一种用于修复海马体内线粒体功能的间充质干细胞的制作方法

本发明属于生物医药领域，具体涉及一种来自于人类的多能干细胞，尤其是具有自我更新和多向分化能力的间充质干细胞。

背景技术：

研究显示，线粒体是细胞的发电单位并在需要多能源的地方更丰富，比如骨骼和心肌等地方。线粒体的首要作用是将碳水化合物，蛋白质和脂肪代谢产物转化为二氧化碳和水并使用电子传输链的关键酶。人类线粒体蛋白质组由多种不同的蛋白质组成，其中13种由线粒体dna(mtdna)编码。迄今为止，主要通过大规模蛋白质组学，显微镜检查和计算，已鉴定出约1100种蛋白质。

线粒体功能障碍是机体衰老的主要机制之一，线粒体作为细胞的重要细胞器，在能量的产生及代谢稳态方面具有重要作用。同时，线粒体具有一种自身质量控制机制，能够降解受损的多余线粒体，从而恢复线粒体的稳态。线粒体动力学则是线粒体质量控制的关键环节，包括线粒体的融合和分裂，线粒体通过调节自身的融合及分裂过程，促进线粒体的融合再生，从而保持线粒体的正常功能。

脑衰老在人体衰老中占有重要地位，可能是全身衰老的控制中心。认知功能受脑衰老影响尤为严重，主要表现为空间记忆能力的降低，而海马作为调控学习和空间记忆的主要脑区，同样对衰老十分敏感。衰老大脑主要表现为神经元的改变，且神经元作为终末分化细胞，无法通过自身增殖分裂来清除受损的多余线粒体，因此神经元高度依赖于线粒体动力学的调节作用，从而保持自身形态结构的稳定，发挥正常的生理功能。

间充质干细胞是一种常见的多能干细胞，具有干细胞的所有共性，并主要源自未成熟胚胎结缔组织。间充质干细胞最早是从骨髓组织中分离鉴定的，并陆续从其他多种组织中分离得到，包括脂肪、脐带、脐带、胎盘、羊水、牙髓等。大量研究数据表明，间充质干细胞除了具有其他干细胞的一般特性即自我更新和多系分化潜能外，还具有免疫调节功能。间充质干细胞在体外培养时，有较好的贴附能力，形态呈成纤维细胞样，长梭形。体外能传代，早期传代时有很强的增殖能力，其增殖和扩增能力受组织来源和供体状态的影响。传代次数有较大的差异，不能无限扩增，传代到一定程度，细胞增殖能力下降。早期传代时，细胞形态无明显变化。

乳牙牙髓干细胞(stemcellsfromhumanexfoliateddeciduousteeth，shed)是早期外胚叶间充质组织头部的神经嵴细胞迁移衍生。2003年，miura等在7～8岁儿童的脱落乳牙牙髓中分离出具有高度的单克隆能力、增殖能力、体内成骨等能力的多能干细胞，并将其命名。之后，多项研究进一步表明shed具有成骨分化、成脂分化、成神经细胞分化等多向分化潜能。在不同的微环境下，shed表现出特定的分化特征，且通过改变微环境的条件，可增强或抑制其分化能力。多个前期临床实验显示，shed可通过抗炎效应、抗凋亡效应与旁分泌效应在自身免疫性疾病、骨缺损、皮肤溃疡、脊髓损伤与新生儿缺血缺氧综合征等疾病中起治疗作用。因此，越来越多的研究者专注于研究shed的分化潜能及其在疾病治疗中的作用，

目前尚未发现使用shed用于修复海马区线粒体的功能和形状及提高学习记忆能力的相关文献报道。

技术实现要素：

本发明的目的在于提供一种修复海马体内线粒体的功能和形状，进而提高学习记忆能力的方法。为解决上述技术问题，本发明第一方面提供一种间充质干细胞在制备预防或治疗与海马体内线粒体功能障碍有关疾病的药物中的用途。

优选的，所述间充质干细胞为人源间充质干细胞，优选shed。

优选的，所述线粒体功能障碍为线粒体的过度裂变和数量明显增加。

本发明的第二方面提供一种间充质干细胞在制备提高学习记忆能力的药物中的应用。

优选的，所述间充质干细胞为人源间充质干细胞，优选shed。

本发明的第三方面提供一种用于预防或治疗与海马体内线粒体功能障碍有关疾病的药物，所述药物包含间充质干细胞。

优选的，所述间充质干细胞为人源间充质干细胞，优选shed。

本发明的第四方面提供一种用于提高学习记忆能力的药物，所述药物包含间充质干细胞。

优选的，所述间充质干细胞为人源间充质干细胞，优选shed。

本发明的有益效果：

本发明意外发现，samp8小鼠经过连续shed静脉注射后，小鼠海马体内线粒体呈现出更多的椭圆形，且数量明显减少，atp的产生和膜电位增加，表明shed抑制了线粒体的过度裂变，证实shed能修复小鼠海马体内线粒体的功能和形态，预示着shed未来可以用于预防或治疗与海马体内线粒体功能障碍相关的疾病，也可以用于提高与海马体内线粒体功能相关的学习记忆能力。

附图说明

图1示出shed组与对照组小鼠海马体内线粒体的透射电镜图(tem)；

图2示出shed组与对照组小鼠海马体内线粒体功能和形状对比图，其中图2a为线粒体电子显微镜结果对比图，图2b为线粒体周长、大小、数量和圆度统计结果对比图，图2c为线粒体膜电位结果对比图，图2d为线粒体膜电位atp和jc-1统计结果对比图。

具体实施方式

试验例1、shed对小鼠海马体内线粒体功能和形状的影响

一、试验方法

1、实验samp8小鼠育种

每只老鼠8个月大，每组有20只小鼠。将动物圈养在恒定温度(22±2℃)，相对湿度55％±10％和12小时明暗周期的房间内。给动物随意喂食标准啮齿动物食物和纯净水。

2、shed注射

在受控环境中两个月，使用shed注射samp8小鼠。

3、提取海马体内的线粒体，使用透射电子显微镜观察它的形态。根据byotimecompany的试剂盒规程进行实验步骤。

3.1、准备溶液

室温缓冲试剂盒中的各种溶液，随后立即置于冰上并混匀，将1.5mlpmsf(溶剂)加入到pmsf(晶体)中，溶解并混匀，即得到1.5ml100mmpmsf，配制好的100mmpmsf溶液于-20℃保存，取适量线粒体分离试剂备用，在线粒体分离试剂加入到细胞样品中前数分钟内加入pmsf，使pmsf的最终浓度为1mm。同时，根据样品数量取适量线粒体裂解液备用，在线粒体裂解液加入到线粒体样品中前数分钟内加入pmsf，使pmsf的最终浓度为1mm。

3.2、收集细胞

3.2.1、对于贴壁细胞：用pbs洗一遍，用胰酶细胞消化液(trypsin-edtasolution)消化细胞，室温100-200g离心5-10分钟收集细胞。

3.2.2、对于悬浮细胞：直接离心收集细胞。

3.3、洗涤细胞

用冰浴预冷的pbs轻轻重悬细胞沉淀，取少量细胞用于计数，剩余细胞600g，4℃离心5分钟沉淀细胞，弃上清。

3.4、预处理

加入1-2.5ml线粒体分离试剂或临用前添加pmsf的线粒体分离试剂至2000-5000万细胞中，轻轻悬浮细胞，冰浴放置10-15分钟。

3.5、匀浆

把细胞悬液转移到一适当大小的玻璃匀浆器中，匀浆10-30次。

3.6、匀浆效果的鉴定

加入30-50微升台盼蓝染色液，混匀后显微镜下观察台盼蓝染色阳性(蓝色)细胞的比例。如果阳性细胞比例不足50％，增加5次匀浆。随后再同前取样进行台盼蓝染色鉴定。当阳性比例超过50％时即可停止匀浆进入下一步。

3.7、匀浆离心

把细胞匀浆在600g，4℃离心10分钟。

3.8、上清液离心

小心把上清转移到另一离心管中，在11,000g，4℃离心10分钟。

3.9、分离细胞线粒体

小心去除上清。沉淀即为分离得到的细胞线粒体。

4、测试线粒体膜电位。使用byotimecompany的线粒体膜电位检测试剂盒(jc-1)对从小鼠海马区组织中提取的线粒体进行jc-1测定。

4.1、根据说明书配置jc-1工作液及缓冲液，把配置好的jc-1染色工作液再稀释5倍。

4.2、0.9ml5倍稀释液的jc-1染色工作液中加入0.1ml总蛋白量为10-100μg纯化的线粒体。

4.3、用荧光酶标仪检测，激发波长设置为490nm。

4.4、将染色后的线粒体加到载玻片上，用共聚焦显微镜(leicatcssp8，德国)进行图像检测。

二、试验结果

1、线粒体形态结果对比

根据文献报道，衰老的小鼠脑细胞内，线粒体过度裂变导致线粒体整体数量增多，并且整体变小而圆。图1、图2a和2b中扫描电子显微镜结果显示，未经shed注射的小鼠海马体内线粒体呈小而圆形的形状，且数量较多；经shed注射后，小鼠海马体内线粒体呈现出更多的椭圆形，且数量明显减少，表明shed可延缓因脑细胞衰老导致的线粒体过度裂变。

2、线粒体膜电位结果对比

jc-1是一种广泛的用于检测线粒体膜电位的理想探针。在线粒体膜电位较高时，jc-1聚集在线粒体基质中成聚合物，可以产生红色荧光；在线粒体膜电位较低时，jc-1不能聚集在线粒体的基质中，此时jc-1为单体，可以产生绿色荧光。因此，通过jc-1从红色荧光到绿色荧光的转变很容易检测到细胞膜电位的下变化，常用红绿色荧光的相对比例来衡量线粒体的去极化的比例。而线粒体膜电位的下降是细胞凋亡早期的一个标志性事件。

图2c显示了shed组和ctrl组的线粒体膜电位结果对比，其中ctrl组为对照组小鼠海马区线粒体的膜电位，shed组为注射组小鼠海马区的线粒体膜电位。图2c(a)中绿色荧光表示ctrl组线粒体的低膜电位，图2c(b)中红色荧光表示ctrl组线粒体高膜电位，图2c(c)中红色和绿色荧光表示ctrl组共定位图。相应的，图2c(d)-(f)分别代表shed组线粒体的低膜电位(绿色荧光)，高膜电位(红色荧光)以及共定位图(红色和绿色荧光)。红绿荧光之比可用于表示线粒体的去极化，从图2d中jc-1值差异可明显看出shed组小鼠的线粒体膜电位显著高于ctrl组小鼠，表明shed抑制了线粒体的过度裂变。

已有研究表明，线粒体膜电位跟atp产生有密切的关系，atp产生越多线粒体膜电位越高。图2d显示了shed组和ctrl组的线粒体膜电位atp和jc-1统计结果对比，其中jc-1是对红色荧光的荧光强度进行统计。结果显示，shed组小鼠线粒体膜电位和atp产生均极显著高于ctrl组小鼠。上述结果证实，注射shed可以增强线粒体膜电位，减少海马区神经细胞的凋亡。

上述实验结果表明，shed能修复小鼠海马体内线粒体的功能和形态，预示shed未来可以用于预防或治疗与海马体内线粒体功能障碍相关的疾病，也可以用于提高与海马体内线粒体功能相关的学习记忆能力。