用于恢复或增加组织灌注的组合物和方法

用于恢复或增加组织灌注的组合物和方法
1.关于美国联邦资助的研究或开发的声明
2.本发明是在美国政府支持下由陆军部/mrmc授予的拨款号w81xwh-16-2-0040完成的。美国政府对本发明享有一定的权利。
技术领域
3.本发明总体上涉及包含高分子量聚合物试剂和低分子量聚合物试剂的组合物，该聚合物试剂可用于恢复或增加向缺血组织中微循环的氧气输送。


背景技术：

4.用全血或血液制品对创伤和休克患者进行复苏被认为是液体复苏的金标准。然而，在休克期间存在某些细胞和组织损伤机制会严重限制用于使休克患者复苏的任何溶液的有效性。虽然与乳酸林格溶液等其他iv溶液相比，全血可能是最佳选择，但它也因缺血组织再灌注时发生的无复流现象而严重不利。
5.为了减轻和逆转休克的代谢作用，需要改进的组合物和方法来减轻这种组织损伤机制，使全血容易地通过重要器官和组织中的毛细血管网络，从而发生所需的氧气转移。


技术实现要素：

6.本公开提供了一种安全且惰性(inert)的溶液，其用于例如在医院或急诊科中对创伤或休克患者进行复苏。该溶液极大地改善了向患者组织的氧气传输，改善了复苏后的结果，并提高了患者的生存率。当在输血之前施用该溶液时，它会减少输血所需的血液量。
7.本公开的一个方面提供了一种组合物，其包含浓度为5-20％w/v、分子量为18,000-100,000da的聚乙二醇聚合物(peg)；浓度为1-30％w/v、分子量为1,000-10,000da的peg；和水，其中，所述分子量为18,000-100,000da的peg和所述分子量为1,000-10,000da的peg溶解或分散在所述水中。在一些实施方案中，组合物的总体积为1000ml以下，例如100-1000ml。在一些实施例中，总体积范围为136-680ml。
8.在一些实施方案中，该组合物包含浓度为10％w/v、分子量为20,000da的peg。在一些实施方案中，该组合物包含浓度为15％w/v、分子量为1,000da的peg。在一些实施方案中，水是去离子水。在一些实施方案中，该组合物还包含氯化钠、乳酸钠、氯化钾、氯化钙和氯化镁中的一种或多种。
9.本公开的另一方面提供了一种静脉输液产品，其包括配置用于静脉内输送流体的袋子和袋子内的如本文所述的组合物。
10.本公开的另一方面提供了一种用于在有需要的受试者中恢复或增加局部或整体组织灌注的方法，包括向受试者施用治疗有效量的本文所述的组合物。在一些实施方案中，该组合物是静脉内施用的。在一些实施方案中，受试者因心源性休克或非心源性休克而遭受整体或局部组织灌注减少。
11.在一些实施方案中，该方法包括同时或相继施用细胞氧载体溶液或非细胞氧载体
溶液的步骤。在一些实施方案中，非细胞氧载体溶液是基于血红蛋白的氧载体(hboc)。在一些实施方案中，细胞氧载体溶液是全血或浓缩(packed)红细胞。在一些实施方案中，施用的细胞氧载体溶液的量是在没有该组合物的情况下需要的预估血量的50％以下。在一些实施方案中，细胞氧载体溶液或非细胞氧载体溶液在施用该组合物的12小时内施用。
附图说明
12.图1a-b.(a)休克期间渗透水运动和代谢细胞肿胀的图示；(b)内皮细胞的代谢细胞肿胀和相关的毛细血管压缩的图示。
13.图2.导致等渗水非能量转移出细胞并进入毛细管的渗透梯度图示。
14.图3a-c.(a)lvr时间；(b)终末乳糖酶；和(c)各种lvr溶液施用后的终末map。
15.图4.致死性休克啮齿动物模型中的剂量反应数据。
16.图5.将10％的peg-20k添加到人全血后的红细胞沉降。
17.图6a-c.描述小分子peg聚合物对较大聚合物(a)peg-20k、(b)peg-35k和(c)peg-100k增强的全血中esr沉降率的影响的westergren esr检测数据。
18.图7.根据本公开的一些实施方案的静脉输注产品。
具体实施方式
19.本公开的实施方案提供了恢复或增加向缺血组织中微循环的氧气输送的溶液。缺血可能由非心源性(例如低血量、阻塞性、脓毒性、过敏性或神经源性)休克或心源性休克引起。本文所述的组合物靶向一种新的作用机制，该作用机制是在缺血期间和再灌注复苏后发生的组织灌注不良的主要原因，特别是代谢细胞肿胀和继发性微循环压迫。
20.休克期间发生的细胞缺血导致基底外侧质膜中运行na/k atp酶所需的atp浓度损失。这会导致钠泵减慢，导致钠进入细胞增加，随后渗透水运动导致代谢细胞肿胀(图1a)。随着组织中的实质细胞膨胀，向组织提供氧气的微循环会压迫并减慢或停止毛细血管流动和氧气的对流转移。同样，内皮细胞的代谢肿胀会降低毛细血管腔的直径，从而进一步限制流量(图1b)。这可以通过在细胞外的空间加载细胞不渗透物来防止或逆转，这些细胞不渗透物是惰性分子，可以逃离毛细血管空间但不能进入细胞。它们在细胞外积聚，渗透性地阻止或逆转水的内向运动，从而防止组织水肿并为微循环减压。即使在低容量状态下，这也会导致有效的毛细血管灌注和氧气向组织中的转移。
21.分子量约为18,000-100,000da的聚乙二醇(peg)聚合物最有效，因为有两个现象：1)它们是具有部分渗透特性的非渗透分子，2)它们具有高度亲水性并能吸引水分子。示踪剂研究表明，peg-20k分子的渗透反射系数(σd)约为0.5，这意味着对于每2个停留在毛细管空间中的peg-20k分子，就有1个分子离开并进入间隙空间。没有分子会进入细胞内，因为它是不渗透的。这会产生渗透梯度，以建立等渗水从细胞出来并进入毛细管的非能量转移(参见图2)。这种水转移促进了毛细管床的减压，从而降低了流动阻力，同时为毛细管重新装载了体积以增强流动的驱动压力。peg聚合物具有极强的亲水性，并强烈地吸引分子周围的水壳。这使水仅通过渗透梯度进入变得更为有效。
22.在休克、创伤、危重疾病和组织损伤中发生的低流量状态和促炎状态导致通过组织中数量不断减少的毛细血管的缓慢流动(灌注不良)。一种机制包括红细胞(rbc)叠连的
形成，它是红细胞柱在微循环中的堆积。这些红细胞叠连会滞留在毛细血管中，并通过物理阻塞阻碍流动，增加局部血液粘度，并与粘附在受损血管内皮上的其他炎症细胞交联，并在休克时通过糖萼破坏。治疗性peg聚合物(从20-100k)增加rbc聚集，并且更有可能增强在休克和低流动状态下的红细胞叠连。这与这些治疗性peg聚合物通过限制代谢细胞和组织肿胀来恢复毛细血管流动和灌注来产生的保护作用相反。
23.本公开提供了组合物，其包含与少量低分子量阻断剂组合的治疗性peg聚合物，以通过限制红细胞叠连来增强对局部毛细血管灌注的治疗效果。因此，本公开的实施方案提供了一种组合物，其包含分子量为18,000-100,000da的peg，例如18,000-40,000da，例如20,000-35,000da，例如18,000da、20,000da、25,000da、30,000da、35,000da或40,000da，浓度为5-30重量％，例如5-20％、10-30％或10-20％w/v，以g/l总溶液。该组合物还包含分子量为1,000-10,000的peg，例如2,000-8,000da，例如2,000、3,000、4,000、5,000、6,000、7,000或8,000da，例如6,000da，浓度为1-30％，例如1-20％或1-10％w/v，以g/l总溶液。
24.大多数peg包括具有一定分子量分布的分子(即它们是多分散的)。粒度分布可以通过其重均分子量(mw)和其数均分子量(mn)进行统计学表征，其比值称为多分散指数(mw/mn)。在一些实施方案中，多分散指数小于约5，例如小于4、3、2、1.5或1.2。
25.较小的聚合物提供了两个重要的作用：1)它们削弱了大peg分子对红细胞沉降速度的促进作用，无论是在体内与全血或血液制品分开施用时，还是在体外作为组合血液制品提供时，使产品更易于施用；2)它们在复苏后提供细胞免疫系统的活化成分的短期免疫伪装，从而阻断复苏后的一些早期促炎反应。免疫伪装是通过聚合物对血细胞的非特异性表面钝化来实现的。聚合物覆盖了细胞-细胞相互作用的活化表面受体，从而通过“包裹”白细胞以掩盖或伪装它们使其免受受伤组织的活化，进一步防止复苏后的继发性炎症损伤。
26.高分子量和低分子量peg溶解或分散在水中，例如去离子水。在一些实施方案中，所述组合物是盐水或乳酸林格溶液并且包含氯化钠、乳酸钠、氯化钾、氯化钙和氯化镁中的一种或多种。
27.在一些实施方案中，组合物的总体积为1000ml以下，例如500ml、250ml或150ml以下，例如100-1000ml。在一些实施方案中，对于20-100kg的患者，基于6.8ml/kg体重的剂量，总体积在约136-680ml的范围内。
28.溶液可以是单相溶液、分散体、乳液或任何其他物理上适合递送至受试者的形式。该溶液是“生理上可接受的”，因为它适合注射到受试者体内而不会造成过度的有害影响。该溶液可以包含自体血液或血液替代物。在一些实施方案中，溶液包含额外的细胞非渗透剂或渗透剂。
29.参考图7，本公开的其他实施方案提供了一种静脉输液产品，该产品包括配置用于静脉内递送流体的袋子10和袋子内的如本文所述的组合物。合适的iv输液袋，例如袋，在本领域中是众所周知的。
30.本公开的其他实施方案提供了如本文所述的与细胞氧载体溶液或非细胞氧载体溶液混合的组合物。非细胞氧载体溶液包括基于血红蛋白的氧载体(hboc)，例如全氟化合物的液体乳液(pec乳液)和这些氧载体中任一种的脂质包封。细胞氧载体包括全血，例如通过输血或浓缩红细胞施用。因此，本文所述的组合物可以是用于全血或血液制品或其他氧载体溶液的无菌添加剂，其用于使患有外伤、血量不足、休克或继发于
灌注不良的代谢性极端情况的患者复苏。该添加剂可以与一个单位的全血混合或在全血采集时添加到供血袋中。例如，50-150ml的组合物可以过滤灭菌并与400-600ml的经酸-柠檬酸-葡萄糖(acd)处理的全血混合。该组合产品显著提高了全血复苏的有效性，并提高了患者的结果和生存率。
31.进一步的实施方案提供了用于在有需要的受试者(例如，外伤或休克患者)中恢复或增加局部或整体组织灌注的方法，包括向受试者施用治疗有效量的如本文所述的组合物。该组合物可以在细胞或非细胞氧载体溶液施用的同时添加，或在细胞或非细胞氧载体溶液施用之前添加。在一些实施方案中，细胞或非细胞氧载体溶液在施用组合物的12小时内施用，例如10、8、6、4、2或1小时内。在一些实施方案中，施用的所述细胞氧载体溶液的量为在没有所述组合物的情况下预估所需血量的50％以下，例如40％、30％、20％、10％或5％以下。
32.进一步的实施方案提供了用于有需要的受试者(例如外伤或休克患者)的心脏复苏的方法，包括向受试者施用治疗有效量的如本文所述的组合物。该组合物可以在细胞或非细胞氧载体溶液施用的同时添加，或在细胞或非细胞氧载体溶液施用之前添加。在一些实施方案中，细胞或非细胞氧载体溶液在施用组合物的12小时内施用，例如10、8、6、4、2或1小时内。在一些实施方案中，施用的所述细胞氧载体溶液的量为在没有所述组合物的情况下预估所需血量的50％以下，例如40％、30％、20％、10％或5％以下。
33.本文所述的溶液可以通过任何合适的方式施用，例如通过动脉内、静脉内、骨内或心内途径。
34.术语“受试者”或“患者”通常是指任何哺乳动物，通常是人类。本文所述的溶液和方法还具有兽医应用，包括但不限于同伴动物和农场动物。
35.如本文所用，术语“有效量”或“治疗有效量”是指无毒但足以提供所需生物学结果的试剂量。该结果可以是疾病的体征、症状或原因的减少和/或减轻，或生物系统的任何其他期望的改变，例如复苏期间代谢细胞和组织肿胀的减少或抑制。
36.本文所述的组合物允许血液容易地通过重要器官和组织中的毛细血管网络，因此可以发生所需的氧气转移以减轻和逆转休克的代谢作用。本文所述的组合物可施用于已遭受全身氧债(血浆乳酸超过2.5mm)的危重病人。该组合物改善了同时或相继施用的全血或血液制品在氧气递送和氧气向缺氧组织转移方面的性能，并增加了对作为继发性损伤的明显细胞炎症的保护作用。相对于没有该组合物的相同体积的全血或血液制品，该组合物提高了结果和存活率。
37.本文所述的组合物解决了流体复苏的“无复流”问题，这比以前理解的要重要得多。如果血液不能到达毛细血管交换血管(毛细血管无复流)，则向休克患者施用全血是无益的。解决“无复流”允许携带全血的氧气进入毛细血管空间，以影响急需的氧气转移到缺血组织。这会降低乳酸，偿还所产生的氧债，并显著提高生存率。
38.本文所述的组合物可用于患有代谢和心血管窘迫(例如，以大于2.5mm的血浆乳酸为指标)的患者的医院输注。其他用途包括用于外科或医疗icu中的危重患者、烧伤患者、有房室综合征风险的创伤患者、接受移植物的移植患者、心血管衰竭的器官捐献者、用于治疗快速失血的手术室应用，以及在失血或心血管衰竭时的输送使用。该产品还可用于军事冲突地区的前沿野战医院、地面和空中的运输车辆，以及因心血管衰竭、休克、创伤，或疾病而
导致某种形式的缺氧的患者需要全血的任何地方。。
39.在更详细地描述本发明的示例性实施方案之前，应理解本发明不限于所描述的特定实施方案，因为它当然可以变化。还应理解，本文使用的术语目的仅用于描述特定实施方案，而不是限制性的，因为本发明的范围将仅由所附权利要求限定。
40.在提供数值范围的情况下，除非上下文另有明确规定，应理解为在该范围的上限和下限之间的每个间隔值(至下限的单位的十分之一)以及该规定范围内的任何其他规定或间隔值都包含在本发明中。这些较小范围的上限和下限可以独立地包括在较小的范围内，并且也包括在本发明内，但须符合所述范围内任何具体排除的限制。当所述范围包括一个或两个极限时，排除这些被包括的极限中的任何一个或两个的范围也包括在本发明中。
41.除非另有定义，本文使用的所有技术和科学术语与本发明所属领域的普通技术人员通常理解的含义相同。尽管与本文所述的那些相似或等效的任何方法和材料也可以用于本发明的实践或测试，但现在描述的是具有代表性的说明方法和材料。
42.本说明书中引用的所有出版物和专利在此通过引用而并入，就像每个单独的出版物或专利被具体和单独指出要通过引用而并入一样，并通过引用而并入来披露和描述与引用的出版物有关的方法和/或材料。对任何出版物的引用是为了其在申请日期之前的披露，不应理解为承认本发明无权凭借先前的发明而在该出版物之前。此外，所提供的出版日期可能与实际出版日期不同，可能需要单独确认。
43.注意，如本文和所附权利要求中使用的，除非上下文另有明确规定，单数形式的“一个”、“一种”和“该”应包括复数指示物。还应注意，权利要求书可以被书写为排除任何可选的元素。因此，本声明旨在作为使用诸如“仅”、“唯一”等与权利要求要素的叙述有关的排他性术语，或使用“否定”限定的前题基础。
44.如本领域技术人员在阅读本公开内容后将显而易见的，本文描述和说明的每个单独的实施方案具有分立的部件和特征，它们可以容易地与其他几个实施方案中的任何一个的特征分离或组合而不背离脱离本发明的范围或精神。任何列举的方法都可以按照列举事件的顺序或任何其他逻辑上可能的顺序来执行。
45.通过以下非限制性实例进一步描述本发明，这些实例进一步说明本发明，并且不能也不应将它们解释为限制本发明的范围。
46.实施例1
47.用于失血性休克复苏的peg聚合物尺寸
48.对致死性失血性休克和低容量复苏(lvr)的稳健啮齿动物模型的早期研究表明，经典的非渗透分子非常有效，因为它们使低容量复苏(lvr)时间加倍，这是对休克耐受性的指标。相对于盐水量对照组，其他心血管和代谢结果也提高了两倍。为了优化效果，我们搜索了渗透反射系数小于1(纯渗透剂，如白蛋白，其停留在毛细血管空间中)且大于0(纯非渗透物，如葡萄糖酸盐，其可在毛细血管和间隙空间之间自由平衡)的非渗透分子。我们发现大于10k但小于100k的peg聚合物是有吸引力的候选者。在休克中进行了尺寸研究，结果是以lvr时间、复苏后的动脉压和复苏后的血浆乳酸积累作为氧债的指标。这些研究总结在图3中。
49.结果表明，peg-8k产生的休克耐受性增加了2-3倍，与葡萄糖酸盐相似，并且与其分子反射系数一致。在啮齿动物休克模型中，20-35k之间的peg聚合物产生了最佳结果，因
为它们具有最高的lvr时间、最高的末期平均动脉压和最低的末期乳酸值。事实上，peg-20k和peg-35k导致乳酸从复苏时的10mm下降到接近基线(1.2mm)，这表明在4小时内偿还了氧债。根据lvr时间，使用peg-100k进行的低容量复苏产生了良好的结果，但大鼠开始恶化，因为它们的map非常低(复苏后4小时约为40mmhg)，并且它们的乳酸回升至接近10mm，这表明它们正在重新累积氧债。因此，看起来peg聚合物尺寸在20-35k da之间对于致命性休克后的复苏是最佳的。
50.实施例2
51.用于失血性休克复苏的peg剂量
52.目前推荐用于休克复苏的剂量是单次低容量静脉推注，容量等于预估血量的10％或6.8ml/kg。使用的溶液是10％重量/体积的聚乙二醇20,000(peg-20k)溶液。该剂量通过输液器在5分钟内施用或通过重力进料给静脉通路施用。该特定剂量是通过在成熟的致死性休克啮齿动物模型中的迭代实验确定的，该模型显示与临床前猪模型相关。这些剂量反应数据如图4所示。这些数据显示了基于lvr时间和末期血浆乳酸结果的peg-20k iv溶液的最佳剂量。具体来说，最有效的复苏结果是具有最长lvr时间和最低终末乳酸(以mm/l为单位显示在每个条形下方)的结果。通过在这个测试模型中使用这些标准，peg-20k作为10％的peg-20k溶液以预估血量的10％(6.8ml/kg)的体积剂量静脉内施用，产生了最明显的最佳结果。
53.将浓度降低至5％(在10％ebv剂量下)或使用10％溶液将剂量降低至5％ebv会产生较差的结果。同样，递送相同质量的peg-20k，但体积减半(以5％ebv剂量递送的20％溶液)的效果较差，这表明相同有效质量的peg-20k需要最小体积的等渗载体(乳酸林格溶液成分)。这是有道理的，因为该机制是将等渗体积移出细胞并重新装载毛细血管空间。需要10％ebv(6.8ml/kg)的最小置换液体积。这属于仍然被认为是低容量复苏容量的上限内。虽然10％peg-20k溶液产生了最佳结果，但由于240分钟lvr期结束时末期乳酸浓度略高(1.2mm 10％peg-20k与2.5mm 20％peg-20k相比)，因此将浓度加倍并没有更有效且益处较小。还比较了最佳peg-20k剂量与其他可用作休克复苏中lvr溶液(盐水、hextend和白蛋白)的常见晶体的性能。在其他研究中，用含有7.5％peg-20k的溶液进行复苏与10％溶液没有显著差异。
54.实施例3
55.制剂优化：esr效应
56.当与全血混合时，对严重休克后的复苏具有这些有益作用的大聚合物尺寸的peg也显著增加了红细胞沉降率(esr)。聚乙二醇聚合物可以非特异性结合生物材料和非生物材料。此外，分子半径大于4nm的聚合物可以结合和交联红细胞等细胞，而小于4nm的聚合物则不能。这转化为10-20k da之间的截留(cut-off)分子量，使得peg-20k大到足以与rbc相互作用，而peg-10k的尺寸则不然。在休克的临床前模型中，我们在体内使用10％peg-20k iv溶液时首先观察到的结果之一是，在静脉注射单剂量peg-20k后采集的全血样本中的红细胞能够迅速沉降出溶液(图5-右侧-含有10％的peg-20k溶液，该图显示了仅10分钟后红细胞沉降的程度)。在离体人血中使用经典的westegren esr测试对这种效应进行定量，来定量peg-20k esr效应。60分钟时在正常血液中的沉降量约为2-6mm。当血液用10％peg-20k以1:9稀释时增加到60mm，这模拟了休克中lvr后的稀释。
57.我们接下来使用标准westergren esr测定法测量esr率，并尝试通过添加一系列不同浓度的较小peg聚合物来阻止或减弱沉降效应，这些聚合物将作为rbc上结合位点的竞争性抑制剂。不受理论束缚，我们的假设是较大的peg聚合物非特异性结合到带rbc的表面。当多个红细胞附着在每个大聚合物上时，就会发生交联，从而增加血液颗粒的密度，这使它们迅速从溶液中沉淀出来。我们假设较小的聚合物对红细胞表面具有相同的亲和力，但不能适应多种红细胞结合，因此不允许交联。
58.为了检验这一假设，我们进行了系统的聚合物封闭研究。将分子半径小于4nm(分子量小于10k da)的较小peg聚合物加回到peg处理的全血中，以竞争性干扰peg交联和esr沉降。我们在已知的休克治疗范围内测试了三种市售的peg聚合物(peg-20k、peg-35k和peg-100k)。结果在图6a-6c中。我们在peg-35k(图6b)和peg-100k(图6c)的治疗浓度下显示出强得多的esr效应(2x)。随着治疗性peg分子量的增加，使用较小的peg聚合物(peg-1k至peg-10k)抑制这些esr效应的能力会减弱。通常，与使用peg-20k所见的情况相比，需要更高浓度的阻断peg聚合物才能产生较小的效果。
59.使用较小的peg聚合物的另一个优点是这些聚合物对活化的炎症细胞具有免疫伪装作用。这用于阻止和限制二次复苏和再灌注损伤。
60.尽管本发明已根据其优选实施方案进行了描述，但本领域技术人员将认识到可以在所附权利要求的精神和范围内进行修改来实践本发明。因此，本发明不应限于上述实施方案，而应进一步包括在本文提供的描述的精神和范围内的所有修改和等效物。