敲低或抑制STING活性物质的医药用途

敲低或抑制sting活性物质的医药用途
技术领域
1.本发明属于生物医药技术领域，具体涉及敲低或抑制干扰素基因刺激因子(stimulator of interferon gene，sting)的物质在制备动脉粥样硬化相关血管疾病防治药物中的应用。


背景技术：

2.随着社会发展，心血管疾病(cardiovascular disease，cvd)正逐渐成为威胁人类健康的世界性问题，预计到2030年，cvd将继续成为全球主要的死亡原因。动脉粥样硬化(atherosclerosis，as)是缺血性心脏病、中风和周围血管疾病的共同病理生理基础，高胆固醇血症、高血压和遗传等多种危险因素共同造成，并且肥胖、糖尿病、吸烟和久坐等生活方式会加剧as的进展。as是一种慢性血管炎性疾病，其主要病变特征为血管内膜脂质沉积，伴有平滑肌细胞和纤维基质增生，逐渐发展成动脉粥样硬化斑块。研究发现炎症在as发生发展过程中发挥重要作用，as相关的炎症是由促炎细胞因子、炎症信号通路、修饰的脂蛋白和粘附分子介导的。因此，明确炎症信号通路对as的影响，寻找新的as相关血管疾病治疗思路与靶点极为重要。
3.环磷酸鸟苷
‑
腺苷酸合成酶(cyclic gmp
‑
amp synthase,cgas)
‑
干扰素基因刺激因子(stimulator of interferon gene,sting)信号通路是细胞质内重要的dna感知通路，cgas通过带正电荷的氨基酸残基与带负电荷的dna磷酸主链相互作用。当胞质出现异常的dna时，cgas可以与其直接结合，随后cgas二聚体化并发生构象变化，催化atp和gtp合成环鸟嘌呤腺嘌呤(cyclic gmp
‑
amp,cgamp)。cgamp作为第二信使，招募位于内质网膜上的sting，sting迅速发生二聚化被激活，活化的sting从内质网经高尔基体迁移至细胞核周围的点状膜结构上，磷酸化激活tank结合激酶1(tank
‑
bingding kinase 1,tbk1)，再分别促进干扰素调节因子3(interferon regulatory factor 3,irf3)和核因子
‑
κb(nuclear factor kappa
‑
b,nf
‑
κb)磷酸化活化，产生多种下游生物学效应。
4.sting是一个多功能接头蛋白，为胞内模式识别受体(pattern
‑
recognition receptors,prrs)，包含4个跨膜结构域，分别为二聚化结构域、环二核苷酸相互作用域以及与tbk1相互作用结构域(“molecular mechanisms and cellular functions of cgas
–
sting signalling，karl
‑
peter hopfner，veit hornung，nature reviews molecular cell biology”)。在静息状态下，sting呈现出自抑制失活状态。通过激活cgas
‑
sting信号通路诱导ifn等细胞因子产生，有效激发和影响适应性免疫，参与适应性免疫的效应阶段。该通路对病毒感染、自身免疫性疾病、肿瘤及神经系统疾病等都具有调节作用。
5.目前，sting蛋白在心血管疾病中的作用及其机制尚未有任何相关的研究和报道。


技术实现要素：

6.针对上述问题，本申请提供一种敲低或抑制sting(stimulator of interferon gene,干扰素基因刺激因子)活性物质的医药用途。
7.具体而言，本申请首先提供了敲低或抑制sting活性物质在制备防治心血管疾病药物中的应用；特别是在制备防治动脉粥样硬化药物中的应用。
8.进一步而言，上述敲低或抑制sting活性物质包括可敲低sting蛋白表达的小干扰rna或sting活性抑制剂。
9.进一步而言，上述可敲低sting蛋白表达的小干扰rna的正义链核苷酸序列如seq id no.1所示(5
‘‑
ccggauucgaacuuacaautt
‑3’
)，反义链核苷酸序列如seq id no.2所示(5
‘‑
auuguaaguucgaauccggtt3’)。
10.进一步而言，上述sting抑制剂为amlexanox。
11.本申请通过western blot发现动脉粥样硬化病人主动脉组织、apoe
‑
/
‑
小鼠主动脉组织以及人冠状动脉内皮细胞中sting蛋白被激活。在致病因素刺激下，内皮的活化和功能障碍是as形成的始动环节。本发明首次明确sting对内皮功能调节机制，有效防止内皮功能障碍及其导致的as发生，为as的诊断及治疗提供新的防治药物研发途径和药物作用靶点，具有十分重要的药用价值。
附图说明
12.图1为p
‑
sting、sting、p
‑
tbk1、tbk1、p
‑
irf3、irf3、p
‑
p65、p65在正常人和动脉粥样硬化病人的主动脉组织中的蛋白表达水平示意图：
13.检测方法为提取正常人和动脉粥样硬化病人主动脉组织中的蛋白后，用western blot检测p
‑
sting、sting、p
‑
tbk1、tbk1、p
‑
irf3、irf3、p
‑
p65、p65蛋白表达水平。
14.图2为ox
‑
ldl、lps、tnfα刺激hcaecs后检测p
‑
sting、sting、p
‑
tbk1、tbk1、p
‑
irf3、irf3表达水平示意图：
15.检测方法为hcaecs给予ox
‑
ldl(100μg/ml)、lps(1μg/ml)、tnfα(50nm)刺激24h后，再western blot检测p
‑
sting、sting、p
‑
tbk1、tbk1、p
‑
irf3、irf3蛋白表达水平。
16.图3为ox
‑
ldl、lps、tnfα刺激hcaecs后sting、tbk1蛋白相互作用示意图；
17.检测方法为：hcaecs分别给予ox
‑
ldl(100μg/ml)、lps(1μg/ml)、tnfα(50nm)刺激24h，再通过co
‑
ip检测sting和tbk1蛋白相互作用水平。
18.图4为ox
‑
ldl刺激hcaecs后，免疫荧光检测sting分布结果图片；
19.检测方法为：hcaecs给予ox
‑
ldl(100μg/ml)刺激24h后，利用免疫荧光检测sting在细胞内的分布，图中a代表sting，b代表细胞核。
20.图5为ox
‑
ldl刺激hcaecs后，免疫荧光检测irf3分布结果图片；
21.检测方法为：hcaecs给予ox
‑
ldl(100μg/ml)刺激24h后，利用免疫荧光检测irf3在细胞内的分布，图中a代表irf3，b代表细胞核。
22.图6为敲低或激活sting后，给予ox
‑
ldl刺激hcaecs，western blot检测p
‑
sting、sting、p
‑
tbk1、tbk1、p
‑
irf3、irf3蛋白表达水平示意图；
23.检测方法为:给予hcaecs sisting刺激48h敲低sting，再给予ox
‑
ldl 100μg/ml刺激24h；给予hcaecs amlexanox 50μm预处理1h抑制sting活性，再给予ox
‑
ldl 100μg/ml刺激24h；给予hcaecs dmxaa 20μg/ml与ox
‑
ldl 100μg/ml共刺激24h激活sting，通过western blot检测p
‑
sting、sting、p
‑
tbk1、tbk1、p
‑
irf3、irf3蛋白表达水平。
24.图7为敲低或激活sting后，以ox
‑
ldl刺激huvecs，co
‑
ip检测sting、tbk1蛋白相互
作用示意图；
25.检测方法为:给予hcaecs sisting刺激48h敲低sting，然后给予100μg/ml ox
‑
ldl刺激24h，co
‑
ip检测sting、tbk1蛋白相互作用水平。
26.图8为敲低或激活sting后，以ox
‑
ldl刺激hcaecs，hcaecs的迁移能力示意图；
27.检测方法为:给予hcaecs sisting刺激48h敲低sting，再给予ox
‑
ldl 100μg/ml刺激24h；给予hcaecs amlexanox 50μm预处理1h抑制sting活性，再给予ox
‑
ldl 100μg/ml刺激24h；给予hcaecs dmxaa 20μg/ml与ox
‑
ldl 100μg/ml共刺激24h激活sting,通过细胞划痕实验检测hcaecs迁移能力。
28.图9为敲低或激活sting后，以ox
‑
ldl刺激hcaecs，单核细胞粘附实验检测结果示意图；
29.检测方法为:给予hcaecs sisting刺激48h敲低sting，再给予ox
‑
ldl 50μg/ml刺激24h；给予hcaecs amlexanox 50μm预处理1h抑制sting活性，再给予ox
‑
ldl 100μg/ml刺激24h；给予hcaecs dmxaa 20μg/ml与ox
‑
ldl 100μg/ml共刺激24h激活sting，再利用单核细胞粘附实验检测血管内皮细胞对单核细胞粘附的影响。
30.图10为小鼠血管组织通过western blot检测p
‑
sting、sting、p
‑
tbk1、tbk1、p
‑
irf3、irf3、p
‑
p65、p65蛋白表达水平示意图；
31.检测方法为：构建内皮细胞特异性敲除sting的apoe
‑
/
‑
小鼠(apoe
ko
sting
ec
‑
ko
)，8周龄雄性小鼠给予正常或高胆固醇饮食喂养构建小鼠的动脉粥样硬化相关血管疾病模型，16周收取小鼠血管组织，提取小鼠血管组织蛋白，通过western blot检测p
‑
sting、sting、p
‑
tbk1、tbk1、p
‑
irf3、irf3、p
‑
p65、p65蛋白表达水平。
32.图11为小鼠模型油红o染色检测结果图片；
33.检测方法为：构建apoe
ko
sting
wt
和apoe
ko
sting
ec
‑
ko
小鼠模型，即：8周龄雄性小鼠给予正常胆固醇或高胆固醇饮食喂养16周构建小鼠的动脉粥样硬化相关血管疾病模型。此外，在给予高脂喂养的同时灌胃amlexanox 100mg/kg以抑制sting的活性。16周后收取其主动脉血管，通过油红o染色检测斑块的大小。
34.图12为小鼠模型免疫荧光检测结果图片；
35.检测方法为：cd31和icam1在apoe
ko
sting
wt
、apoe
ko
sting
ec
‑
ko
小鼠主动脉组织切片中的表达水平：提取apoe
ko
sting
wt
、apoe
ko
sting
ec
‑
ko
小鼠主动脉组织后进行oct包埋，冰冻切片后，用免疫荧光检测cd31和icam1的表达，红色(a)代表cd31，绿色(c)代表icam1，蓝色(b)代表细胞核,白色箭头所示为红色和绿色的共定位黄色区域。
36.图13为小鼠模型he染色检测血管斑块图片；
37.检测方法为:构建apoe
ko
sting
wt
、apoe
ko
sting
ec
‑
ko
小鼠，8周龄雄性小鼠给予正常胆固醇或高胆固醇饮食喂养构建小鼠的动脉粥样硬化相关血管疾病模型，喂养16周，收取小鼠血管组织，油红o染色检测主动脉根部斑块形成情况，he染色检测血管的斑块面积。
具体实施方式
38.下面的实施例可使本专业技术人员全面地理解本发明，但不以任何方式限制本发明。
39.以下实施例涉及的细胞、试剂来源：
40.人冠状动脉内皮细胞(hcaecs)：购于sciencell公司。
41.apoe
‑
/
‑
小鼠：购于维通利华实验动物技术有限公司，8周龄雄性小鼠。
42.以下实施例所涉及的细胞实验均经过南京医科大学伦理委员会的批准。
43.dmxaa：mce公司，货号117570
‑
53
‑
3。
44.sisting：由上海吉玛基因公司合成。
45.amlexanox：selleck公司，货号68302
‑
57
‑
8。
46.实施例1sting蛋白与动脉粥样硬化相关性检测试验
47.为了探索在正常人主动脉组织中和动脉粥样硬化病人的主动脉中sting蛋白是否参与了动脉粥样硬化，本实施例采用western blot方法检测正常人和动脉粥样硬化病人的主动脉组织中p
‑
sting、sting、p
‑
tbk1、tbk1、p
‑
irf3、irf3、p
‑
p65、p65蛋白表达的水平。
48.western blot检测试验步骤如下：
49.(1)配置sds聚丙烯胺凝胶：根据蛋白分子量配制分离胶，将各种试剂按照不同配比加入到50ml离心管中配置分离胶，涡旋震荡30s混匀，倒入垂直夹层玻璃板中至玻璃板中上部，再缓慢加入ddh2o进行液封，室温凝固45min。浓缩胶：根据配方将试剂混合均匀倒入分离胶上方至玻璃板顶端，插入梳子(避免混入气泡)，可用移液器将剩余液体从梳子两侧补加进去，待胶体凝固后备用。
50.(2)样品上样并进行电泳分离：上样电泳，上样前蛋白样品瞬时离心，然后轻微摇匀。一般按照总质量为30μg蛋白的溶液体积即为上样量。将凝胶板固定于电泳装置的电泳槽内，两个凝胶板之间加满1x电泳缓冲液后拔出梳子上样，上样结束后补满液体开始电泳。80v恒压电泳跑至溴酚蓝抵达浓缩胶与分离胶交界处并且每条泳道的蛋白样品基本在同一水平线上，调成120v，等到溴酚蓝接近底部时终止电泳。
51.(3)转膜：玻璃板拆下，切胶。将pvdf膜根据凝胶大小裁剪好，提前用甲醇激活1min，再与海绵、滤纸、凝胶一起放入1x转膜缓冲液浸泡5
‑
10min，之后按照顺序依次排列好，放置过程中注意排出气泡。将转膜槽放入盒子中，恒压120v，根据蛋白分子量选择转膜时间(转膜过程中产热，周围放入冰袋和水模拟4℃低温环境)。
52.(4)封闭：转完后将膜取出，放在5％脱脂牛奶(tbs
‑
t配制)中，室温脱色摇床上摇动封闭1h。
53.(5)一抗孵育：封闭结束后用tbs
‑
t洗净牛奶，将膜密封于塑封膜内，加入相应的一抗，4℃冰箱摇床过夜。
54.(6)二抗结合：将膜用tbs
‑
t分别10min、10min、5min、5min洗四次，与相应的二抗室温于脱色摇床上摇动孵育1h，再用tbs
‑
t依次洗膜10min、10min、5min、5min。
55.(7)ecl显色：显色前将ecl显色液a、b液等体积混合均匀(避光)，在荧光化学发光凝胶成像系统中显像，拍照并保存记录。
56.检测结果如图1所示，与正常人主动脉组织(control)相比，动脉粥样硬化病人(as)的主动脉组织中sting蛋白被激活，p
‑
sting、p
‑
tbk1、p
‑
irf3、p
‑
p65的蛋白表达水平明显增加(图1)。
57.上述western blot方法为本领域常规方法，也可以参见文献“xie l,et al.antioxid redox signal.2016,20；24(6):329
‑
343；xi h,et al.circ res.2016；118(10):1525
‑
39.”)中所公开的步骤。
58.为了进一步明确sting蛋白在动脉粥样硬化中的作用，申请人进一步培养人冠状动脉内皮细胞(hcaecs)，给予氧化低密度脂蛋白(ox
‑
ldl)100μg/ml、脂多糖(lps)1μg/ml、肿瘤坏死因子α(tnfα)50nm刺激24h建立内皮细胞损伤模型，同时以加入等量pbs组作为对照组(control)；再提取细胞总蛋白，利用western blot方法检测p
‑
sting、sting、p
‑
tbk1、tbk1、p
‑
irf3、irf3蛋白表达水平。检测结果如图2所示。通过western blot检测发现sting的总蛋白不变，而p
‑
sting的蛋白表达显著升高，同时下游效应蛋白tbk1、irf3和p65的总蛋白不变，而p
‑
tbk1、p
‑
irf3、p
‑
p65的蛋白表达水平明显增加。
59.同时进行免疫共沉淀(co
‑
ip)实验，实验方法为hcaecs分别给予ox
‑
ldl(100μg/ml)、lps(1μg/ml)、tnfα(50nm)刺激24h，过免疫共沉淀检测sting和tbk1相互作用，co
‑
ip实验具体步骤如下：
60.(1)预冷pbs，ripa buffer，细胞刮子(用保鲜膜包好后，埋冰下)，离心机。
61.(2)用预冷的pbs洗涤细胞两次，最后一次吸干pbs。
62.(3)加入预冷的ripa buffer。
63.(4)用预冷的细胞刮子将细胞从培养皿或培养瓶上刮下，把悬液转到1.5mlep管中，4℃，缓慢晃动15min(ep管插冰上，置水平摇床上)。
64.(5)4℃，14000g离心15min，立即将上清转移到一个新的离心管中。
65.(6)准备protein a agarose，用pbs清洗两遍珠子，然后用pbs配制成50％浓度，减掉枪尖部分，避免在涉及琼脂糖珠的操作中破坏琼脂糖珠。
66.(7)每1ml总蛋白中加入100μl protein a琼脂糖珠(50％)，4℃摇晃10min(ep管插冰上，置水平摇床上)，以去除非特异性杂蛋白，降低背景。
67.(8)4℃，14000g离心15min，将上清转到一个新的离心管中，除去protein a的珠子。
68.(9)做蛋白标准曲线，测蛋白浓度，测前将总蛋白至少稀释1：10倍以上，以减少细胞裂解液中去垢剂的影响。
69.(10)用pbs将总蛋白稀释到约1μg/μl，以降低裂解液中去垢剂的浓度，如果兴趣蛋白在细胞中含量较低，则总蛋白浓度稍高(如10μg/μl)。
70.(11)加入一定体积的兔抗到500μl总蛋白中，抗体的稀释比例因兴趣蛋白在不同细胞系中的多少而异。
71.(12)4℃缓慢摇动抗原抗体混合物过夜或室温2h，激酶或磷酸酯酶活性分析建议用2h室温孵育。
72.(13)加入100μl protein a琼脂糖珠来捕捉抗原抗体复合物，4℃缓慢摇动抗原抗体混合物过夜或室温1h。
73.(14)14000rpm瞬时离心5s，收集琼脂糖珠
‑
抗原抗体复合物，去上清，用预冷的ripa buffer洗3遍，800μl/遍，ripa buffer有时候会破坏琼脂糖珠
‑
抗原抗体复合物内部的结合，可以使用pbs。
74.(15)用60μl 2
×
上样缓冲液将琼脂糖珠
‑
抗原抗体复合物悬起，轻轻混匀，缓冲液的量依据上样多少的需要而定。
75.(16)将上样样品煮5min，以游离抗原，抗体，珠子，离心，将上清电泳，收集剩余琼脂糖珠，上清也可以暂时冻
‑
20℃，留待以后电泳，电泳前再次煮5min变性。
76.co
‑
ip实验检测sting和tbk1蛋白表达水平如图3所示，可见在ox
‑
ldl、lps和tnfα刺激下tbk1和sting的结合显著增加。
77.再进行细胞免疫荧光实验，hcaecs给予ox
‑
ldl(100μg/ml)刺激24h后，免疫荧光检测细胞内sting和irf3的分布。免疫荧光步骤如下：
78.(1)将激光共聚焦玻璃底小皿中的培养液弃掉，用预冷的pbs洗涤3次。
79.(2)每个小皿加入1ml 4％多聚甲醛室温固定20min。
80.(3)预冷的pbs洗涤3遍，加入1ml 0.5％tritonx
‑
100(pbs稀释，小孔覆盖)室温破膜20min。
81.(4)用pbs洗3次(中间先滴1滴，再打周围)，弃去液体，加入3％bsa
‑
pbs室温封闭1h。
82.(5)根据抗体说明书提供的稀释比例加入稀释的一抗(1％bsa
‑
pbs稀释抗体)，300μl每孔(覆盖底部)，4℃冰箱孵育过夜后，将孔板用pbs清洗3遍，除去一抗。
83.(6)加入稀释好的荧光二抗(1％bsa
‑
pbs稀释抗体)，37℃孵箱避光孵育1h，再用pbs清洗3遍剧烈摇晃。
84.(7)将dapi按照1：500用pbs稀释，每孔加入1ml复染细胞核，室温避光摇床10min，用pbs清洗3遍。
85.(8)激光共聚焦显微镜观察拍照。
86.图4为ox
‑
ldl刺激hcaecs后，免疫荧光检测sting在细胞内的分布结果，其中红色(a)代表sting，蓝色(b)代表细胞核。图5为ox
‑
ldl刺激hcaecs后，免疫荧光检测irf3在细胞内的分布结果：其中红色(a)代表irf3，蓝色(b)代表细胞核。
87.由图4、5可见，在ox
‑
ldl刺激下，hcaecs中sting和irf3在细胞内的分布发生了显著的变化，sting向细胞核周围聚集，irf3则进入细胞核。
88.进一步进行敲低或激活sting检测试验，检测方法为：给予hcaecs sisting(敲低sting蛋白表达的小干扰rna)刺激48h以敲低sting，再给予ox
‑
ldl 100μg/ml刺激24h；或给予hcaecs amlexanox 50μm预处理1h抑制sting活性，再给予ox
‑
ldl 100μg/ml刺激24h；或给予hcaecs dmxaa 20μg/ml与ox
‑
ldl 100μg/ml共刺激24h激活sting，通过western blot检测p
‑
sting、sting、p
‑
tbk1、tbk1、p
‑
irf3、irf3蛋白表达水平，检测结果如图6所示。可见，在给予hcaecs sisting和amlexanox抑制sting活性的条件下，ox
‑
ldl引起的sting、tbk1和irf3的蛋白活化则被显著抑制，p
‑
sting、p
‑
tbk1、p
‑
irf3蛋白表达水平降低；而给予hcaecs dmxaa(sting蛋白激动剂)处理后，ox
‑
ldl引起的sting、tbk1和irf3的蛋白活化进一步增加。
89.本实施例中使用的sisting正义链核苷酸序列为：
[0090]5’‑
ccggauucgaacuuacaautt
‑3’
(seq id no.1),反义链核苷酸序列为：5
[0091]
‘‑
auuguaaguucgaauccggtt3’(seq id no.2)。
[0092]
此外，给予hcaecs sisting刺激48h以敲低sting，再给予ox
‑
ldl(100μg/ml)刺激24h，通过co
‑
ip检测sting和tbk1的相互作用，sting与tbk1蛋白表达水平如图7所示。通过co
‑
ip实验发现，敲低sisting后可显著抑制ox
‑
ldl引起的sting与tbk1的蛋白质结合增加。
[0093]
进一步检测sting活化对hcaecs功能的影响：给予hcaecs sisting刺激48h敲低sting，再给予ox
‑
ldl(100μg/ml)刺激24h；给予hcaecs amlexanox 50μm预处理1h抑制
sting活性，再给予ox
‑
ldl(100μg/ml)刺激24h；给予hcaecs dmxaa 20μg/ml与ox
‑
ldl 100μg/ml共刺激24h激活sting；再分别通过细胞划痕实验检测hcaecs迁移能力。划痕实验检测步骤如下：
[0094]
(1)先用marker笔在6孔板背后，用直尺比着，均匀得划横线，大约每隔0.5
‑
1cm一道，横穿过孔。每孔至少穿过5条线；
[0095]
(2)在孔中加入约5x105个细胞，具体数量为过夜能铺满；
[0096]
(3)第二天用枪头比着直尺，尽量垂至于背后的横线划痕，枪头垂直；
[0097]
(4)用pbs洗细胞3次，去处划下的细胞，加入无血清培养基。
[0098]
(5)放入37℃5％co2培养箱，培养。分别在0，24h拍照。
[0099]
划痕检测结果如图8所示。可见ox
‑
ldl可以显著增加huvecs的迁移能力，而敲低或抑制sting的活性后，ox
‑
ldl引起的hcaecs迁移能力增加则被显著抑制；而给予hcaecs dmxaa(sting蛋白激动剂)处理后，ox
‑
ldl引起的huvecs迁移能力增加则进一步增强。
[0100]
进一步进行单核细胞粘附实验：给予hcaecs sisting刺激48h敲低sting，再给予ox
‑
ldl(100μg/ml)刺激24h；给予hcaecs amlexanox 50μm预处理1h抑制sting活性，再给予ox
‑
ldl(100μg/ml)刺激24h；给予hcaecs dmxaa 20μg/ml与ox
‑
ldl 100μg/ml共刺激24h激活sting；再进行单核细胞粘附实验检测血管内皮细胞与单核细胞粘附作用的影响。单核细胞粘附实验步骤如下：
[0101]
(1)在37℃下用cm
‑
dil(2.5μg/ml)标记thp
‑
1细胞10min。
[0102]
(2)将标记的细胞与经过不同处理的hcaecs在37℃下孵育60min。
[0103]
(3)孵育后，用pbs轻冲洗掉非粘附的thp
‑
1细胞。
[0104]
(4)捕获粘附的thp
‑
1细胞的荧光图像。
[0105]
检测结果如图9所示，可见，敲低或抑制sting的活性后，ox
‑
ldl引起的hcaecs单核粘附能力增加则被显著抑制，而给予hcaecs dmxaa(sting蛋白激动剂)处理后，ox
‑
ldl引起的hcaecs单核粘附能力增加则被进一步增强。
[0106]
实施例2小鼠模型试验
[0107]
为了进一步验证sting蛋白在动脉粥样硬化中的作用，本实施例构建了内皮特异性sting敲除的apoe
‑
/
‑
小鼠(apoe
ko
sting
ec
‑
ko
)：apoe
ko
sting
wt
和apoe
ko
sting
ec
‑
ko
，给予正常胆固醇(nc)或高胆固醇饮食喂养(hfd)16周；apoe
ko
sting
wt
给予正常饮食(nc)或高脂喂养(hfd)的同时部分小鼠灌胃amlexanox 100mg/kg/天以抑制sting的活性，通过以上构建小鼠动脉粥样硬化相关血管疾病模型。
[0108]
喂养16周后，收取小鼠血管组织蛋白，进行western blot检测，检测结果如图10所示，可见，apoe
ko
sting
wt
小鼠给予hfd后，sting通路被显著活化，p
‑
sting、p
‑
tbk1、p
‑
irf3和p
‑
p65的蛋白表达水平增加；而与apoe
ko
sting
wt
小鼠相比，apoe
ko
sting
ec
‑
ko
小鼠给予hfd后，p
‑
sting、p
‑
tbk1、p
‑
irf3、p
‑
p65蛋白表达水平降低显著降低。
[0109]
同时，于喂养第16周收取小鼠主动脉血管，通过油红o染色检测斑块的大小，检测图片如图11所示。可见apoe
ko
sting
wt
给予hfd后血管红色斑块显著增多，而apoe
ko
sting
ec
‑
ko
以及给予sting抑制剂amlexanox的apoe
ko
sting
wt
小鼠即使给予hfd后，斑块面积仍然显著降低。
[0110]
进一步进行血管免疫荧光检测，于喂养第16周提取apoe
ko
sting
wt
、apoe
ko
sting
ec
‑
ko
小鼠主动脉组织后进行oct包埋，冰冻切片后，用免疫荧光检测cd31和icam1的表达，如图12所示，其中红色代表cd31，绿色代表icam1，蓝色代表细胞核，白色箭头所示为红色和绿色的共定位黄色区域。可见，apoe
ko
sting
wt
给予hfd后，血管内皮icam1表达显著增加，cd31与icam1的共定位呈黄色；而apoe
ko
sting
ec
‑
ko
小鼠给予hfd后，血管内皮icam1表达下降，同时cd31与icam1的共定位黄色显著下降。
[0111]
于喂养第16周提取apoe
ko
sting
wt
、apoe
ko
sting
ec
‑
ko
小鼠主动脉组织，进行油红o和he染色。
[0112]
主动脉根部血管油红o染色步骤如下：
[0113]
(1)主动脉树分离出来后，置于干净的六孔板中，用4％的多聚甲醛固定。
[0114]
(2)用显微镊取经过多聚甲醛固定好的主动脉于新的六孔板中，用三蒸水漂洗10min左右。
[0115]
(3)用移液枪吸掉六孔板中的三蒸水，加入60％异丙醇溶液，处理2min。
[0116]
(4)用移液枪吸掉六孔板中的异丙醇，加入提前滤好的油红o染液，置于水平摇床上染色1h。
[0117]
(5)用移液枪吸掉六孔板中油红o染液，加入60％异丙醇溶液溶液漂洗1min，如此重复3次，直至血管背景不在是红色。
[0118]
(6)在显微镜下用显微剪小心去除残余的血管外壁脂肪。
[0119]
(7)最后将染色好的主动脉树平铺在黑色解剖蜡板上，拍照。
[0120]
主动脉血管he染色步骤如下：
[0121]
(1)将石蜡切片放入65℃烘箱烘烤30min。
[0122]
(2)脱蜡：二甲苯5min，共3次。100％乙醇1min。95％乙醇1min。70％乙醇1min。
[0123]
(3)蒸馏水浸洗，至玻片上不挂水珠，甩尽切片上水分，苏木素染色5min。
[0124]
(4)自来水浸洗，除去切片上的浮色。
[0125]
(5)1％盐酸乙醇1
‑
3s。自来水洗涤数次。
[0126]
(6)scott液1min，自来水洗数次。甩尽水分，伊红染色，血管10s。
[0127]
(7)蒸馏水洗涤数下，洗去切片上浮色。70％乙醇迅速浸洗一下。95％乙醇迅速浸洗一下。100％乙醇30s，共3次。
[0128]
(8)二甲苯2min，共3次。二甲苯未干时用中性树胶封片。
[0129]
染色结果如图13所示，发现apoe
ko
sting
wt
给予hfd后血管斑块面积增大，脂质含量增多，而apoe
ko
sting
ec
‑
ko
小鼠的主动脉血管中斑块减少，脂质含量降低。
[0130]
上述实例只为说明本发明的技术构思及特点，其目的在于让熟悉此项技术的人是能够了解本发明的内容并据以实施，并不能以此限制本发明的保护范围。凡根据本发明精神实质所做的等效变换或修饰，都应涵盖在本发明的保护范围之内。