一种水蛭素活性冻干粉及其制备方法和应用与流程

本发明属于化妆品技术领域，涉及一种水蛭素活性冻干粉及其制备方法和应用。

背景技术：

1884年haycraft首先发现医用水蛭的提取物中含有抗凝血物质，1904年jacoby将其定名为水蛭素(hirudin)，1955年markwardt从医用水蛭咽周腺体中成功地分离出天然水蛭素。天然水蛭素是一条含65或66个氨基酸残基组成的单链多肽，分子质量为7kd，其n末端有3对二硫键(cys6－cysl4，cys16－cys28，cys32－cys39)，使肽链绕叠成密集形核心环肽结构，对蛋白结构起稳定作用，其n末端含活性中心，能识别底物---凝血酶碱性氨基酸富集位点，并与之结合。因此，天然水蛭素能和凝血酶进行特异性结合，阻碍凝血过程的进行，目前国内外对天然水蛭素的研究也大都集中于此。

近几年，有研究表明水蛭素还具有优异的护肤作用。天然水蛭素是一种低分子多肽，分子量小，可渗透到皮肤深层，疏通毛细血管，降低血液黏度，加快血流速度，改善面部微循环，促进了面部皮肤新陈代谢后减少角质层厚度，使细胞得到充足的养份，提高细胞的自我修复能力，从根本上改善皮肤。因此，水蛭素除了在医药领域外，在化妆品技术领域也具有广阔应用前景。

技术实现要素：

本发明提供一种水蛭素活性冻干粉，通过麦芽糊精与水蛭素的复合冻干，提高水蛭素冻干粉稳定性以及冻干粉复水后的皮肤渗透性。

本发明的第一个目的在于提供一种水蛭素活性冻干粉，所述水蛭素活性冻干粉原料包括水蛭素和麦芽糊精。

在冷冻干燥过程中产生的多种应力，会对水蛭素结构稳定性产生一定影响。在水蛭素活性冻干粉中加入麦芽糊精，在水蛭素分子周围形成保护屏障，保护水蛭素分子免受冷冻干燥的应力及温度所引起的损伤，有效提高冻干粉中水蛭素活性。水蛭素活性冻干粉应用于化妆品中，麦芽糊精能够显著提高水蛭素渗透皮肤的速度和质量。

水蛭素可以为从水蛭中提取的天然水蛭素，也可以为应用基因工程方法获得的与天然水蛭素结构和药理活性基本相同的重组水蛭素。本发明要求保护的水蛭素活性冻干粉对水蛭素活性没有限制，一般来说，水蛭素活性越高，水蛭素活性冻干粉的应用效果越好。作为优选，水蛭素纯度≥95％。

麦芽糊精是以淀粉水解而成的de值≤20％的以d葡萄糖为结构单位，以α－1，4键相聚合而成的多糖。作为优选，麦芽糊精的de值优选为10～20。

作为优选，水蛭素和麦芽糊精的质量比为1：(3～10)。

作为优选，所述水蛭素活性冻干粉原料还包括类蛇毒肽、赋形剂、助溶剂、稳定剂、磷酸缓冲剂和水。

作为优选，类蛇毒肽的纯度≥95％。类蛇毒肽能够通过抑制肌肉收缩而减少皱纹的产生，其效果能直达肌底，作为一种信号肽，模拟毒蛇毒液侵入人体后产生的神经麻痹肌肉收缩的特性，有效阻断肌肉收缩的信号传递，平复各类表情纹、静态纹及细纹，平滑肌肤。类蛇毒肽与水蛭素一起冻干后应用于化妆品中有效改善皮肤状态。

作为优选，所述赋形剂为乳糖、葡萄糖、蔗糖、甘露醇、山梨醇和海藻糖中的一种或多种。赋形剂用于改善了制剂产品的外观、疏松度，降低塌陷度。

作为优选，助溶剂为赖氨酸、精氨酸、葡甲胺、丙氨酸、组氨酸中的一种或多种。助溶剂用于增加蛋白质的溶解性，阻止蛋白质分子间通过疏水作用发生凝聚而产生沉淀。

作为优选，稳定剂为人血白蛋白、人源胶原蛋白中的一种或两种。人血白蛋白优选为重组人血白蛋白，人源胶原蛋白优选为重组人源胶原蛋白。人血白蛋白和/或人源胶原蛋白的添加可增加蛋白质的浓度，保护水蛭素，抵抗温度的变化对活性物质的影响，且人血白蛋白和/或人源胶原蛋白对皮肤又具有补充皮肤流失的蛋白，起到锁水保湿、增强皮肤弹性的作用。

作为优选，磷酸缓冲剂为磷酸二氢钠-磷酸氢二钠缓冲剂、磷酸氢二钾一磷酸二氢钾缓冲剂中的一种缓冲体系。

作为优选，所述水蛭素活性冻干粉原料中，每100ml水中包括：

10～50mg水蛭素，

5～25mg类蛇毒肽，

0.05～0.5g麦芽糊精，

3～10g赋形剂，

0.1～1g助溶剂，

0.05～0.2g稳定剂，

0.5～5mmol磷酸盐缓冲剂。

每100ml水中包括0.5～5mmol磷酸盐缓冲剂，解释为：以磷酸二氢钠-磷酸氢二钠缓冲剂为例，100ml水中磷酸二氢钠+磷酸氢二钠的摩尔质量为0.5～5mmol。

本发明的第二个目的在于提供所述水蛭素活性冻干粉的制备方法，包括以下步骤：

s1、将赋形剂溶于水中，加入磷酸缓冲剂，调节溶液ph为6.0～6.5，然后0.22～0.5μm孔径滤膜过滤，再高温蒸汽110～125℃灭菌20～40min，降至室温；

s2、将水蛭素、麦芽糊精、类蛇毒肽、助溶剂、稳定剂溶于高压灭菌后的水中，0.22～0.5μm孔径滤膜过滤；

s3、将步骤s1和步骤s2的溶液混合，不足体积用高压灭菌后的水补至所需体积，分装于西林瓶中，然后冷冻干燥处理。

本发明的第三个目的在于提供所述水蛭素活性冻干粉在化妆品中的应用。所述化妆品为膏体状产品或液体状产品或啫喱状产品，列举为面霜、乳液、精华液、爽肤水等。

与现有技术相比，本发明具有以下有益效果：

(1)本发明制备了一种水蛭素活性冻干粉，通过冷冻干燥，提高水蛭素的储藏稳定性，可在室温下储藏不小于24个月；

(2)本发明在水蛭素中添加麦芽糊精，再通过冷冻干燥，可以显著提高水蛭素透皮速度和透过率；

(3)本发明在水蛭素冻干粉中添加了人血白蛋白和/或人源胶原蛋白作为稳定剂，保护水蛭素，抵抗温度的变化对活性物质的影响，且补充皮肤流失的蛋白，锁水保湿、增强皮肤弹性；

(4)本发明的水蛭素活性冻干粉中无对皮肤刺激的防腐剂、化学助渗剂，可应用于化妆品中，具有袪斑、袪皱、促进营养物质加速吸收的作用，显著改善皮肤微循环促进新陈代谢、清洁皮肤、增强皮肤弹性。

附图说明

图1为实施例1-3以及对比例1-3的水蛭素累计透过率随时间的变化曲线。

具体实施方式

下面通过具体实施例说明，对本发明的技术方案作进一步描述说明，但并不构成对本发明的限制。如果无特殊说明，本发明的实施例中所采用的原料均为本领域常用的原料，实施例中所采用的方法，均为本领域的常规方法。

重组水蛭素：加拿大博睿集团，纯度97％，比活性为16500atu/mg；

类蛇毒肽：购自瑞德林生物，纯度为99％；

麦芽糊精：购自西安天正药用辅料有限公司；

重组人血清白蛋白：购自北京普罗吉生物科技发展有限公司；

重组人源ⅲ型胶原蛋白：购自山西锦波生物医药股份有限公司。

实施例1

本实施的水蛭素活性冻干粉原料中，每100ml水中包括：

30mg水蛭素，10mg类蛇毒肽，0.2g麦芽糊精，5g甘露醇，0.5gl-精氨酸，0.1g重组人血清白蛋白，0.1g重组人源胶原蛋白，0.63mmol磷酸氢二钠，1.37mmol磷酸二氢钠。

本实施的水蛭素活性冻干粉的制备方法为：

s1、将5g甘露醇溶于70ml水中，加入0.63mmol磷酸氢二钠和1.37mmol磷酸二氢钠，调节溶液ph为6.5，然后0.22μm孔径滤膜过滤，再高温蒸汽121℃灭菌30min，降至室温；

s2、将30mg水蛭素、10mg类蛇毒肽、0.2g麦芽糊精、0.5gl-精氨酸、0.1g重组人血清白蛋白、0.1g重组人源胶原蛋白溶于高压灭菌后的20ml水中，0.22μm孔径滤膜过滤；

s3、将步骤s1和步骤s2的溶液混合，不足体积用高压灭菌后的水补至100ml，分装于西林瓶中，然后冷冻干燥处理，得水蛭素活性冻干粉，水分含量1.25％。

实施例2

本实施的水蛭素活性冻干粉原料中，每100ml水中包括：

40mg水蛭素，15mg类蛇毒肽，0.15g麦芽糊精，4g山梨醇，0.4g组氨酸，0.15g重组人血清白蛋白，0.675mmol磷酸氢二钠，2.325mmol磷酸二氢钠。

本实施的水蛭素活性冻干粉的制备方法为：

s1、将4g山梨醇溶于75ml水中，加入0.675mmol磷酸氢二钠，2.325mmol磷酸二氢钠，调节溶液ph为6.3，然后0.22μm孔径滤膜过滤，再高温蒸汽121℃灭菌35min，降至室温；

s2、将40mg水蛭素、15mg类蛇毒肽、0.15g麦芽糊精、0.4g组氨酸，、0.15g重组人血清白蛋白溶于高压灭菌后的18ml水中，0.22μm孔径滤膜过滤；

s3、将步骤s1和步骤s2的溶液混合，不足体积用高压灭菌后的水补至100ml，分装于西林瓶中，然后冷冻干燥处理，得水蛭素活性冻干粉，水分含量1.33％。

实施例3

本实施的水蛭素活性冻干粉原料中，每100ml水中包括：

50mg水蛭素，10mg类蛇毒肽，0.4g麦芽糊精，6g海藻糖，0.5g丙氨酸，0.12g重组人源胶原蛋白，1.06mmol磷酸氢二钠，2.94mmol磷酸二氢钠。

本实施的水蛭素活性冻干粉的制备方法为：

s1、将6g海藻糖溶于80ml水中，加入1.06mmol磷酸氢二钠，2.94mmol磷酸二氢钠，调节溶液ph为6.4，然后0.22μm孔径滤膜过滤，再高温蒸汽121℃灭菌40min，降至室温；

s2、将50mg水蛭素、10mg类蛇毒肽、0.4g麦芽糊精、0.5g丙氨酸、0.12g重组人源胶原蛋白溶于高压灭菌后的15ml水中，0.22μm孔径滤膜过滤；

s3、将步骤s1和步骤s2的溶液混合，不足体积用高压灭菌后的水补至100ml，分装于西林瓶中，然后冷冻干燥处理，得水蛭素活性冻干粉，水分含量1.42％。

对比例1

对比例1为实施例1的原料制备的溶液，制备方法为：

s1、将6g海藻糖溶于80ml水中，加入1.06mmol磷酸氢二钠，2.94mmol磷酸二氢钠，调节溶液ph为6.4，然后0.22μm孔径滤膜过滤，再高温蒸汽121℃灭菌40min，降至室温；

s2、将50mg水蛭素、10mg类蛇毒肽、0.4g麦芽糊精、0.5g丙氨酸、0.12g重组人源胶原蛋白溶于高压灭菌后的15ml水中，0.22μm孔径滤膜过滤；

s3、将步骤s1和步骤s2的溶液混合，不足体积用高压灭菌后的水补至100ml，即为对比例1的溶液。

对比例2

对比例2与对比例1的区别仅在于，对比例2的原料未包括麦芽糊精，其它与对比例1相同，制得对比例2的溶液。

对比例3

对比例3与实施例1的区别在于，对比例3未加入0.2g麦芽糊精，其它与实施例1相同。

1、水蛭素活性冻干粉稳定性研究

将实施例1-3的水蛭素活性冻干粉平均分成12份。

加速试验：分别将6份实施例1-3的水蛭素活性冻干粉按上市包装放入恒温恒湿箱内，温度50℃，相对湿度75％，放置8个月，分别于0、1、2、4、6、8月取样检测，结果见表1。

长期试验：分别将6份实施例1-3的水蛭素活性冻干粉按上市包装放入恒温恒湿箱内，温度25℃，相对湿度60％，放置24个月，分别于0、5、10、15、20、24个月取样检测，结果见表1。

表1实施例1-3的水蛭素活性冻干粉稳定性试验结果

实施例1-3长期试验(温度25℃，相对湿度60％)条件下放置24个月，水蛭素活性保持稳定，说明制备的水蛭素活性冻干粉在室温下表现出较好的稳定性，可在室温下稳定保存24个月。

2、水蛭素活性冻干粉透皮试验

将实施例1-3以及对比例3的冻干粉溶于100ml蒸馏水中，得到供试液，对比例1和对比例2的溶液直接作为供试液。

渗透试验采用franz扩散法进行，有效扩散面积2.8cm²，将处理好的鼠皮固定在渗透扩散装置的供给室与接收室之间，角质层面向供给室，真皮层面向接收室。在接收室中加满生理盐水，使液面与皮肤完全接触，在供给室中加入3ml供试液，200r/min磁力搅拌，37℃恒温水浴循环。给药后开始计时，分别在10min、20min、40min、1h、2h、3h取接收液1ml，同时补加等体积的生理盐水。取得的接收液经0.22μm滤膜过滤，进hplc测定，根据水蛭素标准曲线测定接收液中的水蛭素含量，获得的水蛭素累计透过率％与时间的曲线如图1所示。

从图1可以看出，实施例1-3的水蛭素透皮速度快，透过率高。对比例3因未添加麦芽糊精导致其透皮速度相对于实施例1变慢，透过率降低，表明在水蛭素溶液中添加麦芽糊精，再经过冷冻干燥，可以显著提高水蛭素透皮速度和透过率；而对比例1和对比例2的水蛭素累计透过率％与时间的变化曲线相似，表明在水蛭素溶液中添加麦芽糊精，未经过冷冻干燥，麦芽糊精的添加对水蛭素的透皮速度和透过率没有显著影响。

本文中所述具体实施例仅是对本发明精神作举例说明，并不限定本发明的保护范围。本发明所属技术领域的技术人员可以对所描述的具体实施例做各种各样的修改或补充或采用类似的方式替代，但并不会偏离本发明的精神或者超越所附权利要求书所定义的范围。