P-ERK信号通路在抑制铝导致的tau蛋白异常磷酸化和细胞毒性中的应用
本发明属于医学生物学技术领域，具体涉及p-erk信号通路在抑制铝导致的tau蛋白异常磷酸化和细胞毒性中的应用。
背景技术：
在人类生产和生活环境中，金属的应用非常广泛，其中金属元素铝由于储量丰富，具有优良的性能，因此其在工业和生活中的应用更加广泛。铝的广泛应用，使得人类很容易通过空气、食物和饮用水接触到铝。然而，目前铝在体内的生理作用尚不清楚，但已有多项研究表明过多铝暴露可以引起机体多个器官或系统的损伤，其中铝的神经毒性是目前铝毒性的研究热点，许多学者发现过量铝暴露可以引起神经细胞损伤甚至死亡，导致神经细胞功能丧失，且随着铝暴露剂量的增加损伤更严重。其中有研究发现铝对神经细胞的毒性主要与tau蛋白的异常磷酸化有关。此外，课题组前期研究发现铝导致的认知功能障碍，即铝的神经毒性与外周血中磷酸化tau蛋白水平密切相关。因此铝的神经毒性与铝致tau蛋白异常磷酸化有关，但铝导致tau蛋白异常磷酸化的分子机制尚不清楚。
tau蛋白主要存在于神经系统中，是一种神经元微管相关蛋白(microtubule-associaltedprotein，map)，其主要分布在大脑的额叶、颞叶、海马和内嗅区的神经元。正常脑中tau蛋白的生理功能是与微管蛋白结合促进其聚合形成微管，维持微管稳定性，降低微管蛋白分子的解离，并诱导微管成束，从而参与神经元的构建与神经信号的传导。在生理条件下，tau蛋白的功能由约30个残基的磷酸化水平，其中大部分是苏氨酸(pthr)或丝氨酸(pser)位点，因此在正常的机体，tau蛋白处于低磷酸化状态。在病理条件下，tau蛋白经过异常的翻译后修饰，使tau蛋白的磷酸化程度增加至正常大脑的3-4倍，这种过度磷酸化的tau蛋白结合微管的能力显著降低，从而导致微管解体。从微管解离的tau蛋白在一些聚集诱导剂作用下更易发生错误折叠和聚集，被聚合成致病性的双螺旋细丝(phf)，最后与直丝(sf)混合，形成神经原纤维缠结(nft)，导致神经元毒性和认知障碍。在tau蛋白抗体中，已知单抗tau5结合在tau的中间区域，而确切的表位尚未报道。有研究发现tau-5抗体可以识别所有的tau蛋白，可指示细胞或机体内的总tau蛋白表达量。有研究提出双螺旋细丝是定义阿尔茨海默病患者大脑损伤的组织病理标志，phf作为神经原纤维缠结的前期阶段代表蛋白质稳定和细胞内稳态被破坏的阶段。双螺旋细丝主要是由过度磷酸化的tau蛋白组成，同时免疫学和直接化学研究已经确定tau丝氨酸396是phf的一个磷酸化位点，而且用含有磷酸化的丝氨酸396的tau肽证明了这个位点可以被单克隆抗体phf识别，因此我们可以采用单抗tau-ser396识别phf，用于检测细胞内双螺旋细丝的表达量，以此反应神经细胞损伤程度。此外，phf继续聚集形成神经原纤维缠结nft，nft作为神经损伤的终末标志物，可以根据nft含量评估神经损伤程度。
据报道，tau蛋白过度磷酸化甚至可以导致神经细胞死亡。此外，有研究发现tau蛋白磷酸化聚集被抑制，其认知障碍和神经元损伤均可改善。上述研究提示tau蛋白与神经毒性密切相关。
蛋白激酶和磷酸酶系统的调节失衡是导致tau蛋白异常磷酸化的直接原因。现已知，催化tau蛋白磷酸化的蛋白激酶有多种，其中细胞外调节蛋白激酶(extracellularregulatedproteinkinases，erk)是调控tau蛋白磷酸化水平的关键酶，细胞外调节蛋白激酶(extracellularregulatedproteinkinases，erk)属于mapk通路的一员，是一种丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶。mek作为erk的上游蛋白，通过两个调控位点tyr204/187和thr202/185的磷酸化激活erk。erk在调节神经元的增殖、分化和提高学习记忆等方面有非常重要的作用。erk的过度激活已被证明可诱发各种疾病，包括癌症、炎症、发育障碍和神经系统疾病等。活化的erk可以调控微管相关蛋白在细胞质中磷酸化，维持细胞形态和细胞骨架的稳态。此外，有研究发现活化(双重磷酸化)形式的erk与ad脑中的早期神经纤维变化存在共定位。通过检测在ad患者脑脊液样本，发现磷酸化的细胞外信号调节激酶(p-erk)与磷酸化tau密切相关。有研究发现神经退行性疾病患者脑脊液tau蛋白的表达与erk密切相关，提示erk可能成为新的神经退行疾病生物标志物。此外，有研究发现，铝暴露可能诱导大鼠脑内erk的激活，引起学习记忆障碍。而且，erk抑制剂(u0126)可以逆转氯化铝诱导的细胞凋亡和氧化应激等。因此我们推测铝导致的tau蛋白过度磷酸化可能与erk的活化相关。
技术实现要素：
本发明为了解决上述问题，提供了p-erk信号通路在抑制铝导致的tau蛋白异常磷酸化和细胞毒性中的应用。
本发明由如下技术方案实现的：抑制剂在降低铝导致的tau蛋白异常磷酸化和细胞毒性中的应用，所述抑制剂为抑制p-erk信号通路。
所述抑制p-erk信号通路为抑制或降低p-erk表达。
所述抑制或降低p-erk表达为使p-erk蛋白水平降低。
所述抑制剂为erk活化抑制剂u0126-etoh。
所述erk活化抑制剂u0126-etoh浓度为50μmol/l。
本发明采用pc12细胞，利用al(mal)3构建tau蛋白过度磷酸化模型，采用erk活化抑制剂(u0126)过表达对细胞进行干预，通过qt-pcr检测mrna-erk的表达，westernblot检测erk、p-erk、tau5、phf(tau-ser396)、nft(tau-ser202,thr205)的表达情况。为揭示铝致tau蛋白过度磷酸化的分子机制提供实验室线索。
与现有技术相比，本发明为铝导致的神经细胞损伤提供了新的药物靶点，对临床上有效改善铝导致的神经细胞毒性，为认知功能损伤的防治提出科学依据。利用本发明，通过监测相关信号通路，可以方便快捷评估药物改善麦芽酚铝导致的神经细胞毒性的效果。
附图说明
图1为不同al(mal)3浓度处理后细胞内铝离子荧光信号；
图2为不同al(mal)3浓度处理后的细胞活力，图中：不同字母表示差别有统计学意义，p<0.05；
图3为不同al(mal)3浓度处理后的细胞形态；
图4为不同al(mal)3浓度处理后mrna-erk的表达量，图中字母不同表示差别有统计学意义p<0.05；
图5为不同al(mal)3浓度处理后p-erk蛋白的相对表达量；图中字母不同表示差别有统计学意义p<0.05；
图6为不同al(mal)3浓度处理后tau蛋白、phf蛋白、nft蛋白的相对表达量，图中字母不同表示差别有统计学意义p<0.05；
图7为不同al(mal)3浓度处理后pc12细胞内tau5的荧光信号；
图8为不同al(mal)3浓度处理后pc12细胞内phf的荧光信号；
图9为不同al(mal)3浓度处理后pc12细胞内nft的荧光信号；
图10为不同u0126浓度处理后的细胞活力；图中字母不同表示差别有统计学意义p<0.05；
图11为u0126处理后的pc12细胞的形态；
图12为u0126浓度处理后p-erk蛋白的表达量，图中字母不同表示差别有统计学意义p<0.05；
图13为u0126浓度处理后tau5、phf、nft蛋白的表达量，图中字母不同表示差别有统计学意义p<0.05；
图14为erk抑制剂u0126处理后pc12细胞内tau5的荧光信号；
图15为erk抑制剂u0126处理后pc12细胞内phf的荧光信号；
图16为erk抑制剂u0126处理后pc12细胞内nft的荧光信号。
具体实施方式
为使本发明实施例的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例是本发明的一部分实施例，而不是全部的实施例；基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
除非另有定义，所有在此使用的技术和科学术语，和本发明所属领域内的技术人员所通常理解的意思相同，在此公开引用及他们引用的材料都将以引用的方式被并入。
那些本领域技术人员将意识到货通过常规实验就能了解到的许多所描述的发明的特定实施方案的等同技术，都将包含在本申请中。
下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的仪器设备，如无特殊说明，均为实验室常规仪器设备；下述实施例中所用的实验材料，如无特殊说明，均为由常规生化试剂商店购买得到的。
实施例：
一、实验所用材料
1、实验细胞株：大鼠肾上腺嗜铬细胞瘤细胞(pc12)。来源于中国科学院上海生命科学研究院细胞资源中心。
2、实验试剂：见表1。
表1：实验所用试剂及其来源
3、实验仪器：见表2。
表2：实验所用仪器
4、溶液配置
(1)麦芽酚铝(al(mal)3)溶液：将0.1931galcl3·6h2o溶解于40ml高压过的双蒸水中，配制成20mmol/l的alcl3溶液；将0.3024g麦芽酚溶于40ml高压过的双蒸水中，配制成60mmol/l的麦芽酚溶液。分别用0.22μm的滤膜过滤分装，-20保存，使用时，alcl3和麦芽酚溶液等体积混合，配制成10mmol/l的al(mal)3溶液，用10％的naoh溶液调节ph至7.4，现配现用。
(2)完全培养基：含有10％胎牛血清和1％青链霉素混合液的dmem高糖培养基，混匀，4℃保存。
(3)acry:bis(30:0.8)30％：将60g丙烯酰胺和1.6g甲叉双丙烯酰胺溶解于少量双蒸水中，定容至200ml，0.45μm滤纸过滤，4℃棕色瓶保存。
(4)tris·cl/sds，4×(ph8.8)：称取18.2gtris，溶解于少量双蒸水中，调节ph至8.8，加双蒸水定容至100ml，最后加入0.8gsds，超声溶解，室温保存。
(5)tris·cl/sds，4×(ph6.8)：称取6.05gtris，溶解于少量双蒸水中，调节ph至6.8，加双蒸水定容至100ml，最后加入0.8gsds，超声溶解，室温保存。
(6)10％过硫酸铵溶液：称取过硫酸铵0.4g溶解于4ml双蒸水中，混匀，4℃保存，保存期一周。
(7)10×转膜液：将tris6g和甘氨酸28.8g溶解于双蒸水，加双蒸水定容至1l。
(8)1×转膜液：取10×转膜液100ml，加入200ml甲醇，最后加入700ml双蒸水，使终体积为1l。
(9)4×电泳液：称取tris24.2g，甘氨酸87.66g，加入少量双蒸水使其充分溶解，然后加双蒸水至总体积1l，最后加入2gsds，充分溶解。
(10)1×电泳液：取4×电泳液稀释4倍。
(11)10×tbs溶液：称取tris12.13g，nacl8.006g，加入少量蒸馏水充分溶解，调节ph至7.6，然后加水至总体积1l。
(12)1×tbst：取10×tbs稀释10倍，每1l加0.5ml吐温20。
(13)封闭液：称取5gbsa或脱脂牛奶，加入100ml1×tbst，充分溶解，现配现用。phosphos396ser202,thr205。
(14)细胞蛋白抽提液：将磷酸酶抑制剂、蛋白酶抑制、rapi裂解液按1:1:98的比例制成混合液。
(15)u0126工作液：取10mgu0126粉末，加入0.4689mldmso充分溶解，使工作液浓度为50mm，-20℃分装保存。
(16)mirna-195-5pmimc和ncmimic储备液：取250μl高压的双蒸水，加入到5nmol的mimc冻干粉中，制成20μmol/l的mimic储备液。
(17)8-hq储备液：称取0.7258g8-hq粉末，加入10mldmso，使储备液浓度为5×105μmol/l。
二、实验方法
1、细胞培养
大鼠肾上腺髓质嗜铬细胞瘤细胞(pc12)在37℃、体积分数为5％co2恒温细胞培养箱中进行传代培养。细胞复苏时，将冻存的细胞取出，3min之内在37℃恒温水浴锅中融化，将融化后的细胞悬液转移至15ml离心管内，按1000rpm离心5min，弃上清，加入1ml培养液吹打混匀，将细胞悬液转移至含有3ml完全培养液的培养瓶中，8字混匀，放于37℃、体积分数为5％co2恒温细胞培养箱中培养。
细胞传代：首先，吸弃原有的培养液，加入3mld-hank’s清洗2次，吸弃；然后，加入1ml胰蛋白酶-edta消化液，37℃消化1min，用2ml完全培养液终止消化，将此时培养瓶内的所有液体转移到15ml离心管中，按1000rpm离心5min，吸弃上清，向细胞沉淀中加入4ml完全培养液，吹打混匀，将细胞悬液各1ml分别转移至含有3ml完全培养液的4个培养瓶中，8字混匀，放于37℃、体积分数为5％co2恒温细胞培养箱中培养。
细胞收样：收集细胞沉淀(同“细胞传代”)，1mld-hank’s清洗3次，最后将细胞沉淀转移至1.5mlep管中，1000rpm离心5min，弃上清，将收集的细胞沉淀至于-80℃冰箱备用。
细胞冻存：选择对数生长期的细胞，收集细胞沉淀(同“细胞传代”)，冻存液中完全培养基、胎牛血清、dmso按4:5:1的比例混合，每一瓶细胞沉淀加入1ml冻存液，吹打混匀，转移至1.5ml冻存管中，按4℃、30min，-20℃1h，-80℃长期进行梯度冻存，每三个月复苏一次细胞。
2、细胞活力测定
收集细胞沉淀(同“细胞传代”)，加入1ml完全培养基吹打混匀，取其中0.5ml细胞悬液用于细胞活力测定。在0.5ml细胞悬液中加入一定量的完全培养液，接种至96孔板。在96孔板中，按al(mal)3浓度为0μmol/l、100μmol/l、200μmol/l、300μmol/l、400μmol/l、500μmol/l、600μmol/l的浓度梯度设置7组，每组六个复孔，每孔200μl细胞悬液。当细胞长至对数生长期后按上述的浓度梯度加入al(mal)3，37℃恒温箱中24h。24h后，吸弃96孔板中原有的培养液，每孔加入110μl(100μl完全培养液和10μlcck8溶液)完全培养液与cck-8混合液，同时，增加六个只含培养液和cck-8混合液而不存在细胞的孔，放于37℃恒温箱中1h，在波长为450nm下，用酶标仪进行吸光度测定。
细胞存活率＝[(as-ab)/(ac-ab)]×100％，式中：as：实验孔(含有细胞的培养基、cck-8、待测物质)，ac：对照孔(含有细胞的培养基、cck-8、没有待测物质)，ab：空白孔(不含细胞和待测物质的培养基、cck-8)。
3、细胞染毒及分组
al(mal)3染毒分组为对照组、100μmol/lal(mal)3组、200μmol/lal(mal)3组、400μmol/lal(mal)3组。首先用培养液对六孔板进行润洗。然后选择细胞密度达到90％的两瓶细胞，收集细胞沉淀(同“传代”)，加入一定量的完全培养基吹打混匀，接种于4个六孔板中，每孔1.5ml，十字混匀。当细胞生长至对数生长期时，每孔中分别加入0μl、15μl、30μl、60μl的al(mal)3，使每孔中al(mal)3浓度分别为0μmol/l、100μmol/l、200μmol/l、400μmol/l，同一剂量三个复孔，染毒24h后收样。
4、细胞u0126干预及分组
分组为对照组、溶剂对照组、200μmol/lal(mal)3组、50μmol/lu0126干预组、50μmol/lu0126干预+200μmol/lal(mal)3组。细胞接种至六孔板。当六孔板中细胞生长至对数生长期时进行干预。
对照组：含1.5ml培养液的孔中不加入新的物质，在完全培养液中继续生长。
200μmol/lal(mal)3组：将20mmol/l的alcl3溶液和60mmol/l的麦芽酚溶液等体积混合，配制成10mmol/l的al(mal)3溶液，用10％的naoh溶液调节ph至7.4，现配现用。往含1.5ml培养液的孔中加入30.61μl的al(mal)3溶液，使孔中al(mal)3浓度为200μmol/l。
50μmol/lu0126干预组：往含1.5ml培养液的孔中加入1.5μlu0126工作液，十字混匀，使孔中u0126浓度为50μmol/l。
50μmol/lu0126干预+200μmol/lal(mal)3组：先往含1.5ml培养液的孔中加入1.5μlu0126工作液，十字混匀，使孔中u0126浓度为50μmol/l，置于培养箱中培养0.5h，0.5h后，加入al(mal)3，使al(mal)3的浓度为200μmol/l，继续染毒24h。
溶剂对照组：往含1.5ml培养液的孔中加入相同体积(1.5μl)的dmso作为溶剂对照组。
同一剂量三个复孔，首先使用u0126预处理1h，然后al(mal)3染毒24h。25h后收样。
5、总rna提取
(1)耗材准备：提前高压1ml枪尖、200μl枪尖、20μl枪尖、1.5mlep管、4mlep管以及双蒸水，枪尖及ep管烘干后备用，双蒸水晾凉后放于4℃备用。trizon、氯仿、异丙醇、无水乙醇备用。
(2)向细胞沉淀中加入1mltrizon吹打混匀，室温放置5min，使蛋白核算复合物完全分离。
(3)继续加入氯仿，每1mltrizon加入0.2ml氯仿，盖好管盖，剧烈震荡15s，室温放置2-3min。
(4)4℃12000rpm离心15min，此时样品分为三年层：红色有机相，中间层和上层无色水相，rna主要在水相中，把水相转移至一个新的高压过的1.5mlep管内。
(5)在水相溶液中加入等体积的异丙醇，颠倒混匀，室温放置10min。
(6)4℃12000rpm离心10min，小心吸弃上清。
(7)在得到的沉淀中加入75％乙醇(用无水乙醇和无rnase水配制)，盖紧管盖，用手指弹管壁，洗涤沉淀。每使用1mltrizon加入1ml75％乙醇。
(8)4℃12000rpm离心3min，小心吸弃上清。
(9)步骤(7)(8)重复2-3次。
(10)将沉淀室温放置2-3min，晾干，加入30-100μl无rnase水，轻弹管壁，充分溶解rna，瞬时离心，保存于-80℃冰箱备用。
6、细胞蛋白提取
将磷酸酶抑制剂、蛋白酶抑制、rapi裂解液按1:1:98的比例制成蛋白抽提液。取收集的细胞沉淀，每组细胞沉淀(6个孔)加入60-90μl的蛋白抽提液，吹打混匀，冰上孵育20min，使细胞充分裂解。12000rpm离心10min，取上清于新的1.5mlep管内，做好标记，此上清为提取的细胞蛋白。
7、bca蛋白定量
(1)bsa(牛血清蛋白)标准液见表3
表3：
(2)bca工作液
将bca-a液与bca-b液按50:1的比例混合，制成bca工作液。
工作液用量＝(bsa标准品个数+样品个数)×复孔数×每孔需加入工作液的体积。
(3)稀释待测蛋白样品25倍，4μl蛋白原液+96μl双蒸水。
(4)将标准品及稀释后的蛋白样品各25μl加入到96孔板内，各3个复孔。
(5)每孔加入200μlbca工作液，充分混匀，37℃孵育30min，冷却至室温，在3-5min内完成检测。
(6)用酶标仪测定每个样品及bsa标准品的吸光度，λ＝540-590nm。
(7)绘制标准曲线，利用标准品的吸光度及已知浓度计算蛋白浓度与吸光度的关系，根据待测蛋白吸光度计算出待测蛋白的浓度。
(8)利用蛋白抽提液进行稀释，将所有待测蛋白的浓度调整至于最低浓度组一致。然后向每组蛋白样品中加入5×loadingbuffer，5×loadingbuffer:蛋白＝1:4。
(9)烧水煮沸，将蛋白样品放入沸水，煮5min，冷却至室温，放于-20℃备用。
8、westernblot检测相关蛋白表达水平
(1)玻璃板清洗与组装：将新购买的玻璃板泡在洗洁精水中一至两天。两面都擦洗过后用自来水冲洗干净，再使用蒸馏水冲洗干净，放于架子上，于烘干箱中晾干备用。将干净的玻璃板对齐放入卡槽中卡紧，准备注胶。
(2)10％分离胶与积层胶配制，配方见表4。
表4：
(3)注胶：将分离胶从玻璃板的一侧注入，加至玻璃板的三分之二高度。然后采用快划慢加的方式继续加入2ml异丙醇，将胶面压平，静置25min，待分离胶凝好，将异丙醇倒掉。继续加入积层胶，方式同分离胶，注满。控制注胶速度，避免气泡产生。将梳子插入分离胶，注意不要产生气泡，静置25min，待分离胶凝好，将梳子缓慢拔出。胶做好后连同玻璃板一起安装到电泳槽上，加入电泳缓冲液后开始准备上样。
(4)上样：取出蛋白样品，室温融化，震荡混匀，瞬时离心。首先在样孔的首尾各加入2μl和4μlmaker，在中间的样孔中依次加入等体积的蛋白样品。
(5)电泳：设置电压60v，时间2.5h进行电泳，待溴酚兰刚跑出即可终止电泳，尽快转膜，防止蛋白扩散。
(6)转膜：将0.45μm的pvdf膜浸泡在甲醇中。首先取出转膜夹，用回收转膜液浸泡海绵垫和滤纸。然后在转膜夹的黑板上依次放置海绵垫、滤纸、胶、pvdf膜、滤纸、海绵垫，夹紧转膜夹。注意pvdf膜应放置在对应分子量的蛋白位置上，且在每层之间不要产生气泡。将夹子放入转膜槽中，正负极应对应，在转膜槽的两侧放入冰袋，倒入转膜液，设置电流300ma，时间70min。
(7)封闭：用1×tbst和牛奶或者bsa配制封闭液。转膜结束，取出pvdf膜，将其尽快浸泡在封闭液中，避免pvdf膜变干。在室温摇床上封闭3h。
(8)孵育一抗：按说明书的比例，用1％的脱脂牛奶或bsa稀释一抗，每个蛋白条带用2ml抗体稀释液进行孵育，4℃过夜。
(9)孵育二抗：用1×tbst清洗条带，每次10min，洗3次。按说明书的比例，用1％的脱脂牛奶或bsa稀释二抗，每个蛋白条带用2ml抗体稀释液进行孵育，37℃孵育2h。
(10)显影：用1×tbst清洗条带，每次10min，洗3次。每个蛋白条带约需配制发光液200μl，用universalhoodⅱ成像仪显影，最后用quantityone软件分析灰度值。
9、基因表达水平检测
(1)mrna-erk1、mrna-erk2和mrna-ga反转录
首先检测所提取的总rna浓度，计算500ngrna的体积。使用takara的反转录试剂盒，按如下体系进行实验(冰上配制)，配方见表5。
表5：
*反应体系可按需求等比扩大，10μl反应体系可最大使用500ng的totalrna。
以上体系混匀后，瞬时离心，rt反应程序为37℃15min，85℃5s，4℃。
(2)mrna-erk和mrna-gaqt-pcr
按表6、表7、表8体系进行实验(冰上配制)：
表6：
表7：qpcr反应程序：
表8：引物序列：
10、细胞al(mal)3荧光分布检测：将细胞铺在激光共聚焦微孔小皿上，待细胞长至30％时进行染铝，继续培养24h。
(1)吸弃皿里的培养液，用1％pbs清洗3次，每次5min。
(2)4％多聚甲醛常温固定20min，每个皿1ml。然后用1％pbs清洗3次,每次5min。
(3)0.5％triton(100％的triton用1％pbs稀释200倍)冰上穿孔15min，每个皿1ml。然后用1％pbs清洗3次,每次5min。
(4)取8-hq储备液，用dmso稀释100倍，配制为8-hq工作液(500μmol/l)进行染铝，每个皿1ml，将皿放于暗盒中，37℃孵育30min。然后用1％pbs清洗3次,每次5min。后续步骤操作时应注意避光。
(5)用1％pbs稀释1mg/mldapi至5μg/ml，用5μg/ml的dapi进行染核，每皿1ml，常温孵育10min。然后用1％pbs清洗3次,每次5min。
(6)每皿加入1ml1％pbs，采用激光共聚焦进行检测。
11、tau蛋白免疫荧光：将细胞铺在激光共聚焦微孔小皿上，待细胞长至30％时进行染铝或干预。
(1)同10的(1)(2)(3)。
(2)称取适量的bsa粉末，用1％pbs配制5％的bsa，每皿1ml，搜索cdc的常温封闭1h。
(3)吸弃5％bsa，加入1％bsa稀释的一抗，每皿500μl，4℃过夜。
(4)1％pbs清洗3次,每次5min。加入1％bsa稀释的荧光二抗，放于暗盒，37℃孵育1h。后续步骤操作时应注意避光。
(5)1％pbs清洗3次,每次5min。
(6)同10的(5)、(6)。
三、统计分析：采用spss22.0软件进行统计分析。所有数据均为计量资料，采用
四、结果
1、不同剂量麦芽酚铝染毒的实验结果
a、麦芽酚铝处理后pc12细胞内麦芽酚铝的分布：采用激光共聚焦检测细胞内al(mal)3的分布。检测结果如图1所示，荧光信号显示，铝主要分布在胞质中，且集中在核的周围，随着al(mal)3浓度的增加，荧光信号逐渐增强。
b、麦芽酚铝对pc12细胞活力和形态的影响：采用不同浓度的al(mal)3处理细胞(0、100μmol/l、200μmol/l、300μmol/l、400μmol/l、500μmol/l、600μmol/l)，24h后采用cck8试剂盒检测细胞活力。检测结果见图2，由图2可知：0、100μmol/l、200μmol/l、300μmol/l、400μmol/l、500μmol/l、600μmol/lal(mal)3染毒后细胞活力分别为1、92.05、87.69、85.62、82.88、78.67、71.75。其中，在100μmol/l、200μmol/l、400μmol/l的al(mal)3浓度处理下，细胞活力均保持在80％以上，因此选择100μmol/l、200μmol/l、400μmol/l的al(mal)3浓度作为低、中、高剂量组。
经100μmol/l、200μmol/l、400μmol/lal(mal)3处理后，采用100×倒置显微镜观察细胞形态，细胞形态如图3所示，与对照组相比，100μmol/lal(mal)3组细胞稍有减少，但不明显；200μmol/lal(mal)3组细胞密度降低，细胞扁平，立体感降低，且轴突变短，细胞连接减少；400μmol/lal(mal)3组细胞密度明显降低，细胞扁平，轴突断裂，细胞连接减少，胞体变小，细胞核增大。
c、麦芽酚铝对pc12细胞mrna-erk、总erk、p-erk蛋白表达的影响
采用qt-pcr检测不同组mrna-erk的表达量。结果如图4所示，结果显示，随着al(mal)3浓度的增加，mrna-erk的表达量未见变化。
采用westernblot检测总erk、p-erk蛋白相对表达量。结果见表9、图5，结果显示，随着al(mal)3浓度的增加，总erk蛋白表达量未见变化，p-erk蛋白的表达量逐渐增加。与对照组相比，100μmal(mal)3组p-erk蛋白表达量未出现显著差异(p>0.05)；200μmal(mal)3组p-erk蛋白表达量增加了1.736倍(p<0.05)；400μmal(mal)3组p-erk蛋白表达量增加了1.993倍(p<0.05)。
表9：不同al(mal)3浓度处理后mrna-erk的表达量
注：字母不同表示差别有统计学意义p<0.05。
d、麦芽酚铝对pc12细胞tau5、phf、nft蛋白表达的影响
采用westernblot检测tau、phf、nft蛋白相对表达量。结果如图6所示，结果显示，随着染铝浓度的增加，tau、phf、nft表达量均增加。tau5结果显示，与对照组相比，100μmal(mal)3组tau蛋白表达量未出现显著差异(p>0.05)，200μmol/lal(mal)3组、400μmol/lal(mal)3组蛋白表达量分别增高1.220倍、1.459倍(p<0.05)。phf蛋白结果显示，与对照组相比，100μmol/lal(mal)3组、200μmol/lal(mal)3组、400μmol/lal(mal)3组蛋白表达量分别增高1.184倍、1.533倍、2.500倍(p<0.05)。nft蛋白结果显示，与对照组相比，100μmal(mal)3组nft蛋白表达量未出现显著差异(p>0.05)，200μmol/lal(mal)3组、400μmol/lal(mal)3组蛋白表达量分别增高1.394倍、2.417倍(p<0.05)。
e、麦芽酚铝对pc12细胞tau5、phf、nft荧光分布的影响
免疫荧光显示结果如图7、8、9所示，结果显示，tau5主要定位在细胞质，phf主要定位在细胞核，nft在胞核和胞质中均有分布，均随着al(mal)3浓度的增加荧光信号逐渐增强。经al(mal)3处理后，tau5和nft均表现为胞质中出现较大的荧光斑块；而phf则是出现蛋白由胞核向胞质转移，在细胞胞质中出现微弱的荧光信号。
2、erk活化抑制剂u0126干预实验结果
a、erk抑制剂u0126对pc12细胞活力及形态的影响
首先采用cck8试剂盒检测u0126对细胞活力的影响。采用不同浓度的u0126处理细胞(10μmol/l、20μmol/l、30μmol/l、40μmol/l、50μmol/l、60μmol/l)，干预结束后采用cck8试剂盒检测细胞活力。结果见图10；结果显示：其中，在10μmol/l、20μmol/l、30μmol/l、40μmol/l、50μmol/l的u0126处理下，细胞活力均保持在80％以上，为达到最佳抑制率，因此选择50μmol/l的u0126作为干预浓度。
经u0126处理后，采用100×倒置显微镜观察细胞形态，实验结果如图11所示，与对照组相比，200μmol/lal(mal)3组细胞数量逐渐减少，轴突减少、断裂，胞体变圆；50μmol/lu0126处理后，细胞数量增加，胞体变大，细胞连接增多；与200μmol/lal(mal)3组相比，u0126+200μmol/lal(mal)3组细胞密度增加，细胞连接较多，轴突增多。
b、erk抑制剂u0126对pc12细胞总erk及p-erk蛋白表达的影响
采用westernblot检测erk和p-erk蛋白相对表达量。结果如图12所示，结果显示，总erk蛋白表达量在各组间未见变化；与对照组相比，溶剂对照组p-erk表达量未见变化，200μmol/lal(mal)3组p-erk蛋白表达量增加了1.736倍(p<0.05)，u0126干预组p-erk蛋白的表达量降低了31.920％(p<0.05)；经析因分析显示，50μmol/lu0126处理与al(mal)3染毒对p-erk蛋白的表达存在交互作用。
c、erk抑制剂u0126对pc12细胞tau5、phf、nft蛋白表达的影响
采用westernblot检测tau5、phf、nft蛋白相对表达量。结果如图13所示，结果显示，与对照组相比，溶剂对照组tau5、phf、nft蛋白表达量未见变化，200μmol/lal(mal)3组tau5、phf、nft蛋白表达量分别增加了1.220倍、1.533倍、1.394倍(p<0.05)，50μmol/lu0126处理组tau5、phf、nft蛋白表达量分别降低了17.900％、16.500％、56.540％；经析因分析显示，50μmol/lu0126处理与al(mal)3染毒对tau5、phf、nft蛋白的表达存在交互作用，即p-erk参与al(mal)3染毒致tau5、phf、nft蛋白表达异常。
d、erk抑制剂u0126对pc12细胞tau5、phf、nft荧光分布的影响
免疫荧光如图14、15和16所示，结果显示，tau5主要定位在细胞质，phf主要定位在细胞核，nft在胞核和胞质中均有分布，均随着al(mal)3浓度的增加荧光信号逐渐增强。与200μmol/lal(mal)3组相比，tau5、phf、nft在u0126+200μmol/lal(mal)3组细胞整体荧光信号减弱，荧光斑块减少。经u0126处理后，tau5主要表现为整体荧光密度降低且蛋白分布均匀；phf主要表现为胞质中的荧光信号消失；nft主要表现为整体荧光信号减弱，胞质中未见大的荧光斑块。
本发明采用的pc12细胞是是一种交感神经系统的肿瘤细胞。其生长性好，稳定，适用于基因转染研究。而且pc12细胞膜上存在神经生长因子(nervegrowthfactor，ngf)受体，可以识别生长因子(ngf)，长出神经突起，分化成为具有交感神经元特性的细胞。因此，本研究采用该细胞进行造模，采用al(mal)3进行细胞染毒，通过免疫荧光检测到铝进入了细胞内，且主要分布在胞质和轴突。
3、al对tau蛋白过度磷酸化的作用
生活中铝无处不在，但铝对生命来说并不是必需的，它参与了机体的生物化学反应，其作为公认的神经毒性金属，铝能够穿过血脑屏障和胎盘屏障积聚于脑部的海马区、额皮质等区域，并反复显示在认知障碍易感神经元病灶中积累，x射线光谱证明了在认知功能障碍病人的大脑中形成的神经纤维缠结里有铝的蓄积。此外也有研究者对被诊断为ad的患者脑组织进行金属分布调查，结果显示在其脑组织内有铝的沉积。这均说明了铝在认知功能减退中具有重要作用。
最近有研究发现，ad患者大脑皮质神经元细胞内铝和过度磷酸化tau蛋白聚集的神经原纤维缠结存在共定位。综上所述，铝能够进入脑组织，且与tau蛋白异常磷酸化有关。
本发明中构建了染铝的细胞模型，且通过荧光染料检测铝是否能够进入细胞，结果显示细胞内出现绿色荧光斑点，且随着染铝浓度的增加荧光斑点增多，因此可以证实体外研究中，可通过给细胞染铝建立铝在神经元内积累的模型，检测相关分子的变化。
已有很多研究均已证实了铝可以引起tau蛋白过度磷酸化这一病理反应。但并未对异常磷酸化tau蛋白不断聚集过程中形成的双螺旋细丝及神经原纤维缠结一一进行检测。tau蛋白属于微管相关蛋白，当有毒物质或应激刺激时，tau蛋白磷酸化位点发生异常磷酸化，使其丧失微管结合能力。游离的异常磷酸化tau蛋白聚集为tau二聚体/寡聚体，继续聚集形成双螺旋细丝和神经元纤维缠结，而不同的tau聚集形式毒性不同。有研究发现铝所引起的神经毒性主要是通过异常磷酸化tau蛋白聚集形成nft所导致的。
因此本发明分别采用tau5抗体、tau-pser396抗体和at8(tau-pser202，thr205)抗体来检测了总tau、phf和nft，以探讨不同磷酸化位点tau的表达情况。结果显示，tau5蛋白表达随着铝浓度的增加而增加的，phf在低剂量(100μmol/lal(mal)3)时就可看到明显的升高，而nft只有到中剂量(200μmol/lal(mal)3)时才观察到明显的升高，因此我们推测虽然铝可以引起tau蛋白的过度磷酸化，但phf对铝的毒性更加敏感，在早期即可出现，而nft是在较后期才出现的。而且免疫荧光显示，tau5抗体所代表的总tau主要在胞质中检测到，染铝后总tau信号增强，而其定位没有改变。针对磷酸化tau的抗体显示了tau在胞核的定位。phf主要位于胞核中，但在染铝后其出现在胞质，且胞核的信号也增强了。nft在胞核和胞质均有分布中，但在染铝后，主要表现在胞质中荧光信号的增强。在光镜下，染铝后细胞出现轴突明显缩短，细胞连接减少，细胞显著减少。
以上结果均证实了铝可以引起tau蛋白异常磷酸化，导致tau蛋白异常聚集，产生细胞毒性。有研究更是发现了异常聚集的tau蛋白在脑组织内的致病作用，强调tau聚集体是的神经元的标志性病变。此外，大脑皮层和海马中磷酸化tau的沉积与痴呆严重程度有关。bueel等人认为高度磷酸化tau或丝状nft的形式存在，是成人发生神经退行性疾病(如ad、进行性核上性麻痹(psp)、与17号染色体相关的额颞痴呆和帕金森病(ftdp-17)的特征之一。这些结果均与本研究一致。
因此，我们提出铝可以导致tau蛋白过度磷酸化，且铝对tau蛋白的磷酸化主要先发生在ser396位点的磷酸化，随着铝浓度的增高出现ser202，thr205位点的磷酸化。
4、抑制erk活化对al致蛋白过度磷酸化的作用
一些激酶已被发现参与tau蛋白的过度磷酸化，如gsk-3、细胞周期依赖激酶-5、mapks、酪蛋白激酶等。细胞外信号调节激酶(extracellularsignalregulatedkinase，erk)属于丝裂原活化蛋白激酶(mitogenactivatedproteinkinase，mapk)家族，在信号级联中发挥作用，将细胞外信号传递到细胞内靶点。现已证实，神经元erk-mapk级联在突触可塑性、记忆形成和其他一些重要的神经功能中发挥重要作用。以往的研究表明，erk通路与铝诱导的神经毒性有关，同时erk也被认为在调节tau磷酸化中具有很重的作用，但其机制尚不清楚。
细胞外信号调节激酶erk主要分为erk1和erk2两种，是进化上保守的，普遍存在的丝氨酸-苏氨酸激酶，在正常和病理条件下调节细胞信号。tau蛋白的磷酸化位点主要是苏氨酸(pthr)或丝氨酸(pser)位点，因此我们推断铝引起的tau蛋白过度磷酸化可能是通过erk的激活来发挥作用的。由于erk级联的重要性，erk紊乱对细胞有害。erk通路的过度激活已被证明可诱发各种疾病，包括癌症、炎症、发育障碍和神经系统疾病。giacomosiano等人基于构象敏感的tau传感器(conformationalsensitivetau(cst)sensor)进行细胞筛选试验来测试不同蛋白激酶抑制剂对过度磷酸化引起的tau聚集的抑制情况，发现erk抑制剂可以显著减少tau聚集。
因此，在本发明中，首先对细胞进行al(mal)3染毒，发现与对照组相比，200μmal(mal)3组和400μmal(mal)3组p-erk蛋白表达量分别增加了1.736倍和1.993倍(p<0.05)。此外，tau5蛋白、phf、nft的表达量在200μmal(mal)3组均出现了显著增高。结果说明，al(mal)3染毒可以引起erk通路过度激活，此效应与tau蛋白异常磷酸化是一致的，提示我们erk通路的过度激活可能是导致tau蛋白过度磷酸化的上游信号，也是铝诱导pc12细胞tau过度磷酸化和细胞毒性的原因之一。
然后，采用erk活化抑制剂u0126对细胞进行预处理，发现u0126处理后p-erk显著降低，同时进行200μmol/lal(mal)3处理，经析因分析发现u0126处理与200μmol/lal(mal)3对tau5、phf、nft的表达存在交互作用，说明p-erk参与了al(mal)3导致的tau蛋白异常磷酸化。而且，与200μmol/lal(mal)3组相比，经u0126处理后，细胞连接增多，突触断裂减少，细胞状态明显好转，说明铝可以引起erk的异常激活，进而导致tau蛋白过度磷酸化，抑制erk过度活化可以部分逆转al(mal)3引起的tau蛋白异常磷酸化和细胞毒性。此外，目前的数据显示,与ser396位点(phf)相比较u0126显著抑制了ser202,thr205位点(nft)的磷酸化，这与抑制erk活化只能部分减轻铝的细胞毒性是一致的。
而且，在免疫荧光分析中观察到，经u0126处理后，磷酸化tau蛋白荧光密度降低，且phf和nft荧光斑块均显著减少，进一步说明了erk过度活化对tau蛋白磷酸化的作用。这些结果与其他的研究中erk活化导致tau蛋白异常磷酸化的结果相一致。综上所述，在pc12细胞中铝引起的tau蛋白过度磷酸化可能是通过引起erk异常激活来发挥作用的。
结论：麦芽酚铝可以进入细胞，主要分布在胞质；tau5蛋白主要分布在胞质；双螺旋细丝(phf，p-ser396)主要分布在胞核；神经原纤维缠结(nft，p-ser202，p-thr205)在胞核和胞质中均有分布。且麦芽酚铝染毒后tau5、nft均表现为胞质中的蛋白表达增多，其中phf不仅表达量增加而且出现向胞质转移的现象。
铝对tau蛋白的磷酸化主要先发生在ser396位点的磷酸化，随着铝浓度的增高出现ser202，thr205位点的磷酸化。
麦芽酚铝可激活磷酸化erk导致tau蛋白异常磷酸化。因此，通过抑制erk活化有效改善麦芽酚铝导致的细胞细胞毒性，为认知功能损伤的防治提出科学依据。
最后应说明的是：以上各实施例仅用以说明本发明的技术方案，而非对其限制；尽管参照前述各实施例对本发明进行了详细的说明，本领域的普通技术人员应当理解：其依然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分或者全部技术特征进行等同替换；而这些修改或者替换，并不使相应技术方案的本质脱离本发明各实施例技术方案的范围。
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