miR-106a-5p模拟物在制备骨缺损修复药物中的应用

本发明属于骨修复材料领域，具体为一种mir-106a-5p模拟物在制备骨缺损修复药物中的应用。

背景技术：

然而因创伤、炎症、感染、骨病或手术所致的骨质短缺，称为骨缺损。由于骨缺损的存在，常造成骨不连接，延迟愈合或不愈合，及局部的功能障碍。骨缺损在临床上发病率较高，治疗难度大，是骨科临床上的难题之一。

骨是一种具有机械运动功能和代谢功能的器官，骨稳态的维持主要依靠成骨细胞(osteoblast,ob)与破骨细胞(osteoclast,oc)之间功能的平衡以及两种细胞的互相协调，当成骨细胞功能过度活跃时骨稳态倾向于骨形成，而当破骨细胞功能过度活跃时骨稳态则偏向于骨吸收。

骨缺损修复过程包括骨的分解吸收与新骨的形成。破骨细胞负责骨分解与吸收，而成骨细胞负责新骨形成。破骨细胞贴附在旧骨区域，分泌酸性物质溶解矿物质，分泌蛋白酶消化骨基质，形成骨吸收陷窝；其后，成骨细胞移行至被吸收部位，分泌骨基质，骨基质矿化而形成新骨。成骨细胞是骨形成的主要功能细胞，主要由内外骨膜和骨髓中基质内的间充质始祖细胞分化而来，能特异性分泌多种生物活性物质，调节并影响骨的形成和重建过程。微小rna(mirna)是内源性小非编码rna，能够与靶mrna的3'utr结合，从而进一步以依赖于rna诱导的沉默复合物(risc)的方式促进mrna降解。

mirna在许多生理和病理条件下的胚胎发育，肿瘤进展，免疫调节和其他生物过程中起着至关重要的调节作用。在骨骼重塑过程中，mirna也参与多个过程，例如调节骨骼细胞的分化并介导骨骼细胞之间的细胞间通讯。首先发现mirna存在于细胞质中。最近的研究报道它们也存在于细胞外空间中，主要由于它们被包裹在细胞外囊泡(evs)中而受到保护而不受rnase降解的影响。这些rna可以通过细胞外囊泡的内在化从亲代细胞转移到受体细胞中，充当细胞间通讯工具。根据细胞外囊泡的大小大致分为两种亚型，细胞外大囊泡电动汽车(levs；也称为微囊泡)和细胞外小囊泡(sevs；也称为外泌体)，sevs的直径小于200nm，而levs通常大于200nm。在骨骼微环境中，囊泡也被认为是骨细胞之间信号转导的重要媒介。但是，还未有报导囊泡介导的mir-106a-5p在细胞间通讯的研究，其在骨骼系统中的作用更是鲜有报道，尚未见到关于mir-106a-5p在制备促进骨缺损修复药物的任何报道。

技术实现要素：

有鉴于此，本发明目的之一在于提供一种mir-106a-5p模拟物在制备骨缺损修复药物中的应用，本发明目的之二在于提供一种负载mir-106a-5p模拟物的药物载体，本发明目的之三在于提供所述药物载体在制备骨缺损修复药物中的应用，本发明目的之四在于提供一种负载mir-106a-5p模拟物的药物载体的dbm支架，本发明目的之四在于提供所述dbm支架在制备骨修复材料中的应用。为达到上述目的，本发明提供如下技术方案：

1、mir-106a-5p模拟物在制备骨缺损修复药物中的应用，所述mir-106a-5p模拟物的核苷酸序列为seqidno.1。

作为优选的技术方案之一，所述mir-106a-5p模拟物诱导成骨分化基因alp、sp7、colla1和runx2的表达。

作为优选的技术方案之一，所述诱导的方法为下调fam134a的表达，解除fam134a对alp、sp7、colla1和runx2基因表达的抑制。

2、负载mir-106a-5p模拟物的药物载体，所述mir-106a-5p模拟物的核苷酸序列为seqidno.1。

作为优选的技术方案之一，所述药物载体为细胞外小囊泡。

3、所述药物载体在制备骨缺损修复药物中的应用。

4、一种负载mir-106a-5p模拟物的药物载体的dbm支架。

5、所述dbm支架在制备骨修复材料中的应用。

本发明的有益效果在于：

mir-106a-5p模拟物在体外促进骨髓间充质干细胞bmscs向成骨分化，同时sevs可以保护mir-106a-5p模拟物不受rnase降解的影响。利用targetscan软件发现与mir-106a-5p相互作用的靶基因fam134a与成骨细胞增殖、分化相关；通过双荧光素酶报告基因、茜素红染色和荧光实时定量pcr技术等检测判断mir-106a-5p模拟物对成骨细胞分化的影响与作用机制，结果发现，mir-106a-5p通过调控fam134a促进成骨细胞分化；将包裹了mir-106a-5p模拟物的sevs负载到脱钙骨基质(dbm)支架，利用microct观察支架复合材料对颅骨缺损的修复效果，并利用ocn免疫组织化学观察修复区域的局部成骨情况，结果显示负载mir-106a-5p模拟物组颅骨缺损修复显著优于对照组，且修复区域中ocn阳性着色显著高于对照组，这表明负载mir-106a-5p模拟物的sevs可以促进成骨细胞分化成熟进而促进骨缺损修复。因此，本发明为促进骨缺损修复提供了新的研究方向。

附图说明

图1为mir-106a-5p模拟物对骨髓间充质干细胞成骨分化影响结果，a为转染mir-106a-5p模拟物的mscs细胞成骨分化14天的茜素红染色结果；b为钙沉积区域统计结果，*(p<0.05)或**(p<0.01)用于指示两组之间差异的显着性。

图2为sevs保护mir-106a-5p模拟物不受rnase降解结果图。

图3为mir-106a-5p模拟物抑制剂对成骨分化的影响结果，a为mir-106a-5p模拟物或抑制剂转导的sevs刺激下14天，mscs细胞茜素红染色结果；b为钙沉积区域统计结果。

图4为mir-106a-5p模拟物或抑制剂转导的sevs刺激下，mscs成骨分化14天后标志基因alp、sp7、colla1和runx2的表达情况，mir-nc-sevs和si-nc-sevs为对照组，mir-106a-5p-sevs表示mir-106a-5p过表达组，si-mir-106a-5p-sevs表示mir-106a-5p抑制组。

图5为双荧光报告系统检测mir-106a-5p与fam134a的靶向关系结果图，a为fam134a3'utr野生型(wt)和突变型(mut)荧光素酶报告基因载体的构建，b为与mir-106a-5p模拟物共转染后，包含fam134a3'utr的报告基因的相对荧光素酶活性，c为qrt-pcr显示fam134a在过表达或敲低mir-106a-5p的bmsc中的相对表达水平。

图6为转染fam134a和干扰fam134a质粒后，刺激mscs成骨分化14天后标志基因alp、sp7、colla1和runx2的表达情况，vehicle和si-vehicle为对照组，fam134a表示fam134a过表达组，si-fam134a表示fam134a抑制组。

图7为负载mir-106a-5psevs的dbm支架对骨缺损修复的影响结果，a为骨缺损部位microct重建图像，b为总缺损修复区域的骨形成率，骨矿物质密度(bmd)和骨体积密度(bv/tv)。

图8为骨缺损部位免疫组化分析结果，a为脱钙骨组织免疫组化染色(ocn)，b为骨表面(bs)上的成骨细胞数(n.ob)，ocn的半定量分析。

具体实施方式

下面将结合附图，对本发明的优选实施例进行详细的描述。

实施例1

mir-106a-5p模拟物对骨髓间充质干细胞成骨分化影响

合成mir-106a-5p(seqidno.1)模拟物，将mir-106a-5p模拟物转入小鼠骨髓间充质干细胞(mscs)中。具体方法如下：

转染前24小时，将适量mscs细胞接种于24孔培养板中，贴壁细胞在细胞生长至50％时进行转染。转染时，将mir-106a-5p模拟物(5ng/ml)溶于无血清培养液，同时将lipofectamine2000分散于等体积无血清培养液，并轻轻震摇5分钟，两液相混，放置20分钟。吸去细胞原培养液，换新鲜培养液(含或不含10％小牛血清)，将转染液缓缓加至培养液中，37℃孵育6-8小时。最后弃去转染液，加入完全培养液继续培养。待细胞长满后弃掉培养基，加入成骨诱导培养基诱导培养14天后，进行茜素红染色。

茜素红染色步骤：取出24孔板，弃置培养基后用pbs清洗3次，每次2min，然后用质量分数为4％的多聚甲醛固定20min，再用pbs清洗3次，每次3min，接着用茜素红s液染色10分钟，弃置染液，pbs漂洗3次后每孔加入100μlpbs观察。

结果如图1中a、b所示，转染mir-106a-5p模拟物的bmscs矿化区域面积显著高于对照组；而转染mir-106a-5p抑制剂组矿化区域面积显著降低，说明mir-106a-5p模拟物能够促进骨髓间充质干细胞成骨细胞分化。

实施例2

sevs保护mir-106a-5p模拟物不受rnase降解

差速离心法提取sevs，具体步骤如下：收集mscs细胞上清于15ml离心管中，300g，4℃，离心10min，去除死细胞；1,000g，离心15mins，弃沉淀，去除细胞碎片；3,000g，离心15mins，弃沉淀，去除凋亡小体；18,000g，离心30mins，弃沉淀，去除大细胞外囊泡；110,000g，4℃，超速离心70mins，取沉淀；pbs重悬，110,000g，4℃，超速离心70mins，沉淀即为sevs。使用exo-fect外泌体转染试剂盒(美国systembio)设计了sevs中的mir-106a-5p相对表达。再次使用上述差速离心法沉淀转染了mir-106a-5p模拟物的sevs。pbs重悬，转染了mir-106a-5p模拟物的sevs单独或与rna酶或与rna酶+triton在4℃下孵育过夜。使用trizol裂解并提取sev中的总rna，通过qpcr分析mir-106a-5p水平，重复三次。

引物序列如下：

forward：5'-gatgctcaaaaagtgcttacagtgca-3'(seqidno.2)

reverse：5'-tatggttgttctgctctctctgtctc-3'(seqidno.3)

结果如图2所示，sevs有效避免了mir-106a-5p模拟物被rnase降解。

实施例3

mir-106a-5p模拟物诱导成骨分化基因的表达

(1)mir-106a-5p模拟物抑制剂对成骨分化的影响

按照实施例2所述差速离心法提取sevs，使用exo-fect外泌体转染试剂盒(美国systembio)设计了sevs中的mir-106a-5p相对表达。再次使用上述离心方式沉淀得到转染了mirna模拟物对照片段，mir-106a-5p模拟物，mirna抑制剂对照片段以及mir-106a-5抑制剂的sevs。

组1：对照组，mirna模拟物对照的sevs，mir-nc-sevs；

组2：实验组，mir-106a-5p过表达sevs，mir-106a-5p-sevs；

组3：对照组，mirna抑制剂对照的sevs，si-nc-sevs；

组4：实验组，mir-106a-5p低表达sevs，si-mir-106a-5p-sevs；

将bmscs以1×10⁵个/孔的密度接种于24孔板，使用含有上述sevs的成骨诱导液诱导成骨分化，14天后进行茜素红染色，并统计钙沉积区域面积。或用pbs清洗3次，每孔加入500μltrizol裂解细胞，提取细胞内的总rna，实时定量rt-pcr对成骨分化标志基因alp、sp7、colla1和runx2表达进行定量检测。引物信息如下：

alp：forward，5'-aatgccatcccgtccaagacc-3'(seqidno.4)

reverse，5'-ggtacccggagtccgtatagg-3'(seqidno.5)

sp7：forward，5'-aatcctaataggccccagg-3'(seqidno.6)

reverse，5'-cctggttaccaactggccta-3'(seqidno.7)

colla1：forward，5'-ttggttcgatgcagcatagg-3'(seqidno.8)

reverse，5'-ccgtaattttcccgtatgca-3'(seqidno.9)

runx2：forward，5'-ccgtctccctattatcctgacaa-3'(seqidno.10)

reverse，5'-aagtgcttcctgggaaatgtcaa-3'(seqidno.11)

结果如图3中a、b、和图4所示，过表达mir-106a-5p的sevs刺激下，bmscs矿化面积显著增加，而干扰mir-106a-5p表达的sevs降低了bmscs的矿化水平。bmscs成骨分化标志基因alp、sp7、colla1和runx2的表达情况。

(2)双荧光报告系统检测mir-106a-5p与fam134a的靶向关系

组1：对照组，fam134a野生型质粒+mirna模拟物对照片段，fam134awt+mir-nc；

组2：对照组，fam134a突变型质粒+mirna模拟物对照片段，fam134amut+mir-nc；

组3：实验组，fam134a野生型质粒+mir106a-5p模拟物，fam134awt+mir-106a-5p；

组4：实验组，fam134a突变型质粒+mir106a-5p模拟物，fam134amut+mir-106a-5p；

为了阐明mir-106a-5p参与成骨细胞分化的具体机制，首先使用targetscan软件对潜在的靶基因进行预测，发现了mir-106a-5p与fam134a存在结合位点。

将mscs和hek293细胞以1×10⁵个/孔的密度接种于24孔板，每个处理准备3个复孔，细胞贴壁后进行瞬时转染，方法按试剂说明进行。加入新鲜成骨诱导培养基诱导细胞成骨分化后，利用promega公司pgl-3双荧光报告系统检测靶基因。将含有fam134a3’utr的报告基因质粒转染细胞，每孔分别转染1μlrna，0.05μg的报告基因质粒和0.05μg内参(ptkrl)质粒。转染24小时后弃去每孔培养液，pbs洗涤1次，加入50μlpassivelysisbuffer，室温裂解20min。分别收集每孔细胞样品。12,000rpm离心10分钟，td20/20照度计检测报告基因相对活性。比较不同报告基因间的相对活性差别，结果如图5中a、b、c所示，含有fam134a3’utr的报告基因与mir-106a-5p共转染后，其报告荧光测量值显著下降，表明mir-106a-5p与fam134a存在靶向结合关系。

(3)fam134a抑制成骨分化标志基因alp、sp7、colla1和runx2表达

实验分组：

组1：对照组，空白质粒，vehicle；

组2：实验组，fam134a过表达质粒，fam134a；

组3：对照组，无意义干扰质粒，si-vehicle；

组4：实验组，fam134a干扰质粒，si-fam134a；

采用lipofectamintm2000试剂盒，配置转染试剂。取正常培养的mscs细胞，去除旧培养基，按实验分组加入转染试剂与fam134a过表达或fam134a干扰质粒，24h后换液(amem培养基+10％胎牛血清+1％双抗)。

将mscs以1×10⁴个/孔接种于24孔板，置于37℃孵箱中培养。24h后待细胞完全贴壁后弃掉培养基，培养基成分为：a-mem培养基+10％胎牛血清+1％双抗(青霉素+链霉素)。分别按实验分组向孔板中加入新鲜诱导培养基诱导细胞成骨分化，14天后弃置培养基。用pbs清洗3次，每孔加入500μltrizol裂解细胞，提取细胞内的总rna，实时定量rt-pcr对成骨分化标志基因alp，sp7，colla1和runx2表达进行定量检测。引物信息如下：

alp,forward:5'-aatgccatcccgtccaagacc-3'(seqidno.12)

reverse:5'-ggtacccggagtccgtatagg-3'(seqidno.13)

sp7,forward:5'-aatcctaataggccccagg-3'(seqidno.14)

reverse:5'-cctggttaccaactggccta-3'(seqidno.15)

colla1,forward:5'-ttggttcgatgcagcatagg-3'(seqidno.16)

reverse:5'-ccgtaattttcccgtatgca-3'(seqidno.17)

runx2,forward:5'-ccgtctccctattatcctgacaa-3'(seqidno.18)

reverse:5'-aagtgcttcctgggaaatgtcaa-3'(seqidno.19)

结果如图6所示，与对照组相比，fam134a过表达后，成骨分化标志基因alp、sp7、colla1和runx2表达量显著下调；而干扰mir-106a-5p后，mir-106a-5p表达量较对照组显著减少，而成骨分化标志基因alp,sp7,colla1和runx2表达量显著下调。以上结果显示mir-106a-5p促进成骨分化标志基因alp、sp7、colla1和runx2表达。

实施例4

负载mir-106a-5psevs的dbm支架加速小鼠颅骨缺损修复

实验分组：

组1：对照组，未修饰的dbm支架

组2：对照组，对照mir-nc+sevs修饰的dbm支架

组3：实验组，mir-106a-5p+sevs修饰的dbm支架

组4：实验组，mir-106a-5p抑制剂+sevs修饰的dbm支架

以牛骨为原料制备脱钙骨基质(decalcifiedbonematrix，dbm)。dbm被切成2.5mm的立方体，在75％乙醇浸泡2h后，pbs清洗了三次,然后敷以10μg/ml纤连蛋白置于37℃过夜。将50μg包裹mir-106a-5p的sevs重悬在50μl培养基中，随后在37℃孵箱中与dbm共同孵育6小时后备用。

1)小鼠颅骨缺损模型建立

取20只8周龄c57bl/6j雌性小鼠，体重为25-30g。采用小鼠腹腔注射戊巴比妥钠4mg/100g麻醉。用手术刀在颅骨两侧各开一个1.5cm的矢状正中切口，用牙科钻在颅骨两侧对称各开2.5mm大小的缺损区域。手术组将mir-106a-5p修饰的dbm支架置于缺损处，对照组(sham)使用未修饰的dbm支架，缝合关闭切口。小鼠被随机分为两组，手术组(n＝10),对照组(n＝10)。手术4周后，co2处死小鼠，多聚甲醛固定，通过小动物microct对小鼠颅骨缺损结构进行分析。管电压为50kv，管电流为0.1ma，分辨率为8mm。如图7中a、b所示，负载包含mir-106a-5psevs的dbm支架材料对于颅骨缺损修复效果更优，骨形成与骨量显著多于单纯dbm支架的对照组。

2)小鼠颅骨缺损部位免疫组化染色分析

将脱钙的颅盖骨包埋在石蜡中，并用切片机将其切成5μm切片，通过ihc评估检测骨钙素和ocn的表达。首先，将切片与ocn的一抗(1：300)在4℃孵育过夜，使用含有生物素化的二抗结合显色。最后，使用光学显微镜拍摄分析切片数据。结果如图8中a、b所示，在组织学层面上，负载mir-106a-5p的dbm支架材料对于修复骨缺损部位有着更多的优势。

最后说明的是，以上实施例仅用以说明本发明的技术方案而非限制，尽管参照较佳实施例对本发明进行了详细说明，本领域的普通技术人员应当理解，可以对本发明的技术方案进行修改或者等同替换，而不脱离本技术方案的宗旨和范围，其均应涵盖在本发明的权利要求范围当中。

序列表

<110>中国人民解放军陆军军医大学第一附属医院

<120>mir-106a-5p模拟物在制备骨缺损修复药物中的应用

<160>19

<170>siposequencelisting1.0

<210>1

<211>23

<212>rna

<213>人工序列(artificialsequence)

<400>1

aaaagugcuaacagugcagguag23

<210>2

<211>26

<212>dna

<213>人工序列(artificialsequence)

<400>2

gatgctcaaaaagtgcttacagtgca26

<210>3

<211>26

<212>dna

<213>人工序列(artificialsequence)

<400>3

tatggttgttctgctctctctgtctc26

<210>4

<211>21

<212>dna

<213>人工序列(artificialsequence)

<400>4

aatgccatcccgtccaagacc21

<210>5

<211>21

<212>dna

<213>人工序列(artificialsequence)

<400>5

ggtacccggagtccgtatagg21

<210>6

<211>19

<212>dna

<213>人工序列(artificialsequence)

<400>6

aatcctaataggccccagg19

<210>7

<211>20

<212>dna

<213>人工序列(artificialsequence)

<400>7

cctggttaccaactggccta20

<210>8

<211>20

<212>dna

<213>人工序列(artificialsequence)

<400>8

ttggttcgatgcagcatagg20

<210>9

<211>20

<212>dna

<213>人工序列(artificialsequence)

<400>9

ccgtaattttcccgtatgca20

<210>10

<211>23

<212>dna

<213>人工序列(artificialsequence)

<400>10

ccgtctccctattatcctgacaa23

<210>11

<211>23

<212>dna

<213>人工序列(artificialsequence)

<400>11

aagtgcttcctgggaaatgtcaa23

<210>12

<211>21

<212>dna

<213>人工序列(artificialsequence)

<400>12

aatgccatcccgtccaagacc21

<210>13

<211>21

<212>dna

<213>人工序列(artificialsequence)

<400>13

ggtacccggagtccgtatagg21

<210>14

<211>19

<212>dna

<213>人工序列(artificialsequence)

<400>14

aatcctaataggccccagg19

<210>15

<211>20

<212>dna

<213>人工序列(artificialsequence)

<400>15

cctggttaccaactggccta20

<210>16

<211>20

<212>dna

<213>人工序列(artificialsequence)

<400>16

ttggttcgatgcagcatagg20

<210>17

<211>20

<212>dna

<213>人工序列(artificialsequence)

<400>17

ccgtaattttcccgtatgca20

<210>18

<211>23

<212>dna

<213>人工序列(artificialsequence)

<400>18

ccgtctccctattatcctgacaa23

<210>19

<211>23

<212>dna

<213>人工序列(artificialsequence)

<400>19

aagtgcttcctgggaaatgtcaa23