一种可注射水凝胶和基因工程化细胞的组合物及其治疗OA的应用

本发明涉及生物医药领域，具体涉及一种可注射水凝胶和基因工程化细胞的组合物用于治疗oa的应用。

背景技术：

骨关节炎(osteoarthritis，oa)是一种常见的慢性退行性关节疾病，全世界约有3亿人患有oa，它是造成老年人残疾的一个重要原因，oa所带来的关节疼痛、功能丧失，严重影响患者的生存质量。oa的病理特征主要表现为关节软骨退行性病变、滑膜炎症、滑膜增生、骨赘形成和软骨下骨硬化。它通常被认为是以关节软骨损伤为特征的“磨损”性疾病，然而炎症往往是与软骨损伤程度加重相关的关键因素，并影响整个关节的生理功能。其原因主要是因为关节中的炎症因子，如tnf-α和il-1β会影响软骨细胞的正常功能并促进炎症相关的分解代谢基因的表达，进而损伤软骨细胞的细胞外基质(extracellularmatrix，ecm)。

作为一个有潜力的治疗剂，adscs(adipose-derivedstemcells,adscs)最近已被广泛研究以减轻关节内炎症及减慢关节软骨损伤的进程。它们可以旁分泌出大量抗炎介质和软骨保护化合物。但本领域需要提供效果更好的治疗oa的方法和药物。

技术实现要素：

本发明的目的是提供一种具有优异的软骨、软骨下骨保护作用以及抗炎作用的用于预防和/或治疗骨关节炎的药物组合物。

本发明第一方面，提供了一种药物组合物在制备预防和/或治疗骨关节炎的药物中的用途，其中，药物组合物包括：

(a)基因工程修饰的脂肪干细胞(adscs)；和

(b)包封所述基因工程修饰的脂肪干细胞的可注射水凝胶载体，

其中，所述基因工程修饰的脂肪干细胞为过表达转化生长因子-β1(transforminggrowthfactor-β1,tgf-β1)的基因工程化脂肪干细胞(t-adscs)。

在另一优选例中，所述骨关节炎为原发性骨关节炎或继发性骨关节炎。

在另一优选例中，所述预防和/或治疗骨关节炎包括选自下组的一个或多个特征：

(a)增加骨体积，或减少骨体积的下降；

(b)提高骨体积/组织体积(bonevolume/tissuevolume，bv/tv)比；

(c)增加骨小梁数量(trabecularnumber，tb.n)，或减少tb.n的下降；

(d)减缓关节软骨病变；

(e)减缓骨质流失；

(f)提高骨密度；

(g)减缓软骨中聚集蛋白聚糖含量降低；

(h)减缓软骨中ii型胶原含量降低；

(i)减缓关节间隙内的炎性反应；和/或

(j)降低关节滑液中的tnf-α水平。

在另一优选例中，所述软骨病变包括软骨损伤、软骨细胞衰老、或其组合。

在另一优选例中，所述过表达tgf-β1的基因工程化脂肪干细胞可过表达人、大鼠和/或小鼠的tgf-β1，和/或与人、大鼠和/或小鼠的tgf-β1氨基酸序列具有至少80％、90％、95％或99％同一性的氨基酸序列。

本发明第二方面，提供了一种药物组合物，所述药物组合物包括：

(a)基因工程修饰的adscs；和

(b)包封所述基因工程修饰的adscs的可注射水凝胶载体，

其中，所述基因工程修饰的adscs为过表达tgf-β1的基因工程化adscs。

在另一优选例中，所述水凝胶由选自下组的一个或多种材料构成：聚羧甲基纤维素、海藻酸盐、羟丙基甲基纤维素、羧甲基纤维素、乙基羟乙基纤维素、羟烷基纤维素、烷基纤维素、聚乳酸、微晶纤维素、聚乳酸-羟基乙酸、糊精、羟乙基淀粉、羟乙基壳聚糖、壳聚糖、透明质酸(hyaluronicacid，ha)、胶原蛋白、明胶，以及透明质酸、胶原蛋白、明胶的衍生物。

在另一优选例中，所述水凝胶为基于ha和i型胶原蛋白(collageni，coli)的细胞基质样水凝胶。

在另一优选例中，所述水凝胶通过i型胶原蛋白的自组装和含有巯基(如-ch2ch2sh)的ha(ha-sh)的自交联制备得到。

在另一优选例中，所述水凝胶中，所述ha-sh的用量为1-5wt％，如2wt％、3wt％、3.5wt％或4wt％，以所述水凝胶总重量计。

在另一优选例中，所述ha-sh的巯基浓度为(1-5)×10^-4molg^-1，较佳地，(2-4)×10^-4molg^-1，如3×10^-4molg^-1、3.5×10^-4molg^-1、3.98×10^-4molg^-1、4×10^-4molg^-1或4.5×10^-4molg^-1。

在另一优选例中，所述ha的mw为50-200kda，较佳地，80-120kda，如80kda、100kda或110kda。

在另一优选例中，所述水凝胶中，所述i型胶原蛋的含量为0.1-2mg/ml，如0.8-1.5mg/ml、1mg/ml或1.2mg/ml，以所述水凝胶总重量计。

在另一优选例中，所述t-adscs在所述水凝胶中的含量为0.1～10×10⁶细胞/ml，较佳地，0.5～5×10⁶细胞/ml、如1×10⁶细胞/ml、2×10⁶细胞/ml、4×10⁶细胞/ml。

在另一优选例中，在相同实验条件下，与基因工程化之前的adscs相比，所述t-adscs的tgf-β1表达量提高20％以上、30％以上、40％以上、50％以上、80％以上或100％以上，以累积表达量计。

在另一优选例中，所述过表达tgf-β1的基因工程化adscs是通过tgf-β1过表达质粒dna(如pegfp-tgf-β1)转染adscs后得到的。

在另一优选例中，所述转染的递送载体为lipo2000、lipo3000、树形高分子、聚乙烯亚胺或聚(β-氨基酯)。

在另一优选例中，所述递送载体为聚(β-氨基酯)(poly(β-aminoester)，pbae)，较佳地聚(β-氨基酯)与质粒dna的质量比为10-120:1，较佳地60-90:1。

在另一优选例中，用于制备所述过表达tgf-β1的基因工程化adscs的adscs来自：自体、同种异体、异种异体，或其组合。

在另一优选例中，所述药物组合物的通过下述方法制备得到，包括步骤：

(i)提供t-adscs、ha-sh和i型胶原蛋白的混合溶液；和

(ii)将所述溶液的ph值调至7.4-8.0，反应形成水凝胶，从而得到所述药物组合物。所述t-adscs分散在所述调节ph后的溶液中。

在另一优选例中，步骤(ii)，形成水凝胶的反应条件包括以下一个或多个特征：

所述反应的温度为37±2℃，较佳地，37±1℃；和/或

所述反应的时间为1-30min，较佳地，2-8min，如3、4、5、6或7min。

在另一优选例中，所述水凝胶为在生理盐水、注射用水或中性生理性等渗磷酸缓冲液中形成的凝胶。

在另一优选例中，所述药物组合物中还包括第二治疗剂，所述第二治疗剂选自下组：抗骨质疏松症药物(如双膦酸盐类(氯膦酸盐(clodronate，骨膦)、帕米膦酸盐(pamidronate)和替鲁膦酸盐(tiludronate))、阿仑膦酸盐(alendronate，福善美，fosamax)和利塞膦酸盐(risedronate)、ibandronate(boniva)，zoledronicacid(reclast))、甲状旁腺激素，前列腺素e2、雌激素、雌激素受体调节剂、锶盐(如雷奈酸锶(srontiumranelate))、非甾体类抗炎药物(对乙酰氨基酚，双氯芬酸钠，布洛芬缓释胶囊，美洛昔康)、曲安奈德、托法替布、消炎镇痛剂、抗菌药物、抗病毒药物或其组合。

在另一优选例中，所述药物组合物为凝胶注射剂。

本发明第三方面，提供了一种基因工程修饰的adscs在预防和/或治疗骨关节炎中的用途，其中，所述基因工程修饰的adscs为过表达tgf-β1的基因工程化adscs。

在另一优选例中，所述骨关节炎为原发性骨关节炎或继发性骨关节炎。

在另一优选例中，所述t-adscs通过可注射水凝胶载体递送。

在另一优选例中，所述预防和/或治疗骨关节炎包括选自下组的一个或多个特征：

(a)增加骨体积，或减少骨体积的下降；

(b)提高骨体积/组织体积(bv/tv)比；

(c)增加骨小梁数量，或减少骨小梁数量的下降；

(d)减缓关节软骨病变；

(e)减缓骨质流失；

(f)提高骨密度；

(g)减缓软骨中聚集蛋白聚糖含量降低；

(h)减缓软骨中ii型胶原含量降低；

(i)减缓关节间隙内的炎性反应；和/或

(j)降低关节滑液中的tnf-α水平。

本发明第四方面提供了一种预防和/或治疗骨关节炎的方法，包括步骤：

将过表达tgf-β1的基因工程化adscs或包含其的药物组合物给予有需要的对象，从而预防和/或治疗骨关节炎。

在另一优选例中，给药方式为通过注射或移植施用至病变关节部位。

在另一优选例中，所述药物组合物如本发明第二方面所述。

在另一优选例中，所述对象为哺乳动物，如人、大鼠、小鼠、猴、猫或狗。

应理解，在本发明范围内中，本发明的上述各技术特征和在下文(如实施例)中具体描述的各技术特征之间都可以互相组合，从而构成新的或优选的技术方案。限于篇幅，在此不再一一累述。

附图说明

图1为本发明一个实施方式的示意图。通过ha-sh自交联和coli自组装制备可注射的ecm样水凝胶。将t-adscs包封在上述水凝胶中，通过关节腔注射或移植递送到oa模型大鼠的膝关节中。可注射可降解的水凝胶为细胞生长提供适宜的3d微环境，同时t-adscs结合了tgf-β1和adscs的治疗作用，达到有效治疗oa的目的。

图2为ha和ha-sh的¹hnmr谱图。

图3为不同配方水凝胶及其物化性质和力学性质表征。(a)水凝胶配方；(b)水凝胶从溶液到凝胶的转变示意图；(c)水凝胶从溶液到凝胶的转变时间；n＝3，**p<0.01，ns表示p>0.05；(d)水凝胶的溶胀率(qm)，n＝3，*p<0.05，***p<0.001；(e)37℃下，水凝胶在含有50uml^-1ha酶的pbs(上)和不含ha酶的pbs(下)中的体外降解曲线，n＝3；(f)上图为水凝胶的储能模量(storagemodulus，g')对频率的扫描曲线图，控制应力为1pa；下图为水凝胶的g'和损耗模量(lossmodulus，g”)的定量分析，n＝3，**p<0.01，****p<0.0001。

图4示出了37℃下，2-ha-col水凝胶的剪切稀化特性。

图5为adscs的鉴定。(a)adscs的形态(dio染细胞膜，绿色；hochest染核，蓝色)。比例尺200μm；(b，c)流式细胞术鉴定adscs表面生物标志物为cd45^-和cd90⁺；(d-f)adscs的多向分化能力鉴定，油红o、茜素红和阿尔辛蓝染色分别鉴定adscs向成脂(d)、成骨(e)和成软骨(f)谱系的分化状态，比例尺200μm。

图6示出了ha-col水凝胶可促进细胞增殖并具有良好的细胞相容性。(a)在细胞培养的第1、3和5天，包封在不同配方水凝胶中的adscs的形态；(b)培养3天后，包封在2-ha-col中的adscs的活/死染色3d重建图像(绿色代表活细胞，红色代表死细胞)；(c和d)2-ha-col水凝胶的sem图像(红色箭头指细胞)；(e和f)adscs在2-ha-col水凝胶(左)和pbs(右)中培养的活/死染色3d重建图像(e)及存活率定量统计(f)，n＝3，****p<0.0001。

图7为在2-ha-col水凝胶中培养3天后，adscs活/死染色的2d图像。比例尺200μm。

图8为各纳米粒的表征。(a)不同配方纳米粒的琼脂糖凝胶电泳条带；(b和c)不同配方纳米粒的zeta电位(b)和粒径(c)，n＝3。

图9为用于adscs转染的纳米粒配方的筛选。(a)使用pbae/质粒dna(pegfp-tgf-β1)纳米粒(质量比分别为60/1、90/1、120/1)转染adscs后，细胞内egfp的荧光表达(上)及细胞形态(下)，比例尺200μm；(b)流式细胞分析结果表明，egfp阳性细胞的百分比随着pbae/质粒dna纳米粒的质量比的增加而增加；(c)各组纳米粒的细胞毒性评估，n＝3，*p<0.05，***p<0.001。

图10为t-adscs的制备、表征和共培养实验结果。(a)使用pbae与质粒dna(pegfp-tgf-β1)纳米粒(质量比为60/1)转染adscs后，细胞内egfp的表达荧光成像，比例尺200μm；(b)egfp阳性细胞的百分比，n＝3；(c)不同时间点，通过elisa定量分析adscs和t-adscs培养上清中的tgf-β1浓度，n＝3，*p<0.05，**p<0.01；(d)pbae/质粒dna纳米粒(质量比为60/1)转染后，adscs的细胞增殖测试，n＝3，ns表示p>0.05；(e)共培养系统示意图，上层培养软骨细胞、adscs或t-adscs，下层培养软骨细胞；(f)共培养第3天，从下层培养的软骨细胞中提取的总rna的qrt-pcr分析，n＝3，*p<0.05，**p<0.01，***p<0.001。

图11示出了大鼠的手术造模过程。

图12为micro-ct分析结果。(a)动物实验设计示意图；(b和c)经pbs、adscs、t-adscs、gel+adscs或gel+t-adscs治疗后以及正常大鼠的股骨横截面图(b，红色箭头表示软骨损伤)和关节纵截面图(c，红色箭头表示软骨损伤)；(d)膝关节micro-ct扫描数据集的3d重建图(红色箭头表示软骨损伤)；(e)代表性区域的小梁骨微结构参数分析的micro-ct成像；(f和g)胫骨(f)和股骨(g)的软骨下骨bv/tv及tb.n定量分析。n＝3，*p<0.05，**p<0.01。

图13示出了经水凝胶递送的t-adscs显著降低tnf-α的表达。(a)经pbs、adscs、t-adscs、gel+adscs或gel+t-adscs治疗后以及正常大鼠的关节滑液中tnf-α的浓度分析，n＝3，*p<0.05，**p<0.01；(b)各治疗组关节滑膜组织的h&e染色，10×，比例尺200μm；40×，比例尺40μm。

图14为组织学评估结果。(a)图片展示各治疗组的股骨表面软骨的形貌(红色框)；(b和c)各治疗组关节骨组织的番红o/快速绿染色(b)和colii免疫组织化学染色(c，红色箭头表示软骨损伤)，10×图像比例尺为200μm；20×图像比例尺为100μm。

图15为pegfp-tgf-β1质粒示意图。

具体实施方式

本发明人经过广泛而深入的研究，通过大量筛选和测试，提供了一种通过可注射水凝胶递送基因工程化adscs的组合物及其用于治疗oa的应用。本发明意外地发现，与adscs相比，t-adscs能有效抑制炎症和减轻软骨、软骨下骨损伤，具有更加优异的oa的治疗效果。本发明还提供了基于ha和coli的ecm样水凝胶作为t-adscs关节腔内递送的载体，可进一步增强t-adscs对于oa的治疗效果。实验证明，凝胶递送的t-adscs显示出比其他治疗组更好的抗炎和骨保护作用。在此基础上完成了本发明。

术语

除非另有定义，否则本文中所用的全部技术术语和科学术语均具有如本发明所属领域普通技术人员通常理解的相同含义。

如本文所用，在提到具体列举的数值中使用时，术语“约”意指该值可以从列举的值变动不多于1％。例如，如本文所用，表述“约100”包括99和101和之间的全部值(例如，99.1、99.2、99.3、99.4等)。

如本文所用，术语“含有”或“包括(包含)”可以是开放式、半封闭式和封闭式的。换言之，所述术语也包括“基本上由…构成”、或“由…构成”。

如本文所用，术语“室温”或“常温”是指温度为4-40℃，较佳地，25±5℃。

骨关节炎

骨关节炎(oa)是一种以关节软骨退行性变和继发性骨质增生为特征的慢性关节疾病。又称骨关节病，退行性关节炎，老年性关节炎、肥大性关节炎等。

oa的病理特点为：关节软骨变性损坏、软骨下骨硬化或囊性病变、关节边缘骨质增生、滑膜炎症、滑膜增生、关节囊挛缩、韧带松弛或挛缩、肌肉萎缩无力等。临床表现为缓慢发展的关节疼痛、压痛、僵硬、关节肿胀、活动受限和关节畸形等。本病多见于中老年人群，好发于负重关节及活动量较多的关节，如：膝、脊柱(颈椎和腰椎)、髋、踝、手等关节。

oa包括原发性oa和继发性oa。

转化生长因子-β1

转化生长因子-β1(tgf-β1)是一种多向性、多效性的细胞因子，通过细胞表面的受体信号途径调节细胞的增殖、分化、凋亡。对细胞外基质的合成、创伤的修复、免疫功能等有重要的调节作用。如本文所用，术语“tgf-β1”可以是指如seqidno:9中定义的大鼠tgf-β1或者其活性片段，也可以是指人的tgf-β1或者其活性片段，也可以是其他种属，优选哺乳动物，如小鼠。在这里，所述的生物活性片段的含义是指作为一种多肽，其作为tgf-β1全长多肽的一部分，仍然能保持全长的多肽的全部或部分功能。通常情况下，所述的生物活性片段至少保持50％的全长多肽的活性。在更优选的条件下，所述活性片段能够保持全长多肽的60％、70％、80％、90％、95％、99％、或100％的活性。

在另一优选例中，所述tgf-β1选自人、大鼠或小鼠的tgf-β1，和/或选自与人、大鼠或小鼠的tgf-β1氨基酸序列具有至少80％、90％、95％或99％同一性的氨基酸序列。其中人、大鼠和小鼠的tgf-β1氨基酸序列是本领域技术人员已知的或可通过常规测序方法得到。

过表达tgf-β1的基因工程化adscs

如本文所用，术语“过表达tgf-β1的基因工程化adscs”、“过表达tgf-β1的基因工程化adsc(s)”、“过表达tgf-β1的adscs”、“t-adscs”、“tgf-β1基因工程化adsc”、“过表达转化生长因子-β1的基因工程化脂肪干细胞”可互换使用，指通过基于工程修饰后能够过表达tgf-β1的adscs。

本发明中，对用于制备所述t-adscs的adscs没有特别要求，可以来自自体、同种异体、异种异体，或其组合。典型地，adscs可来哺乳动物，如人、大鼠、小鼠。

如本文所用，术语“过表达”指，在相同实验条件下，相同时间内或细胞存活时间内，与基因工程化之前的adscs相比，所述t-adscs的tgf-β1表达量提高20％以上、30％以上、40％以上、50％以上、80％以上、100％以上，甚至200％以上，以累积表达量计。需要指出的，t-adscs表达的tgf-β1与形成其的adscs所表达的tgf-β1种类可以相同或不同，当两者表达的tgf-β1种类不同时，t-adscs表达的tgf-β1应以其产生的不同种类的tgf-β1总和计算。

本发明对t-adscs的制备方法没有特别要求，可采用本领域常用的基因工程的方法制备，所述方法对于本领域技术人员而言是已知的。如通过常用的过表达质粒载体和编码tgf-β1的基因片段构建tgf-β1过表达质粒并进一步递送至细胞内(可采用脂质体、纳米粒等作为递送载体)，也可以构建慢病毒过表达质粒将编码tgf-β1的基因整合到adscs的核基因组中。tgf-β1过表达质粒可使用本领域常规的方法构建或商业购得。在一个实施方式中，使用pcdna3.1(+)等能够在真核细胞中表达的载体，运载编码tgf-β1的基因片段(如seqidno:10)制备得tgf-β1过表达质粒。通常，过表达质粒中含有较强的启动子以促进目的基因的过表达。

优选地，t-adscs的制备过程应该保证adscs的细胞活性，较佳地，与转染前的adscs相比，t-adscs的细胞活性不低于80％，较佳地，不低于90％、不低于95％，甚至不低于98％。

在一个实施方式中，所述t-adscs的制备过程可包括：adscs以一定密度接种于细胞培养皿中，贴壁培养24小时，无血清转染4小时后，换用完全培养基，转染24小时后得到t-adscs。

本发明中，所述t-adscs可以为直接基因工程化形成的t-adscs，还可以为其传代细胞，只要所述传代细胞也能够过表达tgf-β1。

本发明首次发现，与adscs相比，t-adscs具有明显更优异的治疗oa的效果。

优选地，所述t-adscs通过可注射水凝胶载体递送。

可注射水凝胶载体和药物组合物及其应用

本发明中，所述t-adscs通过可注射的水凝胶作为递送载体。通常，将t-adscs分散于形成水凝胶的体系中，在形成水凝胶的同时将t-adscs包封。包封t-adscs的可注射水凝胶可通过注射或移植施用于患处。

可注射水凝胶为细胞的附着、伸展、增殖等行为提供适宜的3d微环境，与直接注射细胞相比，可显著延长细胞的存活时间、维持细胞活性，从而提高细胞在患处的治疗效果。

与仅使用t-adscs相比，负载在水凝胶内的t-adscs具有明显更优异的治疗oa的效果。更具体地，实验证明，t-adscs或包含其的药物组合物可用于(但并不限于)(a)增加骨体积，或减少骨体积的下降；(b)提高骨体积/组织体积(bv/tv)比；(c)增加骨小梁数量，或减少骨小梁数量的下降；(d)减缓关节软骨病变；(e)减缓骨质流失；(f)提高骨密度；(g)减缓软骨中聚集蛋白聚糖含量降低；(h)减缓软骨中ii型胶原含量降低；(i)减缓关节间隙内的炎性反应；和/或(j)降低关节滑液中的tnf-α水平。

本发明中，对所述可注射水凝胶载体的选择没有特别要求，可选择本领域常用的适合体内使用的水凝胶载体，只要其毒性、促进细胞黏附和增殖的能力、对细胞的保护能力、可降解性能等符合要求即可。

在另一优选例中，所述水凝胶由选自下组的一个或多种材料构成：聚羧甲基纤维素、海藻酸盐、羟丙基甲基纤维素、羧甲基纤维素、乙基羟乙基纤维素、羟烷基纤维素、烷基纤维素、聚乳酸、微晶纤维素、聚乳酸-羟基乙酸、糊精、羟乙基淀粉、羟乙基壳聚糖、壳聚糖、透明质酸(hyaluronicacid，ha)、胶原蛋白、明胶，以及ha、胶原蛋白、明胶的衍生物。

优选地，所述水凝胶为通常称为ecm样水凝胶的那些。透明质酸是关节滑液的主要成分之一，ecm样水凝胶中的组分ha可以补充关节滑液的粘弹性并为关节提供润滑作用，与t-adscs具有协同改善oa的作用。

优选地，所述水凝胶为基于ha和/或交联ha的水凝胶。较佳地，除ha或交联ha之外，所述水凝胶还包括一种或多种选自下组的凝胶改性分子(包括但并不限于)：聚羧甲基纤维素、海藻酸盐、羟丙基甲基纤维素、羧甲基纤维素、乙基羟乙基纤维素、羟烷基纤维素、烷基纤维素、聚乳酸、微晶纤维素、聚乳酸-羟基乙酸、糊精、羟乙基淀粉、羟乙基壳聚糖、壳聚糖、胶原蛋白、明胶，或其组合。

典型地，本发明提供了一种通过coli的自组装和含有巯基(如-ch2ch2sh)的ha(ha-sh)的自交联制备得到水凝胶载体。

进一步地，所述水凝胶还可包括一种或多种提供给干细胞营养物质，所述营养物质包括但并不限于：天然生长因子、盐类、糖类、蛋白成分、核酸类、维生素等成分，比如成纤维细胞生长因子(fgf)、表皮生长因子(egf)、l-谷氨酰胺、vc、vb、ve，或其组合。

向个体提供治疗有效量的t-adscs的精确量将取决于给药方式、疾病和/或病症的类型和严重程度以及个体的特征，例如一般健康状况、年龄、性别、体重和对药物的耐受性。本领域普通技术人员将能够根据这些和其他因素确定合适的剂量。当与其他治疗剂组合施用时，任何其他治疗剂的“治疗有效量”将取决于所用药物的类型。合适的剂量对于批准的治疗剂是已知的。

本发明的药物组合物或治疗剂的给药对象的实例包括哺乳动物(例如，人、小鼠、大鼠、仓鼠、兔、猫、狗、牛、绵羊、猴等)。

如本文所用，术语“预防”或“治疗”包括疾病调节治疗和对症治疗，其中任一种都可以是预防性的(即，在症状发作之前，以预防、延迟或减轻症状的严重性))或治疗性的(即，在症状发作后，为了减轻症状的严重性和/或持续时间)。本发明所述的“预防”和“治疗”包括延缓和终止疾病的进展，并不需要100％抑制、消灭和逆转。在一些实施方案中，与不存在本发明t-adscs、包含t-adscs的水凝胶或药物组合物相比，减轻、减缓、预防、抑制和/或逆转了例如至少约1％、10％、至少约30％、至少约50％、或至少约80％。

药物组合物和应用

本发明提供能力一种药物组合物，所述药物组合物包括：(a)基因工程修饰的adscs；和(b)包封所述基因工程修饰的adscs的可注射水凝胶载体，其中，所述基因工程修饰的adscs为t-adscs。

所述oa为原发性oa或继发性oa。

本发明发现，t-adscs经水凝胶载体递送至患处，可充分发挥t-adscs的治疗oa的效果，从而实现oa治疗效果最大化。实验证明，本发明的组合物不仅能够缓解炎症、保护软骨，还对软骨下骨具有明显保护作用。

更具体地，所述预防和/或治疗骨关节炎包括选自下组的一个或多个特征：

(a)增加骨体积，或减少骨体积的下降；

(b)提高骨体积/组织体积(bv/tv)比；

(c)增加骨小梁数量(tb.n)，或减少骨小梁数量的下降；

(d)减缓关节软骨病变；

(e)减缓骨质流失；

(f)提高骨密度；

(g)减缓软骨中聚集蛋白聚糖含量降低；

(h)减缓软骨中ii型胶原含量降低；

(i)减缓关节间隙内的炎性反应；和/或

(j)降低关节滑液中的tnf-α水平。

在另一优选例中，所述药物组合物还包括第二治疗剂，所述第二治疗剂包括但并不限于：抗骨质疏松症药物(如双膦酸盐类(氯膦酸盐(clodronate，骨膦)、帕米膦酸盐(pamidronate)和替鲁膦酸盐(tiludronate))、阿仑膦酸盐(alendronate，福善美，fosamax)和利塞膦酸盐(risedronate)、ibandronate(boniva)，zoledronicacid(reclast))、甲状旁腺激素，前列腺素e2、雌激素、雌激素受体调节剂、锶盐(如雷奈酸锶(srontiumranelate))、非甾体类抗炎药物(对乙酰氨基酚，双氯芬酸钠，布洛芬缓释胶囊，美洛昔康)、曲安奈德、托法替布、消炎镇痛剂、抗菌药物、抗病毒药物或其组合。

本发明的主要优点包括：

本发明利用可注射水凝胶材料递送t-adscs，具有以下突出优势：

(1)ecm样水凝胶具有促进细胞黏附、以及可调节的物化和机械性能等优点，其网状结构可以实现氧气、营养物质、代谢废物和可溶性因子的交换和流通，为adscs的附着、伸展、增殖等行为提供适宜的3d微环境；

(2)该水凝胶可注射可降解，实现了微创和安全的细胞移植；

(3)tgf-β1蛋白存在不稳定，降解快，作用时间短暂，和成药性差的缺点；而且tgf-β1蛋白价格昂贵。通过基因工程化修饰的adscs持续产生和分泌活性tgf-β1，使局部持续递送活性tgf-β1成为可能，解决了直接给药tgf-β1的临床应用困难。

(4)本发明首次发现t-adscs比adscs能有效抑制炎症和减轻骨损伤，具有更好的治疗oa的效果。

(5)本发明中所描述的基因工程修饰的adscs可以过表达和持续分泌活性tgf-β1，adscs本身也可以分泌其它多种软骨保护和抗炎介质。两者结合，为oa治疗提供更有效的治疗手段。

因此，本发明为本领域提供了安全有效的治疗oa的药物和方法。

具体实施，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，例如sambrook等人，分子克隆：实验室手册(newyork:coldspringharborlaboratorypress,1989)中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。除非另外说明，否则百分比和份数按重量计算。

材料：ha(mw＝100kda)购自bloomagefredabiopharmco.，ltd.(中国山东)。1、4-丁二醇二丙烯酸酯、4-氨基-1-丁醇和1-(3-氨基丙基)-4-甲基哌嗪购自sigma-aldrich(中国上海)。其他化学试剂购自阿拉丁(中国上海)。dmem/f12培养基、胎牛血清(fbs)、青霉素和链霉素均购自gibco(中国上海)。用于大鼠脂肪间质干细胞的成脂、成骨和成软骨诱导分化培养基购自赛业生物技术有限公司(中国苏州)。cd90和cd45抗体购自biolegend(加利福尼亚州圣地亚哥)。colii抗体、番红o/快速绿染色液和h&e染色液购自赛维尔(中国武汉)。

i型胶原蛋白：collageni,coli

ii型胶原蛋白：collagenii,colii

聚集蛋白聚糖：aggrecan,agg

细胞外基质：extracellularmatrix,ecm

表征方法

用kinexusultra+流变仪(malvern)测试水凝胶的机械性能。将制备好的水凝胶放在25mm的平行板上，间隙为500-750μm，在37℃下进行频率扫描(控制应力为1pa)。在37℃的时间扫描模式下测量线性粘度(η)，表征ha-col水凝胶的剪切稀化性能。

对于溶胀测试，将水凝胶样品(150μl，直径＝8mm，高度＝1.5mm)浸入1×pbs中于37℃温育24小时。使用滤纸将洗涤后的凝胶表面的水吸掉，精确称量溶胀水凝胶的质量(wt)。将水凝胶样品冻干称重以确定w0。通过比较wt和w0来计算溶胀率(qm)：

qm＝wt/w0

对于降解测试，在teflon模具中制备尺寸相似的各组水凝胶样品(150μl，直径＝8mm，高度＝1.5mm)。将水凝胶样品冻干，记录为初始重量w0。将干燥的水凝胶圆片浸入pbs(ph＝7.4)或含有50uml^-1ha酶(翊圣，中国)的pbs(ph＝7.4)中。使用恒温摇床(zhichuzqzy-cf，中国)将水凝胶圆形样品在37℃下以200rpmmin^-1的速度转动。在预定的时间点，将水凝胶圆形样品从溶液中取出，洗涤、冻干称重以获得wt。水凝胶失重根据下式计算：

失重(％)＝[(w0-wt)/w0]×100％

adscs的分离和鉴定：从大鼠腹股沟区脂肪组织中分离adscs，使用含有10％fbs和1％双抗的dmem/f12培养基，将adscs培养在37℃，5％co2的环境中。当细胞达到80％融合，用倒置显微镜(olympus)对adscs的形态进行拍照观察。使用流式细胞仪(bdfortessa)鉴定adscs的表面生物标记物(cd45和cd90)。通过成脂、成骨和成软骨诱导实验鉴定adscs的分化潜力。所有实验均使用第3代adscs。

软骨细胞的分离和鉴定：从大鼠关节软骨中分离出原代软骨细胞，使用含有10％fbs和1％双抗的dmem/f12培养基，将软骨细胞培养在37℃，5％co2的环境中。通过ii型胶原免疫组化鉴定软骨细胞。在所有实验中使用第1代软骨细胞。

3d培养和细胞注射实验：将adscs悬浮于ha-sh和coli混合溶液中，得到细胞浓度为1×10⁶ml^-1的细胞-水凝胶组合物。将细胞-水凝胶组合物转移至24孔板中，并在37℃下孵育，30min后，向每个孔中添加1mldmem/f12完全培养基。在预定的时间点，使用显微镜观察不同细胞-水凝胶组合物中的adscs形态并拍照。3天后，通过活/死染色分析评估所选配方水凝胶中adscs的存活情况，荧光显微镜(olympus)下观察拍照。通过细胞注射实验评价水凝胶对细胞的保护作用，37℃和5％co2的条件下，将细胞-水凝胶组合物于培养基中孵育，然后进行活/死染色。共聚焦显微镜(leica)下观察和拍照，使用悬浮在1×pbs中的adscs用作对照。使用imagej软件计算细胞存活率。

sem表征：使用sem(mira3，tescan)观察水凝胶的微观结构和水凝胶中细胞的形态。制样时，在干燥的水凝胶或细胞-水凝胶组合物的截面上喷一层5nm的金(emace600，leica)。

t-adscs的制备及转染条件的优化：通过琼脂糖凝胶电泳确定pbae与pegfp-tgf-β1质粒dna(genewiz，中国上海)的最佳质量比例。使用动态光散射分光光度计检测pbae/质粒dna纳米粒的平均粒径、粒径分布和zeta电位。为了优化转染条件，将adscs接种到24孔板中(6×10⁴个细胞/孔)。24小时后，将培养基替换为不含血清的dmem/f12，使用含有不同质量比的pbae/质粒dna纳米粒转染细胞(2μg质粒dna/孔)。4小时后，换液。24小时后，荧光显微镜下观察细胞中egfp的表达，并使用流式细胞仪确定转染效率。使用cck-8试剂盒(碧云天，中国)评估不同配方纳米粒的细胞毒性和细胞增殖。

t-adscs表达tgf-β1的评估：将adscs(2.5×10⁴个细胞/孔)接种在24孔板中。12小时后，转染细胞，荧光显微镜下观察egfp在细胞中的表达，并使用流式细胞仪定量egfp阳性细胞的比例。在不同时间点，使用elisa(欣博盛，中国)定量检测adscs和t-adscs培养上清中tgf-β1的浓度。

t-adscs和软骨细胞共培养：在共培养实验中，使用上述方法制备的t-adscs。将软骨细胞、adscs或t-adscs(2.5×10⁴个细胞/孔)接种在吊篮中，将软骨细胞(2.5×10⁴个细胞)接种在吊篮下的孔中，使用10ngml^-1il-1β的dmem/f12培养。使用没有添加il-1β的dmem/f12培养基培养的软骨细胞(吊篮和孔中均是软骨细胞)作为对照组(controlgroup)。3天后，提取各组孔板中软骨细胞的总rna，使用qrt-pcr分析各组tnf-α、colii和聚集蛋白聚糖(aggrecan,agg)mrna的相对表达水平。表1列出了qrt-pcr的引物序列，使用gapdh作为内参。

表1

手术诱导的大鼠oa模型：sd雄性大鼠(180-200g，slac实验动物有限公司，上海)饲养在上海交通大学动物中心无特定病原体的环境中，所有动物实验程序均遵守上海交通大学动物伦理委员会的指导原则。通过前十字交叉韧带横断和半月板部分切除手术在大鼠右膝上诱发继发性oa。具体步骤如下，使用1％戊巴比妥钠(40mgkg^-1)麻醉大鼠。将右后膝毛剃除并用碘伏消毒。用#11手术刀在皮肤和关节囊上切开两个切口(0.5～1cm)，直到髌骨可以侧向半脱位，露出关节腔。暴露前十字交叉韧带并用微剪刀横切，采用前抽屉试验确认前十字交叉韧带被剪断。随后，用#11刀片将半月板部分切除。完成后，将髌骨复位。用5-0可吸收缝线缝合关节囊，4-0普通缝线缝合皮肤。给大鼠腹腔注射青霉素钠，预防与手术相关的感染。手术4周后，将大鼠随机分为5组(n＝6)，对大鼠进行关节腔内注射下列各组：pbs(40μl)，adscs(5×10³个细胞/μlpbs，40μl)，t-adscs(5×10³个细胞/μlpbs，40μl)，gel+adscs(5×10³个细胞/μl水凝胶组分液，40μl)和gel+t-adscs(5×10³个细胞/μl水凝胶组分液，40μl)。未进行手术造模动物作为对照组(normal)。

tnf-α定量：关节腔注射给药4周后，处死大鼠，提取关节滑液。使用elisa(欣博盛，中国)定量检测各组动物关节滑液中的tnf-α浓度。

micro-ct：使用micro-ct(venusmicro-ct，中国平盛)对各组大鼠膝关节进行扫描(90kv，0.07ma)。使用骨成像处理与分析软件(venus，pingseng，中国)对ct图像数据集进行3d重建以及软骨下骨的骨小梁参数分析。

组织学：将各组大鼠膝关节在脱钙液中脱钙5周。将脱钙后的骨组织包埋在石蜡中，制成5nm切片，使用h&e和番红o(4％w/v)/快速绿(0.1％w/v)进行染色。使用colii免疫组织化学染色观察软骨中colii的表达。

统计分析：所有值均表示为平均值±标准差。使用graphpadprism8的学生t检验分析统计比较数据。p<0.05代表具有统计学意义。**、***和****分别表示p<0.01、p<0.001和p<0.0001。p>0.05不显著(ns)。

实施例1

ecm样水凝胶的制备与表征

本实施例利用ha-sh的自交联和coli的自组装制备ecm样水凝胶，并对不同配方水凝胶的物化和机械性能进行表征。

(1)ha-sh的合成和表征

将ha(1g)溶于100ml去离子水(deionizedwater，di-h2o)中，并将ph调节至约5.5。将n-(3-二甲基氨基丙基)-n'-乙基碳二亚胺盐酸盐(1.22g，edc)加入到所得溶液中，反应30分钟。随后，将n-羟基琥珀酰亚胺(0.73g，nhs)和半胱胺盐酸盐(1.16g)加入到反应混合物中，在ph4.8条件下，继续反应4小时。将反应产物在含有0.1mnacl的di-h2o(ph＝3.5)中透析48小时，然后在di-h2o(ph＝3.5)中透析24小时。最后，将纯化的产物冻干称重，得到ha-sh。使用400mhz¹hnmr(agilent)对ha-sh进行结构表征。¹hnmr结果表明，在2.52ppm和2.31ppm处观察到新的共振峰，代表-ch2ch2sh基团的亚甲基质子(图2)。ellman法测定，反应产物ha-sh的巯基浓度为3.98×10^-4molg^-1。

(2)不同配方水凝胶的制备和表征

使用冰冷的1×pbs配制coli溶液(1.3mgml^-1)溶液。使用600μlcoli溶液或1×pbs溶解一定量的ha-sh(ph＝8.0)。最后，将混合溶液转移到不同直径(8mm或24mm)的圆柱形teflon模具中，得到各组尺寸相近的水凝胶(高度＝1.5mm)。各组水凝胶配方及组分如图3a所示。通过倒流测试观察到所有水凝胶组分液均可在6分钟内完成溶液-凝胶转变(图3b和图3c)。较快的溶液-凝胶转变速度可以帮助adscs被均匀地包裹在水凝胶中而不会聚集。

对于溶胀测试，将水凝胶样品(150μl，直径＝8mm，高度＝1.5mm)浸入1×pbs中于37℃温育24小时。使用滤纸将洗涤后的凝胶表面的水吸掉，精确称量溶胀水凝胶的质量(wt)。将水凝胶样品冻干称重以确定w0。通过比较wt和w0来计算溶胀率(qm)：

qm＝wt/w0

溶胀率测定结果显示，ha-sh水凝胶的溶胀率随着ha质量分数的增加而降低，范围在50.2至76.2(图3d)。coli的添加降低了凝胶的溶胀率。

对于降解测试，在teflon模具中制备尺寸相似的各组水凝胶样品(150μl，直径＝8mm，高度＝1.5mm)。将水凝胶样品冻干，记录为初始重量w0。将干燥的水凝胶圆片浸入pbs(ph＝7.4)或含有50uml^-1ha酶(翊圣，中国)的pbs(ph＝7.4)中。使用恒温摇床(zhichuzqzy-cf，中国)将水凝胶圆形样品在37℃下以200rpmmin^-1的速度转动。在预定的时间点，将水凝胶圆形样品从溶液中取出，洗涤、冻干称重以获得wt。水凝胶失重根据下式计算：

wightloss(％)＝[(w0-wt)/w0]×100％

如图3e所示，4天后，2-ha水凝胶在含有ha酶的pbs中完全降解。值得一提的是，当掺入coli形成2-ha-col水凝胶，降解速率延缓。在没有ha酶的pbs中也观察到了同样的现象，超过60％的2-ha水凝胶在第6天内降解，而2-ha-col的降解量小于60％。综上，所制备的ecm样水凝胶具有生物可降解性；coli的掺入可以延缓凝胶的降解时间，并由此延长凝胶在体内的滞留时间。

使用kinexusultra+流变仪(malvern)测试水凝胶的机械性能。将制备好的水凝胶放在25mm的平行板上，间隙为500-750μm，在37℃下进行频率扫描(控制应力为1pa)。在37℃的时间扫描模式下测量线性粘度(η)，表征ha-col水凝胶的剪切稀化性能。如图3f所示，水凝胶的g′和g″随着ha质量分数增加而增加，coli的添加增加了g′和g″。在所有测试组中，2-ha水凝胶最弱，g′值为162.5pa，g″值为2.8pa。而coli的掺入使得g′以及g″显著增加，分别为206.4pa和6.9pa，这一现象可能是由于coli形成的胶原纤维增强了水凝胶网络，提高了水凝胶的力学性能。此外，ha-col还展现了剪切稀化的特性，其粘度随着剪切速率的增加而减小，这一特性使其成为一种理想的可注射细胞传递载体(图4)。

实施例2

水凝胶的细胞相容性验证

本实施例通过3d培养实验和活/死染色评估水凝胶的细胞相容性，首先，从大鼠腹股沟区脂肪组织中分离adscs，具体的分离提取步骤如下：(1)为避免提取过程中染菌，将手术器械提前高温灭菌。处死大鼠，用剃毛刀将大鼠腹股沟区域的毛剔除，将大鼠浸入75％乙醇中浸泡10min；(2)将灭菌的大鼠放置在超净工作台中，用手术剪将大鼠腹股沟区域剪开，暴露出皮下脂肪垫，使用手术刀片和镊子将脂肪组织剥离下来，浸入冷pbs中，清洗3次。剔除脂肪组织中的淋巴结、筋膜和血管，再用剪刀将脂肪组织剪成约1mm³的小颗粒，转移到离心管中；(3)向上述离心管中加入5mli型胶原酶(1.5mg/ml)，于37℃水浴中消化1h，每隔10min，将组织摇匀，至脂肪组织颗粒被消化成糊状；(4)加入5mldmem/f12完全培养基终止消化，离心(1000rpm/min，10min)，弃去上清和未消化的组织，加入5mldmem/f12完全培养基，用移液枪吹打混匀后，过70μm细胞筛网，再次离心(1000rpm/min，5min)；(5)弃上清，加入3mldmem/f12完全培养基重悬管底的细胞沉淀，计数后，按10万/ml的密度将提取分离得到的细胞接种在培养瓶中。将adscs培养在37℃，5％co2的环境中。当细胞达到80％融合，倒置显微镜(olympus)下观察adscs的形态并进行拍照。使用流式细胞仪(bdfortessa)鉴定adscs的表面生物标记物(cd45和cd90)。通过成脂、成骨和成软骨诱导实验鉴定adscs的分化潜力。所有实验均使用第3代adscs。如图5所示，提取出的细胞呈梭形，为cd90⁺(99.5％)和cd45^-(0.335％)，并能够分化为脂肪细胞、成骨细胞和软骨细胞，具有adscs的典型特征，可以满足治疗用途的需要。

在3d环境中，水凝胶的力学强度和微观结构会影响细胞与凝胶基质之间的相互作用，进而影响细胞形态、表型和功能等。与2d培养不同，细胞更倾向于在力学强度较小的3d基质内伸展、增殖，如果3d基质的力学强度过大，则会减缓细胞的伸展和增殖。本实施例使用ha-col水凝胶3d培养细胞，通过观察细胞在凝胶内的生长情况，初步评估各配方水凝胶的细胞相容性，筛选出适合细胞生长的候选水凝胶。具体实施步骤如下：将adscs悬浮于ha-sh和coli混合溶液中，得到细胞浓度为1×10⁶ml^-1的细胞-水凝胶组合物，将细胞-水凝胶组合物转移至24孔板中，并在37℃下孵育，30min后，向每个孔中添加1mldmem/f12完全培养基，在预定的时间点，使用显微镜观察不同细胞-水凝胶组合物中的adscs形态并拍照。如图6a所示，3d培养1、3、5天后，adscs在4-ha-col水凝胶基质中不能够伸展，而是保持了球形形态，且增殖较慢。而adscs在2-ha-col和3-ha-col水凝胶基质中，第1天就已开始伸展。随着时间的流逝，细胞在2-ha-col和3-ha-col水凝胶基质中明显增殖，形态上进一步伸展变长，细胞间形成了相连的网络。与3-ha-col和4-ha-col水凝胶相比，2-ha-col水凝胶更能促进adscs的伸展和增殖，有利于细胞的生长。在水凝胶中3d培养3天后，通过活/死染色分析进一步评估候选水凝胶的细胞相容性。如图6b和图7所示，荧光显微镜(olympus)下观察拍照显示，细胞在2-ha-col水凝胶基质中存活率高。基于以上结果，2-ha-col水凝胶表现了优异的细胞相容性，使用其作为细胞关节腔内递送的载体。

使用sem(mira3，tescan)观察水凝胶的微观结构和水凝胶中细胞的形态，制样时，在干燥的水凝胶或细胞-水凝胶组合物的截面上喷一层5nm的金(emace600，leica)。如图6c所示，水凝胶具有网状多孔结构，有利于被包封细胞的代谢废物、分泌因子和所需营养物质的流通。如图6d所示，在3d培养24小时后，adscs在2-ha-col基质内的附着和伸展(红色箭头所示)，这与上述3d培养白光观察结果一致，进一步验证了2-ha-col水凝胶的细胞相容性。

在细胞注射过程中，机械力的损伤以及3d支撑基质的缺乏会导致细胞存活率降低，因此，本实施例进一步评估了2-ha-col水凝胶在细胞递送中对于细胞的保护和支撑作用。具体实施步骤如下：在37℃和5％co2的条件下，将注射后的细胞-水凝胶组合物于培养基中孵育1小时，然后进行活/死染色，共聚焦显微镜(leica)下观察和拍照，使用悬浮在1×pbs中的adscs用作对照，使用imagej软件计算细胞存活率。如图6e和图6f所示，与pbs相比，水凝胶中的adscs的存活率超过96％。实验证明具有剪切稀化特性的2-ha-col水凝胶可以保护adscs免受注射过程中的机械力损伤，并在注射后为adscs提供支撑保护，提高移植细胞的存活率。

图7显示，细胞在2-ha-col水凝胶中存活率高，且伸展较好，与图6b所示的死/活染色的3d观察结果一致。

综上所述，2-ha-col水凝胶具有优异的细胞相容性、可注射性、细胞保护特性，非常适合作为adscs的关节腔内递送载体。

实施例3

t-adscs的制备和表征

首先，本实施例评估了纳米粒的转染效率和细胞毒性，筛选出最优的纳米粒，用于t-adscs的制备和表征。合成pbae作为质粒dna的递送载体，具体合成步骤如下：(1)1，4-丁二醇二丙烯酸酯(0.4g)和4-氨基-1-丁醇(0.15g)加到5ml的圆瓶中，并在室温下搅拌1min；(2)将烧瓶放入90℃的预热油浴中，搅拌24h，以制得丙烯酸酯封端的聚(4-氨基-1-丁醇-co-1,4-丁二醇二丙烯酸酯)；(3)反应后，将上一步所得的聚合物(0.5g)溶解在2ml的四氢呋喃(tetrahydrofuran，thf)中。将1-(3-氨基丙基)-4-甲基哌嗪(0.154g)加入到聚合物/thf溶液中，将获得的溶液在室温搅拌2h；(4)使用乙醚沉淀封端的聚合物，以除去未反应的1-(3-氨基丙基)-4-甲基哌嗪。随后，将所得聚合物用乙醚洗涤；(5)真空干燥至少48h，将纯化的pbae低温储存。化学结构使用¹hnmr表征，分子量使用gpc表征。

pbae/质粒dna纳米粒的制备和表征：将pbae溶解在dmso中，制成储备液(50mg/ml)，并保存在-20℃条件下。接着，用醋酸钠溶液(25mm，ph＝5)稀释pbae储备液(50mg/ml)得到一定浓度的pbae稀释液，用depc水稀释质粒dna母液得到一定浓度的质粒dna稀释液，将不同浓度的pbae稀释液加到质粒dna稀释液中，轻轻混匀，孵育10min，得到pbae/质粒dna质量比分别为30：1、60：1、90：1、120：1的纳米粒。通过琼脂糖凝胶电泳筛选适宜的pbae与质粒dna的质量比。如图8a所示，当纳米粒中的pbae与质粒dna的质量比大于等于60/1时，质粒dna被完全包封。接着，使用动态光散射分光光度计对pbae/质粒dna质量比为60/1、90/1和120/1的纳米粒的生物化学物理特性进行了表征。如图8b和8c所示，各组纳米粒的ζ电位在0-10mv、粒径在200-250nm。

通过adscs转染实验和细胞毒性实验筛选最优的纳米粒，具体实施步骤如下：将adscs接种到24孔板中(6×10⁴个细胞/孔)，24小时后，将培养基替换为不含血清的dmem/f12，使用含有不同质量比的pbae/质粒dna纳米粒转染细胞(2μg质粒dna/孔)，4小时后，换液，24小时后，荧光显微镜下观察细胞中egfp的表达，并使用流式细胞仪确定转染效率，使用cck-8评估不同配方纳米粒的细胞毒性。如图9a和9b所示，各组纳米粒转染后的adscs均表达了egfp，流式定量显示egfp阳性细胞的百分比随pbae/质粒dna质量比的增加而增加，然而，当pbae/质粒dna的质量比为120/1时，转染后，出现少量圆形的死细胞。如图9c所示，纳米粒的细胞毒性随质量比的增加而增加，当pbae/质粒dna的质量比为60/1的纳米粒的细胞相容性明显优于另外两组纳米粒。因此，综合考虑细胞转染效率和细胞毒性，本实施例使用pbae/质粒dna质量比为60/1的纳米粒转染adscs，获得t-adscs。

本实施例进一步研究了t-adscs表达tgf-β1情况，具体实施步骤如下：将adscs(2.5×10⁴个细胞/孔)接种在24孔板中，12小时后，转染细胞，荧光显微镜下观察egfp在细胞中的表达，并使用流式细胞仪定量egfp阳性细胞的比例，在不同时间点，使用elisa(欣博盛，中国)定量检测adscs和t-adscs培养上清中tgf-β1的浓度。本实施例使用的质粒dnapegfp-tgf-β1是用2a肽(一种可剪切肽)将egfp基因和tgf-β1基因连接，质粒dna上egfp基因的表达即说明了tgf-β1基因的表达。如图10a所示，转染2天后，细胞中egfp的荧光强度最强，随后逐渐减弱，在第5天，仍可观察到细胞中egfp的表达。这一现象与流式定量检测结果一致，转染2天后，有52.8±0.99％的egfp阳性细胞，egfp阳性细胞比例逐渐下降，值得一提的是，在第5天仍有20％的egfp阳性adscs，证明筛选出的pbae/质粒dna纳米粒对adscs具有良好的转染效果(图10b)。为了进一步考察不同时间点t-adscs的tgf-β1的表达量，使用elisa检测了t-adscs培养上清中的tgf-β1浓度。如图10c所示，转染后第1、2、3、4天，t-adscs培养上清中的tgf-β1表达水平显著高于adscs组，在5天内，t-adscs的累计表达量高出adscs53.1％。细胞增殖实验显示，各时间点t-adscs组的吸光度(od)值与对照组(control)没有显著性差异，表明筛选出的用于制备t-adscs的纳米粒具有良好的细胞相容性(图10d)。

综上所述，本实施例优化筛选出了对adscs具有良好的转染效率和细胞相容性pbae/质粒dna(质量比60/1)纳米粒，可高效、安全地用于t-adscs的制备。所制备的t-adscs能持续表达和分泌tgf-β1。

实施例4

共培养实验和qrt-pcr定量

本实施例利用transwell共培养系统研究t-adscs对oa样软骨细胞的旁分泌保护作用(图10e)。具体实施步骤如下：首先，从大鼠关节软骨中分离出原代软骨细胞，使用含有10％fbs和1％双抗的dmem/f12培养基，将软骨细胞培养在37℃，5％co2的环境中，所有实验均使用第1代软骨细胞。然后，使用实施例3中所述方法制备t-adscs，将软骨细胞、adscs或t-adscs(2.5×10⁴个细胞/孔)接种在吊篮中，将软骨细胞(2.5×10⁴个细胞)接种在吊篮下的孔中，使用10ngml^-1il-1β(oa微环境中的关键促炎细胞因子)的dmem/f12培养。使用没有添加il-1β的dmem/f12培养基培养的软骨细胞(吊篮和孔中均是软骨细胞)作为对照组(controlgroup)。3天后，提取各组孔板中软骨细胞的总rna，使用qrt-pcr分析各组tnf-α、colii和aggmrna的相对表达水平。表1列出了qrt-pcr的引物序列，使用gapdh作为内参。qrt-pcr定量结果显示，与对照组(control)相比，il-1β组软骨细胞的colii和aggmrna的表达分别显著下降了94.0％和96.0％，而tnf-αmrna的表达则被上调了166.3倍(图10f)。il-1β+adscs组的软骨细胞的colii和aggmrna的表达水平与il-1β组相比没有显著性差异，而基因工程修饰后的adscs的旁分泌作用增强，il-1β+t-adscs组软骨细胞的colii和aggmrna的表达水平分别比il-1β组高3.268倍和1.934倍。另外，il-1β+t-adscs组软骨细胞的tnf-α表达被下调了83.06％，显著优于il-1β+adscs组(被下调了69.56％)。以上结果证明，t-adscs对oa样软骨细胞的旁分泌保护作用增强，为t-adscs的体内应用提供了支持。

实施例5

体内研究

本实例在sd大鼠oa模型上评估adscs、t-adscs、凝胶包封的adscs以及凝胶包封的t-adscs的oa治疗效果。将sd雄性大鼠(200g，slac实验动物有限公司，上海)饲养在上海交通大学动物中心无特定病原体的环境中，所有动物实验程序均遵守上海交通大学动物伦理委员会的指导原则。通过前十字交叉韧带横断和半月板部分切除手术在大鼠右膝上诱发继发性oa。具体实施步骤如图11所示，使用1％戊巴比妥钠(40mgkg^-1)麻醉大鼠，将右后膝毛剃除并用碘伏消毒；用#11手术刀在皮肤和关节囊上切开两个切口(0.5～1cm)，直到髌骨可以侧向半脱位，露出关节腔，暴露前十字交叉韧带并用微剪刀横切，采用前抽屉试验确认前十字交叉韧带被剪断，随后，用#11刀片将半月板部分切除。完成后，将髌骨复位，用5-0可吸收缝线缝合关节囊，4-0普通缝线缝合皮肤。给大鼠腹腔注射青霉素钠，预防与手术相关的感染。手术4周后，将大鼠随机分为5组(n＝6)，在第四周和第六周对大鼠进行关节腔内注射下列各组：pbs(40μl)，adscs(5×10³个细胞/μlpbs，40μl)，t-adscs(5×10³个细胞/μlpbs，40μl)，gel+adscs(5×10³个细胞/μl水凝胶组分液，40μl)和gel+t-adscs(5×10³个细胞/μl水凝胶组分液，40μl)，评估各治疗组的抗炎和软骨保护作用(图12a)。未进行手术造模动物作为对照组(normal)。

在首次关节腔注射4周后，使用micro-ct(venusmicro-ct，中国平盛)对各组大鼠膝关节进行扫描(90kv，0.07ma)。使用骨成像处理与分析软件(venus，pingseng，中国)对ct图像数据集进行3d重建以及软骨下骨的骨小梁参数分析。2d图像显示pbs治疗组大鼠的软骨有明显损伤(红色箭头所示)(图12b和图12c)。各治疗组大鼠关节的micro-ct扫描3d重建图也证实了上述观察结果，与pbs治疗组相比，细胞或凝胶+细胞治疗组可能够明显减轻软骨损伤(图12d)。以上结果表明，ecm样水凝胶可以协同增强细胞对于oa的治疗作用。

oa不仅会影响关节软骨，还会影响软骨下骨的微结构，造成软骨下骨bv/tv和tb.n的减少。因此，本实施例进一步分析了感兴趣区域的胫骨和股骨的骨小梁micro-ct扫描图像，来评估各治疗组对软骨下骨微结构的影响(图12e)。如图12f和12g所示，与正常组(normal)相比，pbs治疗组大鼠的胫骨和股骨的bv/tv分别下降了38.2％和17.2％，胫骨和股骨的tb.n也分别下降了26.4％和29.6％，骨质明显流失。然而，在细胞或凝胶+细胞治疗后，骨质流失情况得到缓解，gel+t-adscs治疗组大鼠的胫骨bv/tv比pbs组高22.9％，并且显著高于t-adscs或gel+adscs组。对于大鼠胫骨和股骨的tb.n，定量结果显示，gel+t-adscs治疗组组分别比pbs组高28.6％和42.1％。在所有治疗组中，gel+t-adscs具有最优的减缓软骨下骨骨质流失的作用。

在oa关节内，软骨细胞、成骨细胞、单核细胞和滑膜组织产生的促炎细胞因子，尤其是tnf-α，会驱动关节内的炎性级联反应，引起关节的持续疼痛和oa病情的恶化。本实施例在关节腔注射给药4周后，处死大鼠，提取关节滑液，使用elisa(欣博盛，中国)定量检测各组动物关节滑液中的tnf-α浓度来评估各治疗组的抗炎作用。如图13a所示，与pbs组相比，细胞或凝胶+细胞治疗组均显著降低了大鼠关节滑液中的tnf-α浓度。在各治疗组中，t-adscs的抗炎作用显著优于adscs，与pbs组相比，经t-adscs治疗后的大鼠，关节滑液中tnf-α的浓度降低了44.6％。另外，与pbs组相比，gel+t-adscs治疗后，大鼠关节滑液中tnf-α的浓度降低了49.4％，显著优于gel+adscs和adscs治疗组，显示出最佳的抗炎作用。关节滑膜组织h&e染色也证明了上述发现，如图13b所示，与normal组相比，pbs治疗组的大鼠关节滑膜组织中有大量的炎性细胞浸润。然而，经细胞或凝胶+细胞治疗后，大鼠关节滑膜组织中的炎性细胞浸润减少，gel+t-adscs治疗组的炎症细胞浸润最少，因而具有最强的抗炎治疗作用。

本实施例也对股骨关节软骨的形貌和关节骨组织的病变情况进行了观察，如图14a所示，pbs治疗组的大鼠的关节软骨厚度明显降低，损伤明显(红色框内所示)，表现出典型的oa样软骨病变特征。经adscs、t-adscs、凝胶包封的adscs或凝胶包封的t-adscs治疗后，oa大鼠的软骨病变症状得到缓解。而且，凝胶+细胞治疗组的软骨厚度明显比仅细胞治疗组厚。将各组大鼠膝关节在脱钙液中脱钙5周。再将脱钙后的骨组织包埋在石蜡中，制成5nm切片，使用h&e和番红o(4％w/v)/快速绿(0.1％w/v)进行染色。如图14b所示，pbs治疗组大鼠的关节软骨表层甚至中部的agg(橙色)含量明显降低。而细胞或凝胶+细胞治疗组中的软骨退化的严重程度则要轻得多，这些治疗组显示出比pbs治疗组更高的agg含量，具体表现为染色区域着色更深，厚度更大。在所有治疗组中，gel+t-adscs组着色最深，因而其具有最佳的减缓oa大鼠关节软骨中agg含量下降的效果。使用免疫组织化学染色进一步评估关节骨组织的colii(软骨ecm含量的重要组成成分)表达。如图14c所示，pbs处理组中colii含量严重降低(着色浅)，与番红o/快速绿染色结果一致，在所有治疗组中，gel+t-adscs治疗组大鼠的关节软骨浅表和中部区域的染色明显较深，关节软骨组织的着色面积更大，显示出最佳的减缓oa大鼠关节软骨中colii表达降低的作用。

综上所述，体内实验结果表明，在各治疗组中，gel+t-adscs具有最优的抗炎和关节软骨保护效果，有效减缓oa病情发展。在宏观水平上，如关节的micro-ct扫描3d重构图和股骨关节软骨的形貌所示，gel+t-adscs明显减缓关节软骨病变和骨质流失。在微观水平上，组织学染色显示gel+t-adscs组炎性细胞浸润较少，关节滑液中tnf-α浓度明显降低，抗炎效果更佳，且关节软骨基质中的agg和colii的含量较高。gel+t-adscs优异的oa治疗效果可归因于以下几点：(1)ecm样水凝胶在注射过程中和注射后为细胞提供保护和支持，从而提高了移植细胞的存活率；(2)tgf-β1基因工程化的adscs增强了adscs的旁分泌作用，进而有效的抑制了炎症及炎症相关的软骨细胞退行性变化；(3)ecm样水凝胶中的组分ha可以补充关节滑液的粘弹性并为关节提供润滑，进而减轻oa症状。

3结论

本发明开发了一种可注射ecm样水凝胶递送t-adscs的药物组合物及其用于治疗oa的用途。本发明的水凝胶具有优异的细胞相容性，可以在注射过程中和注射后为细胞提供保护和支持。

此外，通过基因工程改造的方法使得adscs过表达tgf-β1。共培养结果表明，t-adscs对oa样软骨细胞发挥增强的旁分泌作用。在治疗4周后，如micro-ct和组织学分析所示，注射载有t-adscs的ecm样水凝胶可减少软骨退行性病变，而且优于仅使用细胞或包封adscs的水凝胶组。除软骨外，本发明的药物组合物还具有保护软骨下骨的作用，例如，可显著增加软骨下骨的tb.n和减缓软骨下骨骨质流失。

此外，如关节滑膜组织的h&e染色所示，包封t-adscs的水凝胶组在所有测试组中显示出最佳的体内抗炎作用。综上所述，本发明提供了一种安全方便的策略，通过ecm样水凝胶递送基因工程改造的adscs来协同改善oa的治疗效果。

本发明实施例所用的tgf-β1过表达质粒为一pegfp-tgf-β1质粒，其组成如图15所示，相关序列总结于下表2：

表2

在本发明提及的所有文献都在本申请中引用作为参考，就如同每一篇文献被单独引用作为参考那样。此外应理解，在阅读了本发明的上述讲授内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。

序列表

<110>上海交通大学

<120>一种可注射水凝胶和基因工程化细胞的组合物及其治疗oa的应用

<130>p2021-0406

<160>14

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<213>大鼠(rattusnorvegicus)

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