PRPF8表达抑制剂在制备治疗肺癌的药物中的应用

prpf8表达抑制剂在制备治疗肺癌的药物中的应用
技术领域
1.本发明涉及生物技术领域，尤其涉及一种prpf8表达抑制剂在制备治疗肺癌的药物中的应用。


背景技术：

2.肺癌是常见的恶性肿瘤，非小细胞肺癌(nsclc)是肺癌的一种，约占80％
‑
85％，仅次于女性乳腺癌。非小细胞肺癌的治疗方案主要以化疗为主。到目前为止，顺铂仍然是nsclc治疗的最广泛的一线化疗药物。但是，治疗效果并不显著，根本原因是并没有从蛋白产生的源头开始寻找靶基因。
3.prpf8蛋白约280kda，是u5 snrnp剪接体装配动力学的中心。它不仅在rna底物中与5'的分支点和3'剪切位点中的多嘧啶区域形成直接接触。同时也参与了u5和u6snrnas组成。在人类常染色体显性遗传性视网膜炎中发现，prpf8可产生影响剪切体组装和功能的突变，引起局部疾病，导致细胞减少。
4.目前，prpf8在肺癌发生、迁移和侵袭中的功能未见相关报道。


技术实现要素：

5.本发明的目的是提供一种prpf8表达抑制剂在制备治疗肺癌的药物中的应用。
6.本发明prpf8表达抑制剂在制备治疗肺癌的药物中的应用。
7.优选的，所述肺癌为非小细胞肺癌。
8.进一步的，所述prpf8表达抑制剂包括下述至少一种：
9.特异性抑制prpf8表达的化合物；
10.特异性干扰prpf8表达的干扰分子；
11.特异性与prpf8蛋白结合的抗体或配体。
12.prpf8基因敲减试剂，所述prpf8基因敲减试剂为特异性敲减prpf8的基因编辑试剂。
13.进一步的，所述干扰分子为mirna或sirna。
14.进一步的，所述prpf8基因敲减试剂包括一种表达载体，所述表达载体包括一种shrna片段的dna编码序列，所述shrna片段的靶基因为prpf8基因。
15.优选的，所述shrna片段的序列如序列表中seq id no：1所示。
16.优选的，所述表达载体为质粒载体或病毒载体。
17.本发明还提供一种治疗肺癌的药物，包括一种prpf8基因敲减试剂，所述prpf8基因敲减试剂包括一种shrna片段，所述shrna片段的靶基因为prpf8基因。
18.优选的，所述shrna片段的序列如序列表中seq id no：1所示。
19.优选的，所述肺癌为非小细胞肺癌。
20.本发明还提供一种试剂在制备试剂盒中的应用，所述试剂用于定量检测prpf8蛋白表达水平，所述试剂盒用于判断药物治疗肺癌的有效性。
21.优选的，所述肺癌为非小细胞肺癌。
22.本发明的有益效果：
23.人类prpf8的功能缺失突变延迟了剪接体组分对前mrna的组装，并且抑制了9％(5/57)受试基因的剪切，产生功能不同的蛋白，对疾病的发生和肿瘤的生长具有重要的作用。
24.本发明通过在非小细胞肺癌细胞系中敲减prpf8可抑制细胞的生长，抑制细胞克隆形成能力，因此在非小细胞肺癌中prpf8可作为新型的抑制剂，用于临床对非小细胞肺癌的治疗。
25.通过抑制该基因的表达量可抑制非小细胞肺癌的细胞生长，可成为临床上治疗非小细胞肺癌的药物。
附图说明
26.图1为敲降细胞系荧光鉴定结果；
27.图2为prpf8敲降细胞系wb鉴定结果；
28.图3为kegg富集分析结果；
29.图4为a549敲降prpf8细胞生长曲线结果；
30.图5为a549敲降prpf8细胞克隆形成结果；
31.图6为imagej分析图5克隆形成结果；
32.图7为mda
‑
mb
‑
468敲降prpf8细胞生长曲线；
33.图8为mda
‑
mb
‑
468敲降prpf8细胞克隆形成结果；
34.图9为imagej分析图8克隆形成结果。
具体实施方式
35.下面对本发明的实施例做详细说明，以下实施例在以本发明技术方案为前提下进行实施，给出了详细的实施方案和具体的操作过程，但本发明的保护范围不限于下述的实施例。
36.实施例1、生物信息学分析prpf8在肺癌中的表达
37.利用数据库对prpf8在肺癌中的表达进行分析，通过kegg等数据库对prpf8进行富集分析，关注肺癌中prpf8调控的通路，分析prpf8在肺癌中的主要作用途径。
38.实施例2、敲降细胞系的建立
39.根据prpf8序列设计合成2条shrna，如下表所示，连入p
‑
gipz和p
‑
tripz载体上(购买自美国addgene生物技术有限公司,usa)。
40.表shrna序列
[0041][0042]
实施例3、慢病毒制备
[0043]
(1)293t细胞接种25cm小瓶，过夜培养后弃培养基，换2.5ml dmem无抗培养基；
[0044]
(2)将质粒ppax2、pmd2、gipz
‑
ctrl；质粒ppax2、pmd2、gipz
‑
prpf8
‑
1；质粒ppax2、pmd2、gipz
‑
prpf8
‑
4混匀后，加入250μl opti
‑
mem培养基，再用250μl opti
‑
mem培养基稀释lipo2000，室温放置5min后，将质粒与lipo2000混合，室温放置20min，加入293t细胞中；
[0045]
(3)5％co2培养18h后换dmem培养基；
[0046]
(4)继续培养48h后回收上清，并用0.45μm滤膜过滤；
[0047]
(5)加入1/3体积的病毒浓缩液(25％peg8000/0.75m nacl)，混匀后4℃过夜；
[0048]
(6)然后于4℃、1500g离心45min，弃上清，沉淀用1640培养基溶解，分别得到gipz
‑
ctrl、gipz
‑
prpf8
‑
1、gipz
‑
prpf8
‑
4病毒上清。分装，
‑
80℃保存。
[0049]
实施例4、细胞转染
[0050]
(1)嘌呤浓度的筛选
[0051]
将a549细胞系用胰酶消化3分钟，用培养基重悬成单细胞悬液，调整细胞密度为每孔105个细胞，培养30小时后，换成含嘌呤不同浓度的培养基，终浓度分别为：0.25μg/ml、0.4μg/ml、0.6μg/ml、0.75μg/ml、1.0μg/ml，每隔24h换液一次，连续培养7天，观察到细胞死亡的浓度，即最适嘌呤霉素浓度。
[0052]
(2)病毒转染
[0053]
a549细胞接种6孔板，每孔细胞2
×
105个细胞，过夜培养；24h后弃培养基，用pbs洗一次，加入1.2ml无抗、无血清含polybrene的新鲜培养基；加入gipz
‑
ctrl、gipz
‑
prpf8
‑
1、gipz
‑
prpf8
‑
4病毒上清；32℃2000rpm离心1h；37℃5％co2培养5h后，每孔加入1ml完全培养基；培养24h后弃培养基，加入含puromycin(终浓度0.75μg/ml)新鲜培养基，每三天换液一次；培养5天后收细胞，提rna。
[0054]
实施例5、q
‑
pcr鉴定
[0055]
将细胞接种6孔板，每孔2
×
105个细胞，过夜培养后弃培养基，加入新鲜的含puromycin培养基，每天换液一次，连续3天后收细胞，提取rna反转录成cdna。进行q
‑
pcr。
[0056]
q
‑
pcr反应体系如下：
[0057][0058]
实时定量pcr反应程序：预变性94℃5min，95℃10sec，60℃20sec，72℃10sec，共40个循环。
[0059]
实施例6、细胞增殖检测
[0060]
a549细胞6孔板每孔接种2
×
105个/孔，加入gipz
‑
ctrl、gipz
‑
prpf8
‑
1、gipz
‑
prpf8
‑
4病毒，嘌呤霉素puromycin 0.75μg/ml筛选5天后，收细胞接种96孔板，每孔1
×
104个细胞，每个细胞系设6个重复孔，连续培养7天，每天用cck8试剂盒测od值。
[0061]
实施例7、细胞克隆形成实验
[0062]
a549细胞6孔板每孔接种2
×
105个/孔，加入gipz
‑
ctrl、gipz
‑
prpf8
‑
1、gipz
‑
prpf8
‑
4病毒，嘌呤霉素puromycin筛选5天后，调整细胞数目，6孔板每孔接种500个/孔，每个细胞系3个样本重复，培养7天后，弃培养基，用pbs洗涤细胞2次后，每孔加入1ml甲醇固定细胞20min，弃甲醇pbs洗涤2次，每孔加入1ml 1％结晶紫溶液，室温染色20min后，pbs洗涤2次，ddh2o洗涤一次，凝胶成像系统拍照。
[0063]
为了验证prpf8对肺癌细胞生长的抑制作用是仅限于对肺癌细胞内的作用机制，我们采用同样的方法和同一批制备的病毒侵染乳腺癌mda
‑
mb
‑
468细胞，在乳腺癌细胞中敲降prpf8检测细胞的生长能力。
[0064]
敲降细胞系荧光鉴定结果如图1所示，左侧为tripz
‑
shctrl doxycycline诱导72h；中间为tripz
‑
shprpf8
‑
1 doxycycline诱导72h，右侧为tripz
‑
shprpf8
‑
4 doxycycline诱导72h。prpf8敲降细胞系wb鉴定结果如图2所示。
[0065]
检测结果说明：
[0066]
1、图3为kegg富集分析结果，通过kegg对肺癌中prpf8表达的分析得出，在肺癌中prpf8与多条通路密切相关，其中包括pi3k
‑
akt信号通路、顺铂耐药、小细胞肺癌、同源重组等等，在这些调控通路中pi3k
‑
akt信号通路最为显著，pi3k
‑
akt信号通路是典型的细胞生长调控通路，调节细胞生长通路，因此提示prpf8与肺癌细胞的生长有关。
[0067]
2、为了研究prpf8在非小细胞肺癌中的作用，我们在a549细胞中建立了prpf8敲降细胞系。p
‑
tripz
‑
shprpf8
‑
1、p
‑
tripz
‑
shprpf8
‑
4、p
‑
ripz
‑
shctrl慢病毒转染a549细胞，嘌呤霉素puromycin 0.75μg/ml筛选5天后，收取细胞提rna，qpcr检测a549
‑
tripz
‑
prpf8
‑
1、a549
‑
tripz
‑
prpf8
‑
4、a549
‑
tripz
‑
ctrl细胞系中prpf8mrna表达降低了1.5和1.63倍。
[0068]
3、敲降prpf8抑制a549细胞生长
[0069]
为了验证prpf8在肺癌细胞生长中的作用，我们在a549细胞构建的敲降细胞系中用cck
‑
8试剂盒检测细胞的增殖，用1％结晶紫染色观察细胞的克隆形成能力，结果显示
a549细胞敲降prpf8后，细胞增殖能力受到抑制，a549细胞敲降prpf8后细胞的克隆形成能力下降(p<0.05)，凋亡细胞增多，细胞生长变缓慢。
[0070]
a549敲降prpf8细胞生长曲线如图4所示，图4中
■
表示ctrl，
●
表示prpf8
‑
1，
▲
表示prpf8
‑
4。在a549细胞中沉默prpf8显著降低了细胞克隆形成的能力。
[0071]
a549敲降prpf8细胞克隆形成结果如图5所示，在a549细胞中敲降prpf8后细胞克隆形成能力降低。
[0072]
imagej分析克隆形成结果如图6所示，敲降prpf8后shprpf8细胞克隆形成能力显著降低(p<0.05)。
[0073]
4、乳腺癌细胞系中敲降prpf8实验
[0074]
mda
‑
mb
‑
468敲降prpf8细胞生长曲线如图7所示，图7中
◆
表示ctrl，
■
表示prpf8
‑
1，
▲
表示prpf8
‑
4。mda
‑
mb
‑
468敲降prpf8细胞克隆形成结果如图8所示。imagej分析克隆形成结果如图9所示。
[0075]
mda
‑
mb
‑
468乳腺癌细胞系中敲降prpf8后，监测5天细胞生长曲线，结果显示与对照组相比，prpf8敲降组细胞生长无差异(p>0.05)，细胞克隆形成试验中，敲降组细胞克隆形成能力降低不显著(p>0.05)，因此证明prpf8调控细胞生长的能力是在肺癌中特有的，在其他癌症中不具有同样的调控能力。每种癌症因为发病器官不同，产生的机制不同，癌细胞内的调控途径也不同，因此这种调控具有器官异质性，肿瘤异质性。
[0076]
5、为了进一步证明prpf8在肺癌中调控细胞生长的能力是特有性的，我们利用数据库对乳腺癌中prpf8的表达与富集进行分析，结果发现prpf8与多条通路密切相关，其中prpf8与9条通路具有显著相关性(p
‑
value<0.05),这9条通路涉及核糖体、氧化应激反应、帕金森综合征、心肌收缩、亨延顿综合征、老年痴呆症、p450的代谢以及蛋白酶体等9方面的调控，但与细胞生长调控无关。
[0077]
以上得出的实验结果证实，在非小细胞肺癌中敲除prpf8可抑制癌细胞的生长，因此针对prpf8合成的抑制剂能高效的抑制体内癌细胞的生长，降低肿瘤细胞的生存，是临床有效的治疗药物。