一种改善胰岛素抵抗的诺丽酵素提取物的制备方法及其应用

本发明涉及保健品
技术领域：
，特别涉及一种改善胰岛素抵抗的诺丽酵素提取物的制备方法及其应用。
背景技术：
：诺丽(noni)，又称海巴戟(morindacitrifolial.)，是茜草科(rubiaceae)巴戟天属morindal.植物。在太平洋群岛，海巴戟在民间广为应用，2000多年前就被用来治疗疾病，素有“仙果”之美称。诺丽是一种可加工成食品的植物，由于其对人体健康的明显有益作用而被广泛研究。诺丽酵素具有多种活性成分，主要包括苯丙素类、糖苷类、萜类、酚酸及其衍生物类等。近年来，有研究表明诺丽酵素可降低糖化血红蛋白水平，增强胰岛素敏感性，诺丽酵素乙酸乙酯提取物具有α-葡萄糖苷酶抑制活性，但是诺丽酵素基于改善胰岛素抵抗诱导的抗糖尿病作用鲜有研究报道。2012年lee，s.y等人撰写的《antidiabeticeffectofmorindacitrifolial.asatreatmentofdiabetesmellitus》，公开了使用清曲酱与诺丽共同发酵，获得的诺丽酵素可降低糖化血红蛋白水平，增强胰岛素敏感性，并公开了诺丽酵素70％乙醇提取物能够激活过氧化物酶体增殖物，激活受体-γ，并通过刺激活化蛋白激酶刺激葡萄糖摄取。2019年第18期《中国中药杂志》上记载张斌等人撰写的《诺丽发酵液的化学成分研究》，公开了诺丽酵素乙酸乙酯提取物中含有对α-葡萄糖苷酶有抑制作用的化合物，α-葡萄糖苷酶抑制剂是通过抑制肠黏膜上的α-葡萄糖苷酶，减缓肠道内葡萄糖的吸收速度，降低餐后血糖含量。胰岛素抵抗是2型糖尿病发生和发展的关键环节，是产生糖尿病、高脂血症、高尿酸血症、心血管疾病的共同发病基础。胰岛素抵抗使得胰岛素促进葡萄糖摄取和利用的效率下降，机体代偿性的分泌过多胰岛素，以维持血糖的稳定。药物是治疗胰岛素抵抗的有效手段，但能够直接改善胰岛素抵抗的药物仅有二甲双胍和噻唑烷二酮类，且长期服用会产生耐药性或心衰等副作用。特别是体内长期在高糖的影响下，产生明显的氧化应激反应，诱导产生胰岛素抵抗。因此，寻找高效、低毒的改善胰岛素抵抗的药物具有重要意义。技术实现要素：针对上述问题，本发明提出一种改善胰岛素抵抗的诺丽酵素提取物的制备方法及其应用。本发明所述一种改善胰岛素抵抗的诺丽酵素提取物的制备方法，包括以下步骤：用乙酸乙酯萃取诺丽酵素，萃取结束后，去除乙酸乙酯层，取剩余溶液进行减压蒸馏，得诺丽酵素提取物。进一步的，所述萃取的次数为3～4次，料液体积比为(1～3):1。进一步的，所述减压蒸馏在-0.095mpa～-0.15mpa的压力和30℃～40℃的温度下进行。进一步的，所述诺丽酵素的制备方法，包括以下步骤：(1)预处理：将成熟诺丽果的表皮洗净干净，沥干水份后切片，得诺丽果片；(2)发酵：将诺丽果片、糖和水放入发酵容器中，密封放置于阴凉处发酵，在发酵的第25～30天加入糖化酶和双歧乳杆菌(bifidobacterium)，继续密封发酵；(3)发酵管理：在发酵的30天内，每天搅拌1～2次，在发酵的第30～35天，加入醋；(4)待发酵结束后，过滤，收集滤液，得诺丽酵素。进一步的，所述诺丽果片、糖和水的质量比为(3～5):1:(10～14)进一步的，所述诺丽果片、糖和水的总体积占发酵容器体积的80～85％。进一步的，所述糖为蔗糖、果糖和葡萄糖中的至少一种。进一步的，所述阴凉处为温度15～20℃、相对湿度50～70％的荫蔽环境。进一步的，所述糖化酶的加入量为0.5～1.5g/l；所述双歧乳杆菌的加入量为0.1～0.16g/l。进一步的，所述醋为白醋。进一步的，所述白醋的加入量为诺丽果片、糖和水混合物体积的1～5％。进一步的，所述一种改善胰岛素抵抗的诺丽酵素提取物用于制备抗胰岛素抵抗的药物、预防糖尿病的保健品和/或治疗糖尿病的药物的应用。进一步的，所述糖尿病为2型糖尿病。与现有技术相比，本发明的有益效果是：本发明的一种改善胰岛素抵抗的诺丽酵素提取物能够显著促进细胞内葡萄糖的摄取，并同时促进细胞外葡萄糖的消耗，有益于调控细胞内外葡萄糖的平衡，从而起到改善胰岛素抵抗的作用，可以用于制备抗胰岛素抵抗的药物或预防糖尿病的保健品；而且本发明诺丽酵素提取物改善胰岛素抵抗的作用优于诺丽酵素原液和诺丽酵素乙酸乙酯提取物，可为胰岛素抵抗和糖尿病的治疗提供更优的选择。本发明诺丽酵素的制备方法，利用诺丽果的共生菌种进行自然发酵，通过在发酵前期搅动发酵液，在发酵中期加入糖化酶和双歧乳杆菌，使诺丽果片能够充分发酵，在发酵后期加入醋防止发酵液酒化，提高诺丽酵素的质量，进而提高诺丽酵素提取物改善胰岛素抵抗的作用，避免诺丽有效成分被酒化以及酒化产物对诺丽酵素提取物促进细胞内葡萄糖摄取的作用效果产生影响。附图说明图1各组对hepg2细胞内葡萄糖摄取的影响。图2各组对hepg2细胞外葡萄糖消耗的影响。具体实施方式为了更好理解本发明技术内容，下面提供具体实施例，对本发明做进一步的说明。本发明实施例所用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。本发明实施例所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。实施例1一种改善胰岛素抵抗的诺丽酵素提取物的制备方法，包括以下步骤：在室温条件下，用乙酸乙酯萃取诺丽酵素，乙酸乙酯和诺丽酵素的体积比为1：3，萃取3次，萃取结束后，去除乙酸乙酯层，取剩余溶液在-0.125mpa的压力和35℃的温度下，进行减压蒸馏，得诺丽酵素提取物。该诺丽酵素的制备方法，包括以下步骤：(1)预处理：将成熟诺丽果的表皮洗净干净，沥干水份后切片，得诺丽果片；(2)发酵：将诺丽果片、蔗糖和水按3:1:10的质量比放入发酵容器中，密封放置于在温度18℃、相对湿度60％的荫蔽环境进行发酵，在发酵的第28天加入糖化酶和双歧乳杆菌，继续密封发酵；其中，诺丽果片、蔗糖和水混合后的体积占发酵容器体积的80％；糖化酶的加入量为0.8g/l；双歧乳杆菌的加入量为0.12g/l；(3)发酵管理：在发酵的30天内，每天搅拌1次，在发酵的第30天，加入诺丽果片、蔗糖和水的混合物体积3％的白醋；(4)待发酵结束后，过滤，收集滤液，得诺丽酵素。实施例2一种改善胰岛素抵抗的诺丽酵素提取物的制备方法，包括以下步骤：在室温条件下，用乙酸乙酯萃取诺丽酵素，乙酸乙酯和诺丽酵素的体积比为1：1，萃取4次，萃取结束后，去除乙酸乙酯层，取剩余溶液在-0.095mpa的压力和30℃的温度下，进行减压蒸馏，得诺丽酵素提取物。该诺丽酵素的制备方法，包括以下步骤：(1)预处理：将成熟诺丽果的表皮洗净干净，沥干水份后切片，得诺丽果片；(2)发酵：将诺丽果片、果糖和水按4:1:12的质量比放入发酵容器中，密封放置于温度15℃、相对湿度50％的荫蔽环境进行发酵，在发酵的第30天加入糖化酶和双歧乳杆菌，继续密封发酵；其中，诺丽果片、果糖和水混合后的体积占发酵容器体积的85％；糖化酶的加入量为0.5g/l；双歧乳杆菌的加入量为0.1g/l；(3)发酵管理：在发酵的30天内，每天搅拌2次，在发酵的第35天，加入诺丽果片、果糖和水混合物体积5％的白醋；(4)待发酵结束后，过滤，收集滤液，得诺丽酵素。实施例3一种改善胰岛素抵抗的诺丽酵素提取物的制备方法，包括以下步骤：在室温条件下，用乙酸乙酯萃取诺丽酵素，乙酸乙酯和诺丽酵素的体积比为1：3，萃取3次，萃取结束后，去除乙酸乙酯层，取剩余溶液在-0.125mpa的压力和35℃的温度下，得诺丽酵素提取物。该诺丽酵素的制备方法，包括以下步骤：(1)预处理：将成熟诺丽果的表皮洗净干净，沥干水份后切片，得诺丽果片；(2)发酵：将诺丽果片、蔗糖和水按3:1:10的质量比放入发酵容器中，密封放置于在温度18℃、相对湿度60％的荫蔽环境进行发酵，在发酵的第28天加入糖化酶和双歧乳杆菌，继续密封发酵；其中，诺丽果片、蔗糖和水混合后的体积占发酵容器体积的80％；糖化酶的加入量为0.8g/l；双歧乳杆菌的加入量为0.12g/l；(3)发酵管理：在发酵的30天内，每天搅拌1次；(4)待发酵结束后，过滤，收集滤液，得诺丽酵素。对比例1一种诺丽酵素的制备方法，包括以下步骤：(1)预处理：将成熟诺丽果的表皮洗净干净，沥干水份后切片，得诺丽果片；(2)发酵：将诺丽果片、蔗糖和水按3:1:10的质量比放入发酵容器中，密封放置于在温度18℃、相对湿度60％的荫蔽环境进行发酵，在发酵的第28天加入糖化酶和双歧乳杆菌，继续密封发酵；其中，诺丽果片、蔗糖和水混合后的体积占发酵容器体积的80％；糖化酶的加入量为0.8g/l；双歧乳杆菌的加入量为0.12g/l；(3)发酵管理：在发酵的30天内，每天搅拌1次，在发酵的第30天，加入诺丽果片、蔗糖和水的混合物体积3％的白醋；(4)待发酵结束后，过滤，收集滤液，得诺丽酵素。对比例2一种诺丽酵素乙酸乙酯提取物的制备方法，包括以下步骤：在室温条件下，用乙酸乙酯萃取诺丽酵素，乙酸乙酯和诺丽酵素的体积比为1：3，萃取3次，萃取结束后，将乙酸乙酯层减压浓缩，得诺丽酵素乙酸乙酯提取物。该诺丽酵素的制备方法，包括以下步骤：(1)预处理：将成熟诺丽果的表皮洗净干净，沥干水份后切片，得诺丽果片；(2)发酵：将诺丽果片、蔗糖和水按3:1:10的质量比放入发酵容器中，密封放置于温度18℃、相对湿度60％的荫蔽环境进行发酵，在发酵的第28天加入糖化酶和双歧乳杆菌，继续密封发酵；其中，诺丽果片、蔗糖和水混合后的体积占发酵容器体积的80％；糖化酶的加入量为0.8g/l；双歧乳杆菌的加入量为0.12g/l；(3)发酵管理：在发酵的30天内，每天搅拌1次，在发酵的第30天，加入诺丽果片、蔗糖和水的混合物体积3％的白醋；(4)待发酵结束后，过滤，收集滤液，得诺丽酵素。对比例3一种改善胰岛素抵抗的诺丽酵素提取物的制备方法，包括以下步骤：在室温条件下，用乙酸乙酯萃取诺丽酵素，乙酸乙酯和诺丽酵素的体积比为1：3，萃取3次，萃取结束后，去除乙酸乙酯层，取剩余溶液在-0.125mpa的压力和35℃的温度下，进行减压蒸馏，得诺丽酵素提取物。该诺丽酵素的制备方法，包括以下步骤：(1)预处理：将成熟诺丽果的表皮洗净干净，沥干水份后切片，得诺丽果片；(2)发酵：将诺丽果片、蔗糖和水按3:1:10的质量比放入发酵容器中，密封放置于温度18℃、相对湿度60％的荫蔽环境进行发酵，在发酵的第24天加入糖化酶，继续密封发酵；其中，诺丽果片、蔗糖和水混合后的体积占发酵容器体积的80％；糖化酶的加入量为0.8g/l；(3)发酵管理：在发酵的30天内，每天搅拌1次，在发酵的第30天，加入诺丽果片、蔗糖和水的混合物体积3％的白醋；(4)待发酵结束后，过滤，收集滤液，得诺丽酵素。试验例1诺丽酵素提取物对细胞内葡萄糖摄取的影响实验分为8组，分别为空白组(con)、模型组(mod)、阳性对照组(罗格列酮，rosi)、实施例1、实施例3、对比例1(诺丽酵素原液)和对比例2(诺丽酵素乙酸乙酯提取物)。本实验除空白组外，其余各组均利用50mm高糖培养hepg2细胞，诱导胰岛素抵抗。hepg2细胞贴壁后，孵育各实验组药物进行干预48h。其中，con组细胞孵育5.5mm低糖培养基；mod组细胞孵育50mm高糖培养基，诱导发生胰岛素抵抗；rosi组细胞孵育50mm高糖培养基，同时加入阳性药罗格列酮溶液30μm，作为阳性对照；由实施例1、3和对比例1-2中制备得到的诺丽酵素提取物、诺丽酵素原液和诺丽酵素乙酸乙酯提取物进行等量取样，用50mm高糖培养基配制终剂量为400μg/ml进行细胞孵育，得到实施例1组、实施例3组、对比例1组和对比例2组。然后各组细胞分别换上含25μm的2-nbdg溶液，37℃孵育20min。最后，利用流式细胞仪检测荧光强度，统计实验数据。2-nbdg荧光探测示踪剂是葡萄糖类似物，可被细胞作为葡萄糖吸收，实验中主要通过观察细胞摄取2-nbdg后发出的荧光强度评估细胞对葡萄糖的摄取情况。每组设6个重复，其结果见表1；表1细胞内葡萄糖摄取量检测结果(注：与空白组(con)比较：#p<0.05；与模型组(mod)比较：*p<0.05，**p<0.01)由上表可以看出，发生胰岛素抵抗的模型组(mod)细胞与空白组(con)相比，其葡萄糖摄取量显著降低，而阳性对照组(rosi)细胞的培养基中加入30μm罗格列酮后，显著改善了这种状况，可以显著促进细胞对葡萄糖的摄取，且与con组细胞的葡萄糖摄取量相当。同时发现，由本发明制备所得的诺丽酵素提取物与mod组相比，在400μg/ml剂量下也可以显著促进葡萄糖的摄取(**p<0.01)，但仍低于con组。即本发明所制得的诺丽酵素提取物具有一定的促进细胞内葡萄糖摄取的能力。与实施例1对比可以看出，实施例3在制备诺丽酵素时未加醋，制备的诺丽酵素质量差，仍可以促进细胞对葡萄糖的摄取，但效果较实施例1差；对比例1中采用诺丽酵素原液，与mod组相比，其对细胞内的葡萄糖摄取有一定的促进作用，但没有显著性差异；对比例2中采用诺丽酵素乙酸乙酯提取物，与mod组相比，其对细胞内的葡萄糖摄取有一定的促进作用，但没有显著性差异，表明本发明诺丽酵素提取物改善葡萄糖摄取的能力优于诺丽酵素原液和诺丽酵素乙酸乙酯提取物。对比例3的密封发酵方法与本申请不同，使用其发酵所得的诺丽酵素制备所得诺丽酵素提取物对细胞内葡萄糖摄取有促进作用，但促进效果不显著。试验例2诺丽酵素提取物对细胞外葡萄糖消耗的影响实验分组同试验例1，共分为8组。hepg2细胞孵育各实验组药物的方法同试验例1，孵育48h。孵育结束后，利用葡萄糖测定试剂盒(葡萄糖氧化酶法)和酶标仪测定各组细胞培养基中的吸光度(od)值的减少量，从而获得各组细胞葡萄糖消耗量。每组设6个重复，其结果见表2；表2细胞外葡萄糖消耗量检测结果葡萄糖消耗量(od值)实施例10.47±0.04**实施例30.43±0.05*对比例10.31±0.03#对比例20.26±0.04#对比例30.30±0.05#con0.58±0.02mod0.24±0.05#rosi0.56±0.03**(注：与空白组(con)比较：#p<0.05；与模型组(mod)比较：*p<0.05，**p<0.01)由表2可知，发现胰岛素抵抗的mod组细胞与con组细胞相比，其葡萄糖消耗量显著减少，而rosi阳性对照组的细胞显著地改善了葡萄糖消耗量的降低。同时结果显示，本发明实施例组与mod组实验结果相比，实施例组细胞外葡萄糖的消耗量也显著增加了，且与con组细胞的葡萄糖消耗量相当，但实施例3组的消耗量较实施例1少，表明本发明诺丽酵素提取物可以显著促进细胞外的葡萄糖消耗。由实施例1和对比例1对比可知，对比例1中的诺丽酵素原液有一定的促进葡萄糖消耗的作用，但与mod组相比没有统计学显著性差异，说明本发明诺丽酵素提取物促进葡萄糖消耗的作用优于诺丽酵素原液。由实施例1和对比例2对比可知，对比例2中的诺丽酵素乙酸乙酯提取物有促进葡萄糖消耗的作用，但与mod组相比没有差异，说明本发明诺丽酵素提取物促进葡萄糖消耗的作用优于诺丽酵素乙酸乙酯提取物。由实施例1和对比例3对比可知，对比例3的密封发酵方法与本申请不同，使用其发酵所得的诺丽酵素制备所得诺丽酵素提取物对促进葡萄糖消耗有一定作用，但促进效果不显著，但与mod组相比没有统计学显著性差异。综上，由试验例1和试验例2结果可知，实施例1的诺丽酵素提取物可以显著促进细胞内葡萄糖的摄取和细胞外葡萄糖的消耗，即诺丽酵素提取物可以明显改善高糖诱导的细胞胰岛素抵抗作用，本发明诺丽酵素提取物的改善胰岛素抵抗作用优于诺丽酵素原液和诺丽酵素乙酸乙酯提取物。以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。当前第1页12