板上。然后，将用包含本文公开的一种或多种aso的不同浓度的ev(例如，外泌体)(“ev-aso”)处理细胞。在本公开的其它地方提供了用于产生此类ev的方法。ev-aso处理后大约3天，将收获细胞并且将从细胞中纯化rna和/或蛋白质。然后，将使用诸如qpcr和蛋白质印迹的测定来定量细胞中的nlrp3 mrna和/或nlrp3蛋白表达水平。
[0804]
实施例5
[0805]
nlrp3 aso设计
[0806]
小鼠和人aso旨在靶向nlrp3(基因id号114548)表达。使用人nlrp3的参考序列nm_004895和小鼠nlrp3的参考序列nm_145827.4选择靶序列。通过在新生转录物的整个长度上耕种aso，对于每种基因生成可能的aso列表。产生了长度为15、16、17、18、19或20个核碱基的aso。
[0807]
aso基于以下性质进行优先级排序：必须命中所有剪接形式；低自二聚化能量(中靶活性)；无gggg基序(seq id no:598)(可导致合成问题)；寡核苷酸中少于3个cpg二核苷酸(潜在免疫刺激)；少于8个碱基的回文序列(潜在二聚化和免疫刺激)；在对任何基因的脱靶命中中超过2个错配且不超过17个连续碱基，包括已知的mirna和lncrna，以及新生和成熟转录物；不与重复序列重叠；并且与一般群体中大于或等于0.01maf的snp没有重叠。另外
的标准包括预测的物种交叉反应性(例如，人、食蟹猴、恒河猴、大鼠、小鼠转录物)；以及在成熟转录物中小于或等于3个错配(mm)、在lnc转录物中小于或等于3个mm、在mirna中小于或等于3个mm以及在新生转录物中小于或等于3个mm的脱靶(ot)过滤器。
[0808]
实施例6
[0809]
nlrp3 mrna/nlrp3蛋白减少的体内分析
[0810]
为了评估包含本文公开的一种或多种aso的ev(例如，外泌体)在体内降低nlrp3 mrna和/或nlrp3蛋白水平的效力，将使用纤维化小鼠模型。本文公开的aso将以各种给药方案施用于小鼠。将监测小鼠的纤维化症状。将最终处死小鼠，并且将评估各种细胞中的nlrp3 mrna和/或nlrp3蛋白水平。
[0811]
实施例7
[0812]
人原代单核细胞和巨噬细胞中的功能测定
[0813]
nlrp3途径的活化诱导人单核细胞和巨噬细胞产生il-1β。nlrp3途径的活化可通过用200ng/ml lps引发3小时，然后与5mm atp一起孵育过夜来实现，如使用从人全血中分离的单核细胞以及使用单核细胞在m-csf中成熟6天的m0巨噬细胞所证明。il-1β产生的诱导可通过用游离药物处理的mcc950和ic50值抑制(图2a-2b)。使用alphalisa测定来测定il-1β浓度。
[0814]
与活化nlrp3途径后人细胞的il-1β产生相似，小鼠骨髓源性巨噬细胞也产生il-1β，这可通过用200ng/ml lps引发3小时、然后与5mm atp一起孵育3小时来实现(图2c)。
[0815]
实施例8
[0816]
体内腹膜炎模型
[0817]
腹膜内lps激发诱导小鼠中产生il-1β，其可在激发后3小时在体循环中检测到。lps激发小鼠的血清中il-1β的诱导可通过在激发前1小时用腹膜内施用的mcc950进行预处理来抑制(图3a-3b)。
[0818]
实施例9
[0819]
mrna和/或蛋白质减少的体外分析
[0820]
本文公开的示例性aso被设计为特异性地靶向stat6转录物(图1b)或cebp/β转录物(图1c)。将测试所公开的aso在报告细胞系中敲低stat6或cebp/βmrna和/或stat6或cebp/β蛋白表达的能力，所述报告细胞系在报告基因上游含有人stat6或cebp/β编码序列。stat6或cebp/β特异性sirna将用作阳性对照。
[0821]
简言之，表达stat6或cebp/β的报告细胞系将在细胞培养基中生长并接种到96孔板上。然后，将用包含本文公开的一种或多种aso的不同浓度的ev(例如，外泌体)(“ev-aso”)处理细胞。在本公开的其它地方提供了用于产生此类ev的方法。ev-aso处理后大约3天，将收获细胞并且将从细胞中纯化rna和/或蛋白质。然后，将使用诸如qpcr和蛋白质印迹的测定来定量细胞中的stat6或cebp/βmrna和/或stat6或cebp/β蛋白表达水平。
[0822]
首先将通过使用基于可变转录物交叉反应性、物种交叉反应性、对目标基因的特异性、aso内snp的存在、aso的长度、位置多样性、毒性基序和预测的结合亲和力的计算机选择来选择先导aso。接下来，将针对在用靶序列(stat6或cebp/βmrna)转染的细胞系中敲低(在2nm下至少50％，并且在20nm下小于20％gapdh敲低)靶基因表达的能力筛选aso。然后将测定aso在来自至少两个供体的原代巨噬细胞中的靶基因敲低效力。还将观察管家基因表
达稳定性、序列位置的多样性以及处理后预测的脱靶的表达。在原代巨噬细胞中具有最高重编程活性(基因表达变化、细胞因子产生、t细胞抑制)的最佳aso将被选择作为先导aso。
[0823]
实施例10
[0824]
aso设计
[0825]
小鼠和人aso旨在靶向stat6(基因id号6778)或cebp/β(基因id号1051)表达。使用人stat6的参考序列nm_001178078.2和小鼠stat6的参考序列nm_009284.2选择靶stat6序列。使用人cebp/β的参考序列nm_001285878.1和小鼠cebp/β的参考序列nm_009883.4选择靶cebp/β序列。通过在新生转录物的整个长度上耕种aso，对于每种基因生成可能的aso列表。产生了长度为15、16、17、18、19或20个核碱基的aso。
[0826]
aso基于以下性质进行优先级排序：必须命中所有剪接形式；低自二聚化能量(中靶活性)；无gggg基序(可导致合成问题)；寡核苷酸中少于3个cpg二核苷酸(潜在免疫刺激)；少于8个碱基的回文序列(潜在二聚化和免疫刺激)；在对任何基因的脱靶命中中超过2个错配且不超过17个连续碱基，包括已知的mirna和lncrna，以及新生和成熟转录物；不与重复序列重叠；并且与一般群体中大于或等于0.01maf的snp没有重叠。另外的标准包括预测的物种交叉反应性(例如，人、食蟹猴、恒河猴、大鼠、小鼠转录物)；以及在成熟转录物中小于或等于3个错配(mm)、在lnc转录物中小于或等于3个mm、在mirna中小于或等于3个mm以及在新生转录物中小于或等于3个mm的脱靶(ot)过滤器。
[0827]
实施例11
[0828]
aso负载在外泌体上
[0829]
用单剂量的负载有报告基因aso的2e11外泌体(“exo aso”)或单剂量的游离报告基因aso(“游离aso”)对小鼠进行静脉内处理。施用后一小时，如相对于游离aso的定位通过mfi所证明，在血液中的cd11b
+
树突细胞、单核细胞和mmdsc(图4a)；肝脏中的库普弗细胞(图4b)；脾脏中的红髓macs、单核细胞和mmdsc(图4c)；以及肿瘤组织中的树突细胞和mmdsc(图4d)中观察到exo aso摄取增加。与游离aso和阴性对照的摄取(图4g-4j)相比，exo aso的摄取在骨髓中也较高(图4e-4f)。
[0830]
实施例12
[0831]
exo-stat6-aso和exo-cebp/β-aso能够使m2巨噬细胞复极化
[0832]
将原代人巨噬细胞用il4/il10/tgfβ处理极化，并用递增浓度的exo-stat6-aso或exo-cebp/β-aso处理。用exo-stat6-aso或exo-cebp/β-aso体外处理原代人巨噬细胞分别诱导stat6(图5a)或cebp/β(图5c)的剂量依赖性敲低，以及m2巨噬细胞基因cd163的下调(图5b和5d)。与游离aso相比，发现使用exo-aso的效力略高。此外，在用exo-stat6-aso或exo-cebp/β-aso处理后，各种m2基因被下调，并且各种m1基因被上调(图6a-6j)。
[0833]
实施例13
[0834]
cd11b细胞中的exo-stat6-aso和exo-cebp/β-aso靶基因敲低。
[0835]
在体内，exo-stat6-aso和exo-cebp/β-aso的主要受体细胞是cd11b细胞。为了进一步测量exo-aso的摄取和敲低效率，将小鼠用exo-stat6-aso或exo-cebp/β-aso进行处理并处死。然后分离并富集cd11b
+
细胞(图7a-7f)。尽管不是终点，但相对于用乱序exo-aso对照处理的小鼠，在exo-stat6-aso处理的小鼠和exo-cebp/β-aso处理的小鼠中肿瘤体积显著更低，并且与用stat6游离aso处理的小鼠相比，用exo-stat6-aso或exo-cebp/β-aso处理
的小鼠倾向于具有更小的肿瘤(图7g)。在用exo-stat6-aso(图8a)或exo-cebp/β-aso(图8b)处理后，在cd11b富集的细胞中，exo-aso靶基因敲低比非富集细胞中更明显。此外，与非富集细胞相比，两种exo-aso在cd11b富集的细胞中更有效地降低arg1表达(图8c)。
[0836]
用exo-stat6-aso或exo-cebp/β-aso处理的cd11b富集的细胞也显示出巨噬细胞重编程，如通过各种m1基因的上调和各种m2基因的下调所证明(图9a-9v)。
[0837]
实施例14
[0838]
使用exo-stat6-aso和/或exo-cebp/β-aso治疗纤维化。
[0839]
过度m2巨噬细胞活化导致tgfβ和生长因子的持续产生，所述tgfβ和生长因子促进肌成纤维细胞的增殖、emt/endomt的活化和细胞外基质沉积。m2巨噬细胞代表伤口愈合与促纤维化过程恶化之间的转折点。为了测试exo-stat6-aso或exo-cebp/β-aso是否能够用于治疗受试者的纤维化，用il-13/tgfβ处理使原代人m2巨噬细胞极化，其是纤维化的驱动因素。然后将细胞暴露于递增浓度的游离stat6 aso(图10a和10c)、游离cebp/βaso(图10b和10d)、exo-stat6-aso(图10a和10c)或exo-cebp/β-aso(图10b和10d)；并且测定靶基因(stat6，图10a；cebp/β，图10b)的表达或tgfβ1(图10c-10d)的表达。
[0840]
为了测试使用鼻内施用在体内递送exo-aso的可行性，将6周龄小鼠用博莱霉素处理以诱导肺纤维化。两周后，将小鼠鼻内施用exo-aso-cy5，并且在施用后4小时处死小鼠。相对于施用了exo-aso-cy5的初次接受试验的小鼠(“in
ꢀ”
)和相对于施用了pbs阴性对照(
“‑
c”)初次接受试验和处理的小鼠，施用了exo-aso-cy5的博莱霉素诱导的小鼠显示cy5的总通量增加(图11)。
[0841]
在正常肺和诱导的肺纤维化肺组织两者中，肺巨噬细胞和肺毛细血管内皮细胞均观察到外泌体摄取(图12a-12h和13a-13h)。
[0842]
实施例15
[0843]
使用exo-stat6-aso和/或exo-cebp/β-aso治疗肝癌小鼠模型。
[0844]
hepa1-6小鼠将用于测试exo-stat6-aso和exo-cebp/β-aso用于治疗肿瘤的体内功效。hepa1-6系是肝癌的原位小鼠模型。从cro获得样品并通过原位杂交分析stat6和cebp/β的表达(图14a-14f和15a-15f)。
[0845]
实施例16
[0846]
stat3 mrna表达分析
[0847]
测试了本公开的aso在il-6刺激的panc-1细胞中降低stat3mrna表达的能力。将panc-1细胞在细胞培养基中生长并以20,000个细胞/孔的密度接种到96孔板上。aso在两个不同群组中进行了测试：分别以20nm和2nm的最终浓度向panc-1细胞给予2个剂量或5个剂量(参见表3)。所述测定使用lipofectamine2000转染和48小时处理周期，在37℃和5％co2下孵育。然后使用分支dna测定对mrna表达进行分析。
[0848]
表3
[0849][0850][0851]
实施例17
[0852]
nras mrna表达的分析
[0853]
测试了本公开的aso降低hek-293细胞中的nras mrna表达的能力。将hek-293细胞在细胞培养基中生长并以20,000个细胞/孔的密度接种到96孔板上。aso在两个单独群组中进行测试：分别以20nm和2nm的最终浓度向hek-293细胞给予2个剂量或5个剂量(参见表4、5和6)。所述测定使用lipofectamine2000转染和48小时处理周期，在37℃和5％co2下孵育。然后使用分支dna测定对mrna表达进行分析。例如，seq id no:201已显示98.45％的nras表达抑制(表6)。
[0854]
表4
[0855][0856][0857]
表5
[0858][0859][0860]
表6
[0861][0862]
实施例18
[0863]
外泌体的构建
[0864]
为了产生本文所述的外泌体，将使用人胚肾(hek)细胞系(例如，hek293sf)。细胞将用与目标剂(例如抗原、佐剂或免疫调节剂)连接的支架x、支架y和/或锚定部分稳定转染。例如，可通过用cd40l-gfp ptgfrn融合分子转染hek293sf细胞来产生表达cd40l的外泌体，所述融合分子以单体或强制三聚体形式表达。
[0865]
在转染后，hek细胞将在化学成分确定的培养基中生长至高密度持续7天。然后将收集条件细胞培养基，并在室温下以300
–
800xg离心5分钟，以除去细胞和大碎片。将用1000u/l补充培养基上清液，并在37℃下在水浴中孵育1小时。将收集上清液，并在4℃下以16,000xg离心30分钟，以除去残留的细胞碎片和其它大的污染物。上清液然后将以133,900xg于4℃超速离心3小时，以沉淀出外泌体。将弃去上清液，并且将从管底部吸取任何残留的培养基。沉淀将重悬于200
–
1000μl pbs(-ca-mg)中。
[0866]
为了进一步富集外泌体群体，将通过密度梯度纯化(蔗糖或optiprep
tm
)加工沉淀。
[0867]
梯度将在4℃下以200,000xg在置于sw 41 ti转子中的12ml ultra-clear(344059)管中旋转16小时，以分离外泌体级分。
[0868]
然后将从顶层轻轻取出外泌体层，并将其在38.5ml ultra-clear(344058)管中稀释于约32.5ml pbs中，并在4℃下以133,900xg再次超速离心3小时，以沉淀纯化的外泌体。所得沉淀将重悬于最小体积的pbs(约200μl)中，并在4℃下储存。
[0869]
对于optiprep
tm
梯度，将在用于sw 41 ti转子的12ml ultra-clear(344059)管中，用等体积的10％、30％和45％optiprep
tm
制备3层无菌梯度。沉淀将添加至optiprep
tm
梯度中，并在4℃下以200,000xg超速离心16小时，以分离外泌体级分。然后将从管的顶部约3ml轻轻收集外泌体层。
[0870]
外泌体级分将在38.5ml ultra-clear(344058)管中稀释于约32ml pbs中，并在4℃下以133,900xg超速离心3小时，以沉淀出纯化的外泌体。成团外泌体然后将重悬于最小体积的pbs(约200μl)中并且储存在4℃下直到准备使用。
[0871]
实施例19
[0872]
aso接头结构对工程化或天然外泌体的效力和负载量的影响
[0873]
评估了aso接头结构对工程化或天然外泌体中负载的aso的量的影响，以及aso接头结构对aso效力的影响。
[0874]
在工程外泌体中评估了与不同接头缀合的固定aso序列的负载有效性。在hek293细胞中产生过表达ptgfrn的外泌体并进行纯化。通过混合将aso有效载荷负载到外泌体表面上。因此，将浓度为1x10
13 p/ml的外泌体与100um aso以1:1混合，其中萤火虫荧光素酶(ffluc)的序列已与不同的接头结构缀合。负载效率被计算为与外泌体偶联的起始aso的百分比。图25示出所用构建体的结构。构建体c1至c9使用胆固醇-c6脂质锚。构建体t1至t9使用胆固醇-teg脂质锚。构建体l1使用生育酚-c8脂质锚，而构建体l2和l3使用生育酚棕榈酸酯-c6脂质锚。图25中指示的其它接头组分是：磷酸二酯(po)、硫代磷酸酯(ps)、六亚甲基(c6)、三亚甲基(c3)、三甘醇(teg)和六甘醇(heg)。结果表明，每个工程化外泌体所负载的aso分子的量受接头结构影响(图25)。一般来说，具有胆固醇-c6锚的构建体的负载效率高于具有胆固醇-teg锚的构建体。对于具有生育酚-c8脂质锚的构建体，观察到最高负载效率，68.78％，对应于每个外泌体4,167aso单位的负载。
[0875]
使用工程外泌体在图25中评估的与不同接头缀合的相同固定aso序列的负载效率也使用天然外泌体进行了评估。天然外泌体在hek293细胞中产生并纯化。将浓度为1x10
13 p/ml的外泌体与100um aso以1:1混合，其中萤火虫荧光素酶的序列已与不同的接头结构缀合。负载效率被计算为与外泌体偶联的起始aso的百分比。与在工程化外泌体情况下一样，每个天然外泌体所负载的aso分子的量受接头结构影响(图26)。再次，具有胆固醇-c6脂质锚的构建体显示出比具有胆固醇-teg脂质锚的构建体更高的负载效率。观察到构建体c2和c3(93.6％和90.67％)的负载效率超过90％，分别对应于每个外泌体5,616和5,440aso单位。因此，天然外泌体的最大负载效率和每个外泌体的aso数量显著高于工程化外泌体。
[0876]
还评估了负载到天然外泌体上的构建体的活性。天然外泌体在hek293细胞中产生并纯化。将浓度为1x10
13
的外泌体与100um aso以1:1混合，其中萤火虫荧光素酶的序列与不同的接头缀合(参见图25和26)。在表达萤火虫和海肾荧光素酶的h1299细胞中评估了exoaso构建体的体外效力。通过与细胞孵育后剩余的发光量来测量效力。使用t6(加框)作为参考，将数据针对如用ribogreen测量的每个样品aso的量归一化。c1-c9构建体(图27a)和t1-t9构建体(图27c)的效力高于l1-l3构建体(图27b)。
[0877]
***
[0878]
应当理解，意图使用具体实施方式部分而非发明内容以及摘要部分来对权利要求进行解释。发明内容和摘要部分可阐明如发明人所构想的本公开的一个或多个但非所有的
示例性方面，并且因此，并不意图通过任何方式对本公开和所附权利要求书进行限制。
[0879]
本公开已经在上文中借助于说明特定功能的实施及其关系的功能性结构单元进行了描述。为了方便描述，本文已对这些功能构建块的边界进行任意界定。也可限定替代边界，只要指定功能及其相互关系被适当地执行。
[0880]
具体方面的前述描述将充分地揭示本公开的一般特性，以使得其它人通过应用本领域中的知识，在无过度实验且不背离本公开的一般概念的情况下，可容易地针对各种应用对此类具体方面进行修改和/或改变。因此，基于本文呈现的教义和指导，此类改变和修改意图在所公开方面的等效物的含义和范围内。应了解，本文的措辞或术语是出于描述而非限制的目的，以使得本说明书的术语或措辞应由熟练的技术人员根据教义和指导进行解释。
[0881]
本公开的广度和范围不应受任何上述示例性方面限制，而应仅根据以下权利要求及其等效物定义。
[0882]
可在整篇本技术中引用的所有引用参考文献(包括参考文献、专利、专利申请和网站)的内容据此出于任何目的以引用的方式明确整体并入本文，所述参考文献中引用的参考文献也是如此。