一种兽用抗腹泻中药组合物及其制备方法

本发明涉及兽药技术领域，具体涉及了一种兽用抗腹泻中药组合物及其制备方法。

背景技术：

腹泻是兽医临床中常见病证，为一种全身性的病理状态，影响着机体多个脏器，以腹泻为主症的急慢性肠炎、肠易激综合征、胃肠功能紊乱等多种消化道疾病皆属于中医学的“泄泻”范畴，并认为脾虚及湿盛是其基本病机，各种畜禽四季均可发生，其病程迁延反复，兽医临床上动物多出现慢性腹泻、体瘦毛焦、精神倦怠，饲料利用率降低下的症状，对动物生产性能和动物产品质量造成较大影响，危害着畜禽养殖业的健康发展，大量研究证实，脾虚泄泻会损伤肠道黏膜结构和功能，从而使黏膜屏障不能正常发挥选择通透性的功能，致使营养物质无法有效消化吸收，同时肠黏膜结构的破坏引发肠黏膜通透性增高，继而肠道病原微生物入侵机体，引发感染或全身反应，严重的会导致死亡，肠黏膜通透性能直接或间接反映肠黏膜屏障的功能状态，如d-la和dao作为反映肠黏膜通透性的重要指标，健康状态下，血清中d-la和doa水平极低，只有肠黏膜组织受到损伤后，导致肠黏膜的通透性增加，肠道中d-la及dao才会通过受损黏膜进入黏膜下层的淋巴组织或血液从而引起血清中d-la和doa水平升高；siga作为肠黏膜免疫中的重要效应分子，起着抗感染和免疫调节的重要作用，当肠黏膜受损通透性增加，则siga及相应的细胞因子分泌异常；紧密连接作为肠黏膜机械屏障的重要组成部分，是肠上皮细胞间精细的复合蛋白网络，将肠上皮细胞紧密的连接在一起，调控着物质的跨膜转运，是肠黏膜屏障发挥选择通透性的重要基础，肠黏膜屏障的结构及功能的完整性，对机体健康有着重要的作用。

目前，在治疗牛羊腹泻过程中长期不合理使用化学类药物、抗生素类药物等会加速肠道病原菌耐药性的产生，并且现代药物制剂和治疗成本较高，因此会给临床治疗带来困难，而中药作为含有多种有效活性成分的纯天然药物，具有低残留、低毒性、不易产生耐药性等优势，并且研究表明中药制剂、单味中药和中药有效成分对腹泻治疗有着独特的疗效，使抗腹泻中药成为抗腹泻药物研究领域的热点。

技术实现要素：

本发明的目的之一在于提供一种兽用抗腹泻中药组合物，目的之二在于提供一种兽用抗腹泻中药组合物的制备方法。

本发明的兽用抗腹泻中药组合物，按重量份计，所述中药组合物由如下组分组成：茯苓20份、白术20份、苍术12份、党参16份、陈皮9份、盐泽泻6份、炮姜4份。

本发明的兽用抗腹泻中药组合物的制备方法，包括如下步骤：

s1、取茯苓、白术、苍术，将其混合后粉碎为粗粉，第一次加入一定量的75％乙醇浸泡1h，之后再次加入一定量的75％乙醇，加热回流提取一段时间，重复三次，合并醇提液，回收醇提液中乙醇至无醇味，获得提取液；

s2、取一定量的1％壳聚糖溶液加入到s1步骤中获得的提取液中，静止一段时间后过滤，获得醇提液ⅰ；

s3、向s1步骤中药渣加入一定量的水并煮至微沸，持续一段时间后收集滤液，再加入同量的水并至微沸，持续相同的时间后收集滤液，合并两次滤液，将滤液浓缩为0.5g/ml，再加入乙醇至滤液含醇量为60％，静置一段时间后，获得滤液，将滤液中乙醇回收，获得水提液ⅱ；

s4、将s2步骤中获得醇提液ⅰ和s3步骤水提液ⅱ合并为提取液ⅲ，并加入一定量的聚山梨酯80于提取液ⅲ中，再向提取液ⅲ中加入一定量无水乙醇，静置一段时间后过滤，回收乙醇，获得滤液ⅳ；

s5、向s4步骤中获得的滤液ⅳ中加入一定苯甲酸钠，获得滤液ⅴ，将滤液ⅴ的ph值调至7后定容至生药浓度为1g/ml，灭菌，即可。

作为本发明的进一步改进，所述s1步骤中第一次加入的75％乙醇量和第二次加入的75％乙醇量均为粗粉质量的四倍，加热回流提取时间为2h。

作为本发明的进一步改进，所述s2步骤中壳聚糖溶液与s1步骤中的提取液的体积比6：100，静置时间为12h，静置温度保持在4℃。

作为本发明的进一步改进，所述s3步骤中加入的水量为药渣质量的8倍，沸腾时间持续2h，静置时间为12h，静置温度保持在4℃。

作为本发明的进一步改进，所述s4步骤中聚山梨酯80与提取液ⅲ的体积比为1:100，无水乙醇与提取液ⅲ的体积比为1:4，静置时间为12h，静置温度保持在4℃。

作为本发明的进一步改进，所述s5步骤中苯甲酸钠与滤液ⅳ的体积比为5：1000。

作为本发明的进一步改进，所述白术采用土炒方法炮制，所述苍术采用麸炒方法炮制。

与现有技术相比，本发明的有益效果如下：

1、本发明中兽用抗腹泻中药组合物具备良好的止泻、抗炎和镇痛效果，该中药组合物能有效提升结肠黏膜中il-4、siga的水平，降低tnf-α和ifn-γ的水平，发挥免疫调节作用；上调脾虚泄泻证大鼠肠黏膜claudin-1、occludin、zo-1mrna的表达量，有效改善脾虚泄泻证大鼠结肠黏膜组织损伤的修复，降低肠黏膜的通透性，发挥保护肠黏膜屏障的作用，通过抑制促炎性细胞因子的合成与释放来平衡促炎因子与抗炎因子在血清中的表达水平，抑制过度炎症反应，进而发挥对机体的保护作用。

2、该中药组合物遵循湿去则脾运有权的理论，其方由茯苓，土炒白术配伍利水渗湿、补气行气等药组成，茯苓甘淡、健脾渗湿，配以白术甘温，健脾益气、燥湿，两药配用，通守结合，健运脾气从而使水湿之邪得化，茯苓、白术配伍，茯苓渗湿从小便而去，白术健脾运化水湿，一渗一健，标本兼治，以燥湿、行气药为辅，辛温醒脾，理气行滞，配茯苓增强中焦湿浊的消除之功，再佐以利水渗湿，使中焦之湿得有归处，再配温中之药以缓中焦之痛，上药皆能辅佐君、臣药，以增强健脾理气，渗湿止泻的功效。

3、该兽用抗腹泻中药组合物制备工艺简单，易操作，且成本低，适合工业化生产。

附图说明

此处所说明的附图用来提供对本申请的进一步理解，构成本申请的一部分，本申请的示意性实施例及其说明用于解释本申请，并不构成对本申请的不当限定，在附图中：

图1为siga标准曲线图；

图2为2il-4标准曲线图；

图3为tnf-α标准曲线图；

图4为γ标准曲线图；

图5为“兽用抗腹泻中药组合物”对脾虚泄泻大鼠结肠occludin基因mrna相对表达量的影响柱状图；

图6为“兽用抗腹泻中药组合物”对脾虚泄泻大鼠结肠claudin-1mrna的相对表达量的影响柱状图；

图7为“兽用抗腹泻中药组合物”对脾虚泄泻大鼠结肠zo-1mrna的相对表达量的影响柱状图；

图8为兽用抗腹泻中药组合物对脾虚泄泻证大鼠结肠黏膜组织结构变化的影响显微镜下观察照片组，其中a为空白对照组、b为病理模型组、c为阳性药物对照组、d为兽用抗腹泻中药组合物高剂量组、e为兽用抗腹泻中药组合物中剂量组、f为兽用抗腹泻中药组合物低剂量组。

具体实施方式

以下将以图式揭露本发明的多个实施方式，为明确说明起见，许多实物上的细节将在以下叙述中一并说明，然而，应了解到，这些实物上的细节不应用以限制本发明，也就是说，在本发明的部分实施方式中，这些实物上的细节是非必要的，此外，为简化图式起见，一些习知惯用的结构与组件在图式中将以简单的示意的方式绘示之。

另外，在本发明中如涉及“第一”、“第二”等的描述仅用于描述目的，并非特别指称次序或顺位的意思，亦非用以限定本发明，其仅仅是为了区别以相同技术用语描述的组件或操作而已，而不能理解为指示或暗示其相对重要性或者隐含指明所指示的技术特征的数量，由此，限定有“第一”、“第二”的特征可以明示或者隐含地包括至少一个该特征，另外，各个实施例之间的技术方案可以相互结合，但是必须是以本领域普通技术人员能够实现为基础，当技术方案的结合出现相互矛盾或无法实现时应当认为这种技术方案的结合不存在，也不在本发明要求的保护范围之内。

一种兽用抗腹泻中药组合物，按重量份计，并由如下组分组成：茯苓20份、白术20份、苍术12份、党参16份、陈皮9份、盐泽泻6份、炮姜4份。

一种兽用抗腹泻中药组合物的制备方法，包括如下步骤：

s1、取茯苓、白术、苍术，将其混合后粉碎为粗粉，第一次加入一定量的75％乙醇浸泡1h，之后再次加入一定量的75％乙醇，加热回流提取一段时间，重复三次，合并醇提液，回收醇提液中乙醇至无醇味，获得提取液；

s2、取一定量的1％壳聚糖溶液加入到s1步骤中获得的提取液中，静止一段时间后过滤，获得醇提液ⅰ；

s3、向s1步骤中药渣加入一定量的水并煮至微沸，持续一段时间后收集滤液，再加入同量的水并至微沸，持续相同的时间后收集滤液，合并两次滤液，将滤液浓缩为0.5g/ml，再加入乙醇至滤液含醇量为60％，静置一段时间后，获得滤液，将滤液中乙醇回收，获得水提液ⅱ；

s4、将s2步骤中获得醇提液ⅰ和s3步骤水提液ⅱ合并为提取液ⅲ，并加入一定量的聚山梨酯80于提取液ⅲ中，再向提取液ⅲ中加入一定量无水乙醇，静置一段时间后过滤，回收乙醇，获得滤液ⅳ；

s5、向s4步骤中获得的滤液ⅳ中加入一定苯甲酸钠，获得滤液ⅴ，将滤液ⅴ的ph值调至7后定容至生药浓度为1g/ml，灭菌，即可。

s1步骤中第一次加入的75％乙醇量和第二次加入的75％乙醇量均为粗粉质量的四倍，加热回流提取时间为2h。

s2步骤中壳聚糖溶液与s1步骤中的提取液的体积比6：100，静置时间为12h，静置温度保持在4℃。

s3步骤中加入的水量为药渣质量的8倍，沸腾时间持续2h，静置时间为12h，静置温度保持在4℃。

s4步骤中聚山梨酯80与提取液ⅲ的体积比为1:100，无水乙醇与提取液ⅲ的体积比为1:4，静置时间为12h，静置温度保持在4℃。

s5步骤中苯甲酸钠与滤液ⅳ的体积比为5：1000。

白术采用土炒方法炮制，所述苍术采用麸炒方法炮制。

测试本发明兽用抗腹泻中药组合物的止泻效果：

以盐酸洛哌丁胺作阳性对照药，观察实施例1中制备的兽用抗腹泻中药组合物对番泻叶致小鼠腹泻的干预治疗效果以及肠推进试验，探讨实施例1中制备的兽用抗腹泻中药组合物止泻的部分机制。

止泻试验：选取体质量合格的昆明小鼠50只，雌雄各半，按体质量随机分成5组，每组10只，分别为空白组，兽用抗腹泻中药组合物低剂量组(0.5g/kg·体重)、中剂量组(1.0g/kg·体重)、高剂量组(2.0g/kg·体重)，盐酸洛哌丁胺对照组，每次灌胃体积为0.2ml/10g，灌胃1次/天，其中空白组每天给予相同剂量的生理盐水灌胃，兽用抗腹泻中药组合物组和盐酸洛哌丁胺组预先给药3天，末次给药前禁食(不禁水)12h，末次给药30min后，每只小鼠100％番泻叶水煎剂0.4ml灌胃，随后将每只小鼠单独放于铺有白纸的鼠笼之内，每隔2h换垫纸1次，统计垫纸上湿粪多少表示泄泻次数(湿粪指近似圆形的糊状软粪，在垫纸上呈现棕色环带)，分别统计0-2h,2-4h,4-6h三个时项的泄泻次数及6h内泄泻累计次数。

试验结果表明，在同一时相内兽用抗腹泻中药组合物高、中剂量组与盐酸洛哌丁胺组小鼠腹泻次数明显减少，与空白对照组之间相比差异显著(p﹤0.05)，且兽用抗腹泻中药组合物高剂量组在4-6h时相内与空白对照组相比差异极显著(p﹤0.01)，与盐酸洛哌丁胺组比较，兽用抗腹泻中药组合物高剂量组与中剂量组小鼠腹泻次数皆无显著差异(p﹥0.05)；与盐酸洛哌丁胺组比较，兽用抗腹泻中药组合物低剂量组在4-6h时相内小鼠腹泻次数显著增加(p﹤0.05)，见表1。

表1：兽用抗腹泻中药组合物对番泻叶致小鼠腹泻的影响。

注：1.同列数据肩标不同小写字母表示差异显著(p<0.05)，大写字母表示差异极显著(p<0.01)；相同字母表示差异不显著(p>0.05)；2.每两小时为一个时相。

(2)肠推进试验选取体质量合格的昆明小鼠50只，雌雄各半，按体质量随机分成5组，每组10只，分别为空白组、兽用抗腹泻中药组合物低剂量组(0.5g/kg·体重)、中剂量组(1.0g/kg·体重)、高剂量组(2.0g/kg·体重)和盐酸洛哌丁胺对照组,给药剂量与“1.4.2”给药方式相同，对应给药30min后，各组采用炭末阿拉伯胶混悬液灌胃，剂量0.2ml/只，30min后全部脱颈椎处死，打开腹腔，分离肠系膜，剪取幽门至回盲部间的肠管，不加牵引呈直线置于托盘之上，测量肠管长度作为“小肠总长度”，以幽门至炭末在肠管前沿的距离作为“炭末肠道内的推进距离”，以此计算炭末在肠道内的推进率。

炭末推进率＝炭末在肠道内推进距离(cm)/小肠全长(cm)×100％。

试验结果表明，兽用抗腹泻中药组合物高剂量组和盐酸洛哌丁胺组均能有效缩短小肠推进距离，与空白对照组相比较，兽用抗腹泻中药组合物高剂量对小肠炭末推进距离显著缩短(p﹤0.01)；与盐酸洛哌丁胺组比较，兽用抗腹泻中药组合物高剂量组的小肠炭末推进距离差异不显著(p﹥0.05)，兽用抗腹泻中药组合物中、低剂量组的小肠炭末推进距离差异显著(p﹤0.05)见表2。

表2：兽用抗腹泻中药组合物对小鼠小肠推进的影响。

注：1.同列数据肩标不同小写字母表示差异显著(p<0.05)，大写字母表示差异极显著(p<0.01)；相同字母表示差异不显著(p>0.05)。

测试本发明兽用抗腹泻中药组合物的抗炎效果：

以地塞米松作阳性对照药，观察实施例1中制备的兽用抗腹泻中药组合物对二甲苯致小鼠耳廓肿胀，以及观察运用“破气+苦下+饥饱失常”法致大鼠脾虚泄泻，测定其结肠黏膜siga、il-4、tnf-α和ifn--γ的含量的影响，探讨实施例1中制备的兽用抗腹泻中药组合物抗炎的部分机制。

(1)兽用抗腹泻中药组合物对小鼠耳廓肿胀的影响：

选取体质量合格的昆明小鼠50只，雌雄各半，按体质量随机分成5组，每组10只，分别为空白对照组，兽用抗腹泻中药组合物低剂量组(0.5g/kg·体重)、中剂量组(1.0g/kg·体重)、高剂量组(2.0g/kg·体重)和地塞米松组，兽用抗腹泻中药组合物高剂量组、中剂量组、低剂量组和地塞米松组每次灌胃体积均为0.2ml/10g，灌胃1次/天，空白对照组灌胃给予同体积的生理盐水，预先连续给药3天，1次/天，末次给药1h后于右耳双面涂二甲苯，剂量0.03ml/只，30min后脱颈处死，用6mm打孔器沿小鼠左右耳廓相同位置打下圆耳片于分析天平上立即称其重量，以左、右耳廓圆片重量差作为肿胀度，并分别根据公式计算小鼠耳廓肿胀率及抑肿率。

肿胀率＝(右耳片重量－左耳片重量)/左耳片重量×100％。

抑肿率＝(空白组耳廓肿胀度－给药组耳廓肿胀度)/空白组耳廓肿胀度×100％。

二甲苯致小鼠耳廓肿胀30min后，在同一时相内兽用抗腹泻中药组合物高剂量组和地塞米松组对二甲苯致炎的小鼠耳肿胀均有显著抑制作用，与空白对照组比较，兽用抗腹泻中药组合物高剂量组可明显改善炎性小鼠耳廓肿胀度，差异显著(p﹤0.05)；与地塞米松组比较，兽用抗腹泻中药组合物高剂量组对小鼠耳廓肿胀的抑制作用则无显著差异(p﹥0.05)，见表3。

表3：兽用抗腹泻中药组合物对二甲苯致小鼠耳廓肿胀率的影响。

注：同列数据肩标不同小写字母表示差异显著(p<0.05),相同字母表示差异不显著(p>0.05)。

(2)兽用抗腹泻中药组合物对大鼠抗炎因子的影响：

以参苓白术散为阳性药物对照组，40只健康sd大鼠适应性喂养7天后，随机分为空白对照组、脾虚泄泻证病理模型组(简称：模型组)、兽用抗腹泻中药组合物组(20g/kg·体重)与阳性药物对照组(10g/kg·体重)，除空白对照组外，其余各组均采用“破气+苦下+饥饱失常”法进行大鼠脾虚泄泻证模型复制，按照4ml/200g体重灌服造模药液，每日两次，持续42天。

干预14天后，各组末次给药后禁食禁水24h，无菌采集大鼠近端结肠2cm，用0.9％生理盐水清洗干净，刮取肠黏膜，加入0.01mol/lpbs制成匀浆，4℃3000r/min离心10min，取上清液，放入标记好的离心管中，采用elisa法用相应试剂盒检测肠黏膜中免疫因子il-4、tnf-α、ifn-γ和siga的水平，测定样本不同指标的od值，并根据标准品的浓度与od值绘制标准曲线，计算出对应的样品浓度。

①兽用抗腹泻中药组合物组对脾虚泄泻证大鼠结肠黏膜siga分泌水平的影响。

与空白对照组相比，模型组结肠黏膜中siga的水平显著下降(p﹤0.05)；兽用抗腹泻中药组合物组干预后，siga的水平显著升高(p﹤0.05)，但与阳性药物对照组相比差异不显著(p﹥0.05)，详见表4和图1。

表4：兽用抗腹泻中药组合物对脾虚泄泻证大鼠结肠黏膜siga分泌水平的影响：

注：a表示与空白对照组相比，差异显著(p﹤0.05)；b表示与模型组相比，差异著性(p﹤0.05)；c表示与阳性药物对照组相比，差异显著(p﹤0.05)；下同。

②兽用抗腹泻中药组合物对脾虚泄泻证大鼠结肠黏膜il-4的影响：

与空白对照组相比，模型组结肠黏膜中il-4的水平显著下降(p﹤0.05)；兽用抗腹泻中药组合物组干预后，il-4的水平显著升高(p﹤0.05)，但与阳性药物组相比差异不显著(p﹥0.05)，详见表5和图2。

表5：兽用抗腹泻中药组合物对脾虚泄泻证大鼠肠结肠黏膜il-4的影响：

③兽用抗腹泻中药组合物对脾虚泄泻证大鼠结肠黏膜tnf-α的影响：

与空白对照组相比，模型组结肠黏膜中tnf-α的水平显著升高(p﹤0.05)；兽用抗腹泻中药组合物干预后，tnf-α的水平显著下降(p﹤0.05)，但与阳性药物对照组相比差异不显著(p﹥0.05)，详见表6和图3。

表6：兽用抗腹泻中药组合物对脾虚泄泻证大鼠结肠黏膜tnf-α的影响：

④兽用抗腹泻中药组合物对脾虚泄泻证大鼠结肠黏膜ifn-γ的影响：

与空白对照组相比，模型组结肠黏膜中ifn-γ的水平显著升高(p﹤0.05)；兽用抗腹泻中药组合物干预后，ifn--γ的水平显著下降(p﹤0.05)，但与阳性药物对照组相比差异不显著(p﹥0.05)，详见表7和图4。

表7：“苓术散”对脾虚泄泻证大鼠结肠黏膜ifn--γ的影响：

测试本发明兽用抗腹泻中药组合物的镇痛效果：

以布洛芬作阳性对照药，观察实施例1中制备的兽用抗腹泻中药组合物对热板刺激致小鼠的疼痛后舔足时间的干预作用，研究中兽用抗腹泻中药组合物镇痛的效果。

将恒温水浴锅加热到(55.0±0.5)℃，烧杯的底部接触水面，加热后作为热板刺激，用秒表记录小鼠自投入烧杯至出现舔后足的时间，作为该鼠的痛阈值，取体质量18～22g的雌性小鼠，预先测定每只小鼠的正常痛阈值，凡舔足时间小于5s或大于30s的跳跃者弃之不用，共测2次，取其平均值，选出50只小鼠，随机分为5组，分别为空白对照组、兽用抗腹泻中药组合物低剂量组(0.5g/kg·体重)、中剂量组(1.0g/kg·体重)、高剂量组(2.0g/kg·体重)和布诺芬组，给药剂量及给药方式同上，连续给药3天，1次/天，末次给药1h后，测量各组小鼠痛阈值，若60s仍无反应，将小鼠取出，以免烫伤，其痛阈值以60s为一阶段单位计算，各组小鼠测量3次，每次间隔15min，最后计算其平均值。

与空白对照组相比较，兽用抗腹泻中药组合物高剂量组、中剂量组、低剂量组小鼠舔足时间均明显延长，且差异显著(p﹤0.05)；与布洛芬组相比较，兽用抗腹泻中药组合物高剂量组、中剂量组小鼠舔足时间均无显著差异(p﹥0.05)，见表8。

表8：兽用抗腹泻中药组合物对小鼠耐热疼痛阈值的影响：

注：同列数据肩标不同小写字母表示差异显著(p<0.05),相同字母表示差异不显著(p>0.05)。

测试本发明兽用抗腹泻中药组合物对动物结肠黏膜紧密连接蛋白claudin-1、occludin和zo-1mrna的相对表达量的影响：

以参苓白术散作为阳性对照药物，运用荧光定量pcr(real-timepcr)法检测各组大鼠结肠紧密连接蛋白claudin-1、occludin和zo-1mrna相对表达量的变化，探讨实施例1中制备的兽用抗腹泻中药组合物对脾虚泄泻证结肠黏膜机械屏障屏障的保护机制。

40只健康sd大鼠适应性喂养7天后，随机分为空白对照组、脾虚泄泻证病理模型组(简称：模型组)、抗腹泻中药组合物组与阳性药物对照组，采用“破气+苦下+饥饱失常”法进行大鼠的脾虚泄泻证模型复制，即均按照4ml/200g体重灌服造模药液，每日两次，持续42天。

造模完成后次日进行干预治疗，空白对照组与模型组：按照4ml/200g体重灌服生理盐水，兽用抗腹泻中药组合物高、中、低剂量组：按照4ml/200g体重灌服抗腹泻中药组合物阳性药物对照组，按照4ml/200g体重灌服阳性对照药液水煎剂，每日1次，持续14天。

无菌分离结肠，使用solarbio的triquickreagent试剂提取法抽提结肠组织中的总rna，hifiscriptgdnaremovalrtmastermix试剂盒进行rna的纯化与反转录合成cdna，取1μlgdnaremovermix，一定量rnatemplate和适量rnase-freewater建立10μlcdna第一链的合成体系，再取cdna第一链的合成体系10μl，5×hifiscriptrtmaster4μl，rnase-freewater6μl，建立逆转录反应体系，cdna合成反应条件：37℃孵育15min，85℃孵育5s，反应结束后，短暂离心后放置于冰上，再进行后续反应或放于-20℃保存备用。

将反转录得到的cdna进行荧光定量pcr，以gapdh基因作为内参基因，建立20μl荧光定量pcr反应体系：95℃预变性2min；95℃变性30s，50℃～65℃退火30s，72℃延伸30s，共40个循环；72℃延伸5min，定量采用2-△△ct法计算，目的基因和引物见表1，pcr反应体系见表9和表10。

表9：real-timepcr引物

表10：real-timepcr反应体系

①兽用抗腹泻中药组合物对脾虚泄泻大鼠结肠occludin基因mrna相对表达量的影响：

与空白对照组比较，模型组结肠黏膜紧密连接蛋白occludin基因mrna表达量显著下降(p﹤0.05)；与模型组比较，兽用抗腹泻中药组合物高、中、低剂量组和阳性药物对照组的大鼠occludin基因mrna表达量显著升高(p﹤0.05)；与阳性药物对照组比较，兽用抗腹泻中药组合物高、中、低剂量组的大鼠occludin基因的mrna表达量差异不显著(p﹥0.05)，见图5。

②兽用抗腹泻中药组合物对脾虚泄泻证大鼠结肠claudin-1基因mrna相对表达量的影响：

与空白对照组比较，模型组结肠黏膜紧密连接蛋白claudin-1基因mrna相对表达量显著下降(p﹤0.05)；与模型组比较，兽用抗腹泻中药组合物组高、中、低剂量组和阳性药物对照组大鼠的claudin-1基因mrna表达量显著升高(p﹤0.05)；与阳性药物对照组比较，兽用抗腹泻中药组合物中剂量组大鼠的claudin-1基因mrna表达量显著升高(p﹤0.05)，而高、低剂量组则则差异不显著(p﹥0.05)，见图6。

③兽用抗腹泻中药组合物对脾虚泄泻大鼠结肠zo-1基因mrna相对表达量的影响：

与空白对照组相比，模型组大鼠结肠黏膜紧密连接蛋白zo-1基因mrna相对表达量显著降低(p﹤0.05)；与模型组比较，兽用抗腹泻中药组合物高、中、低剂量组和阳性药物对照组大鼠的结肠黏膜紧密连接蛋白zo-1基因mrna相对表达量显著升高(p﹤0.05)；与阳性药物对照组比较，兽用抗腹泻中药组合物中剂量组大鼠的结肠黏膜紧密连接蛋白zo-1基因mrna相对表达量显著升高(p﹤0.05)，而高、低剂量组差异不显著(p﹥0.05)，见图7。

测试本发明兽用抗腹泻中药组合物对动物肠黏膜组织结构的影响：

60只健康sd大鼠适应性喂养7天后，随机分为空白对照组、脾虚泄泻证病理模型组(简称：模型组)、兽用抗腹泻中药组合物高、中、低剂量组(40g/kg·体重、20g/kg·体重、10g/kg·体重)与阳性药物对照组，采用“破气+苦下+饥饱失常”法，进行大鼠的脾虚泄泻证模型复制，即均按照4ml/200g体重灌服造模药液，每日两次，持续42天。

造模完成后次日进行干预治疗，空白对照组与模型组：按照4ml/200g体重灌服生理盐水，兽用抗腹泻中药组合物高、中、低剂量组：按照4ml/200g体重对应灌服不同浓度的兽用抗腹泻中药组合物，阳性药物对照组：按照4ml/200g体重灌服阳性对照药液水煎剂，每日1次，持续14天。

处死试验大鼠后，无菌分离结肠，置于4％甲醛溶液固定，常规石蜡包埋切片4μm，he染色后，光学显微镜下观察组织病理学变化。

结果显示：详见图8，大鼠结肠切片显微镜下观察发现，空白对照组大鼠结肠黏膜上皮完整，黏膜层单层柱状上皮细胞排列整齐，刷状缘清晰可见，有大量吸杯状细胞和吸收细胞，未见或少见炎性细胞浸润(见图8a)；模型组大鼠黏膜上皮细胞坏死、脱落，其形态结构完整性被破坏，细胞排列紊乱，结肠黏膜层可见炎性细胞浸润，杯状细胞减少(见图8b)；苓术止泻口服液高、中、低剂量组以及作为阳性药物对照的参苓白术散水煎剂组大鼠结肠黏膜显示上皮再生，其形态结构完整性得到恢复，细胞排列连续性好、规则有序，炎性细胞浸润明显减少(见图8c-f)，结果显示，苓术止泻口服液能有效修复脾虚泄泻大鼠结肠黏膜结构。

以上所述仅为本发明的实施方式而已，并不用于限制本发明。对于本领域技术人员来说，本发明可以有各种更改和变化。凡在本发明的精神和原理以内所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包括在本发明的权利要求范围之内。