一种紫檀芪在制备预防和/或治疗肠上皮屏障损伤药物中的应用的制作方法

本发明属于医药
技术领域：
，尤其涉及一种紫檀芪在制备预防和/或治疗肠上皮屏障损伤药物中的应用。
背景技术：
：肠上皮屏障由肠上皮细胞的顶质膜和细胞间的紧密连接组成，可严格调节水、离子和有机分子在上皮的吸收。作为肠屏障重要特征功能的肠道通透性与机体健康和疾病的关系近年来逐步引发人们的关注。炎症介质、菌群失调、高脂饮食是导致肠粘膜屏障(包括上皮屏障)破坏的常见因素，他们会导致肠上皮细胞紧密连接发生异常，引起肠道通透性的改变，肠腔内对机体不利的有害物质就会通过肠道进入机体启动炎症机制，从而引起一系列疾病。如炎症性肠病、结肠癌、慢性肝病、糖尿病、肥胖等。随着生活水平的提高，人们的饮食习惯和食物结构发生了很大的变化，导致肠道接触各种外界物质及其代谢产物，尤其是各种有害物的机会显著增加，而这些有害因素可以对肠道上皮造成威胁和破坏。一旦肠道上皮受损，其通透性就会发生改变，各种有害物或者本应该少量进入体内的物质就会容易的通过肠道上皮屏障进入机体。现有的研究结果证实，无论胃肠疾病(例如炎症性肠病、结肠癌等)还是其他疾病(糖尿病、动脉粥样硬化、老年痴呆等)都与肠上皮屏障损伤有关。因此探索保护和预防肠粘膜损伤的方法和手段显得尤为重要。紫檀芪(pte)广泛存在于蓝莓、葡萄等浆果中，是白藜芦醇的一种二甲基化衍生物，因为比白藜芦醇多了两个甲氧基，因此pte具有更高的亲脂性，更高的生物利用度及更低的毒性。现有技术并未记载pte与肠上皮屏障保护两者之间关系的有关技术内容。技术实现要素：有鉴于此，本发明的目的在于提供一种紫檀芪在制备预防和/或治疗肠上皮屏障损伤药物中的应用，通过靶向nf-κb介导的mlck-pmlc通路对紧密连接蛋白进行调控，维持肠上皮屏障的完整性从而降低肠道通透性。为了实现上述发明目的，本发明提供了以下技术方案：本发明提供了一种紫檀芪在制备预防和/或治疗肠上皮屏障损伤药物中的应用，所述紫檀芪通过调节紧密连接蛋白的表达水平保护肠上皮屏障。优选的，所述肠上皮屏障损伤包括tnf-α刺激所致。优选的，所述肠上皮屏障损伤包括葡聚糖硫酸钠盐所致。优选的，所述紫檀芪抑制mlck-pmlc的激活。优选的，所述紫檀芪抑制肠上皮细胞nf-κb信号活化。优选的，所述紫檀芪抑制nf-κb活化从而抑制mlck-pmlc的激活。优选的，所述紫檀芪抑制肠上皮细胞nf-κb介导的mlck-pmlc途径调节肠上皮紧密连接分子的表达。本发明还提供了一种紫檀芪在制备预防和/或治疗肠道菌群易位药物中的应用。本发明还提供了一种治疗和/或预防肠上皮屏障损伤的药物，其特征在于，所述药物中包括紫檀芪。优选的，所述药物中紫檀芪的有效剂量为0.004-0.04mg/g。本发明的有益效果：本发明提供了一种紫檀芪在制备预防和/或治疗肠上皮屏障损伤药物中的应用，pte可抑制tnf-α刺激导致的对肠上皮细胞层完整性的破坏，可减少tnf-α诱导的体外上皮完整性损伤。紫檀芪可逆转dss诱发的肠上皮屏障破坏所致的tj分子claudin-4，occludin，zo-1下调以及与阳离子进出相关的claudin-2上调，表明pte对肠上皮屏障的保护作用与调节紧密连接蛋白有关。本发明还发现pte可抑制小鼠结肠mlck-pmlc信号激活，并且可以显著抑制dss刺激所致的小鼠肠上皮nf-κb/p65和mlck表达和细胞内分布，即pte可通过nf-κb介导的mlck-pmlc通路保护肠上皮屏障及其紧密连接蛋白，可用于制备预防和/或治疗肠上皮屏障损伤和肠道菌群易位药物。附图说明图1为pte拮抗tnf-α刺激caco2所致的ter值变化，其中与tnf-α组比较，“*”表示p<0.05，“**”表示p<0.01，“***”表示p<0.001；图2为pte拮抗tnf-α刺激caco2所致的单层屏障通透性变化，其中与tnf-α组比较，“*”表示p<0.05；图3为小鼠造模过程；图4为三组小鼠的生存曲线；图5为三组小鼠体重对比图，其中与dss组比较，“**”表示p<0.01；图6为七天内各组小鼠dai评分图；图7为不同处理组小鼠的结肠解剖外观图，其中与dss组比较，“*”表示p<0.05；图8为不同处理组小鼠he染色图片与组织病理学积分，其中与dss组进行比较，“**”表示p<0.001；图9为血清中的fitc浓度检测，其中与dss进行比较，“**”表示p<0.01；图10为小鼠肠系膜和肝脏组织的菌群异位现象，其中与dss比较，“***”表示p<0.001；图11为小鼠结肠中occludin，zo-1，claudin-4，claudin-2的表达，其中“**”表示p<0.01，“****”表示p<0.0001；图12为小鼠结肠中紧密连接蛋白claudin-2、claudin-4、zo-1和occludin蛋白表达水平，其中“**”表示p<0.01，“****”表示p<0.0001；图13为紧密连接蛋白zo-1和occludin的免疫荧光图及荧光表达量，其中与dss组进行比较，“****”表示p<0.0001；图14为pte抑制dss诱发的mlck-pmlc的信号活化，其中与dss组进行比较，“****”表示p<0.0001；图15为pte处理抑制dss诱发的nf-κb蛋白活化，其中与dss组进行比较，“***”表示p<0.001，“****”表示p<0.0001；图16为荧光共聚焦实验评价pte处理对dss诱发的小鼠肠上皮细胞nf-κb/p65与mlck表达的调节作用，其中与dss组进行比较，“****”表示p<0.0001。具体实施方式本发明提供了一种紫檀芪在制备预防和/或治疗肠上皮屏障损伤药物中的应用，所述紫檀芪通过调节紧密连接蛋白的表达水平保护肠上皮屏障。本发明对于紫檀芪的来源没有特殊限定，可以通过从自然界生物体中分离、化学合成，也可通过市售获得。在本发明中，所述肠上皮屏障损伤优选为tnf-α刺激和葡聚糖硫酸钠盐所致。在本发明中，所述紫檀芪优选的通过抑制mlck-pmlc的激活、抑制肠上皮细胞nf-κb信号活化的方式保护肠上皮屏障，更优选的通过抑制nf-κb活化从而抑制mlck-pmlc的激活，进而保护肠上皮屏障。在本发明中，紫檀芪通过调节紧密连接蛋白的表达水平保护肠上皮屏障，作用途径优选为抑制肠上皮细胞nf-κb介导的mlck-pmlc途径调节肠上皮紧密连接分子的表达。在本发明所述应用中，所述药物中优选的还包括药学上可接受的辅料。本发明所述药物中，以紫檀芪为有效成分，所述紫檀芪在所述药物中的有效剂量优选为0.004-0.04mg/g。本发明对所述辅料的来源及种类并没有特殊限定，利用本领域的常规药学辅料即可。本发明还提供了一种紫檀芪在制备预防和/或治疗肠道菌群易位药物中的应用。在本发明中，所述的紫檀芪与上述应用中紫檀芪完全一致，在此不做赘述。在本发明所述肠道菌群易位药物的应用中，所述药物中优选的还包括药学上可接受的辅料。本发明所述药物中，以紫檀芪为有效成分，所述紫檀芪在所述药物中的有效剂量优选为0.004-0.04mg/g。本发明对所述辅料的来源及种类并没有特殊限定，利用本领域的常规药学辅料即可。本发明还提供了一种治疗和/或预防肠上皮屏障损伤的药物，所述药物中包括紫檀芪。在本发明中，所述药物优选的还包括药学上可接受的辅料，本发明对所述辅料的来源及种类并没有特殊限定，利用本领域的常规药学辅料即可。本发明所述药物优选制备成口服剂型和非口服剂型，所述口服剂型优选包括：片剂、胶囊、散剂和颗粒；所述非口服剂型优选包括针剂，更优选包括注射液针剂。本发明对所述各剂型的制备方法并没有特殊限定，利用本领域的常规制备方法即可。本发明所述药物中紫檀芪的有效剂量优选为0.004-0.04mg/g，更优选为0.01mg/g。下面结合实施例对本发明提供的技术方案进行详细的说明，但是不能把它们理解为对本发明保护范围的限定。在本发明实施例中，对数据的统计处理为：采用spss18.0软件进行统计分析。所有实验结果的数据以平均数±标准偏差表示，采用单因素方差分析，方差齐时组间的多重比较采用duncan’s新复极差法，方差不齐时组间比较采用dunnett’st3法。选用graphpadprism5.0进行绘图分析。实施例1紫檀芪(pte)对肠上皮细胞的保护作用1.人结肠癌caco2细胞的培养(1)复苏细胞：将已冻存好的caco2细胞株从液氮罐取出，放入37℃温水中迅速溶解，再将溶解后的细胞液加入4ml含有dmem培养基的15ml离心管中，于1500rpm/min离心3min，离心完成后弃掉上清，加入1ml的dmem培养基轻轻吹打使细胞悬浮于培养基中，再将细胞悬浮液加入含有5mldmem培养基的培养皿中，“十”字轻轻摇匀后放入37℃含有5％的co2培养箱内培养。(2)培养条件：37℃、5％co2，培养基为含有10％胎牛血清(fbs)，2mg/l胰岛素和1％青链霉素混合液的dmem，培养时需要每天更换培养基。(3)细胞计数：将0.4％的台盼蓝染液与细胞悬浮液以1：1的比例混合均匀后，吸取10μl从计数板边缘缓缓加入，使之充满计数板和盖玻片之间的空隙中，稍候片刻于低倍镜(10×10)观察并进行计数，计数采取计上不计下、计左不计右原则，细胞数目＝四周大格的细胞/4×10000×稀释倍数。(4)细胞传代：在培养箱内拿出长满细胞的培养皿，倒掉培养基，用1-2ml的pbs清洗培养皿2次以去除培养皿中的死细胞，加入1ml的胰酶消化1.5min后加入1ml培养基终止消化，将细胞移于15ml离心管中1500rpm离心3min，弃上清液，加入新鲜培养基轻轻吹打细胞使之悬浮，以1：2的比例进行细胞传代，caco2的传代周期为1-2天。(5)细胞冻存：将dmso与培养基以7：3的比例混合制成冻存液至于冰上备用，将细胞消化离心后加入0.5ml培养液悬浮细胞，再将细胞悬浮液移至装有0.5ml的冻存管中混匀，于4℃放置30min后移于-80℃保存，长期保存需置于液氮冻存。2.细胞紧密连接模型的建立与评价caco2细胞系是人的结肠癌细胞，结构和功能类似于分化的小肠上皮细胞。与小肠上皮细胞在形态学上相似，具有相同的极性及紧密连接，因此，在本发明中采用caco2细胞作为体外肠屏障模型。(1)紧密连接模型的建立：将细胞caco2以8×104/小室的密度接种于孔径为0.4μm，膜面积为0.33cm2的transwell培养板上，小室外bl层加入600μl的dmem培养基，小室内ap层加入细胞悬浮液100μl，接种后第一周隔日换液，第二周开始每日换液持续到21天。当细胞分化21天建立细胞紧密连接模型后，无血清培养24h。(2)组别设置：实验组(pte组)在transwell小室ap层加入10μm的pte预处理6h后，再加入30ng/ml的tnf-α处理；阳性对照组(tnf-α组)在transwell小室ap层加入30ng/ml的tnf-α处理；对照组(con组)不进行任何处理。分别在三组处理2h，4h，8h，12h，24h，48h后测量小室的电阻值变化。测量前，将电极浸入75％的酒精中浸泡15min，然后放在已灭完菌的pbs中备用。测量时，先将培养板放入超净台内平衡半小时以保证数值得稳定性，再测定培养板三个不同方向的电阻值取其平均值乘以膜面积，因为transwell的空白膜也有一定的电阻值，所以实际的电阻值应减去空白膜的电阻值。计算公式：ter＝(r-r空白）*a（ω*cm2)(注：ter是上皮细胞对离子的通透性的指标，用于评估屏障功能，r为实际测量电阻值，r空白为未添加细胞的空白膜电阻值，a为膜面积)本发明通过形成单层致密细胞层来模拟体外肠上皮屏障的方法，跨上皮电阻值越大，则细胞层越完整。结果如表1和图1所示，与对照组相比，pte组的ter值在tnf-α作用8h之后开始显著下降(p<0.05)，而用10μm的pte预处理6h后，可看到pte可显著抑制ter值的下降；在tnf-α刺激24h时pte对细胞单层膜的保护作用呈现出最好的效果(p<0.001)，其电阻值分别为：空白对照组282.13±31.82ω/cm2，dss组86.53±10.12ω/cm2，pte组179.2±2.32ω/cm2。由此可以看出，当tnf-α刺激可使得细胞致密的单层屏障遭到破坏，其电阻值显著下降，而在pte预处理组可明显抑制tnf-α刺激导致的ter值下降，提示pte对细胞的致密单层膜屏障具有保护作用。表1各组的ter值注：“*”表示p<0.05，“**”表示p<0.01，“***”表示p<0.001实施例2细胞单层通透性细胞单层透过率是另一个测量体外屏障模型是否遭到破坏的重要因素，测量荧光标记大分子物质fitc-葡聚糖(fitc-dextran)通过单层细胞的通过率，用来评价单层细胞的通透性。采用实施例1所建立的紧密连接模型。caco2细胞分化21天后，用预温为37℃的pbs溶液缓慢冲洗transwell小室2次，然后在transwell小室的ap层加入0.1mg/ml的fitc100μl，bl层则加入600μlpbs缓冲液，将细胞培养板放于co2培养箱内孵育1h后，分别于transwell的bl侧及ap侧各取100μl的液体，利用多功能酶标仪计算荧光吸光度(其中激发波长设定在480nm，发射波长设定在520nm)，并计算fitc的通透率及跨膜转运表观渗透系数(papp)。计算公式：papp＝δq/(δt*a*co)(cm*s-1)(其中δq为δt的转运量，a为膜面积，co为caco2细胞ap侧的初始浓度)采用实施例1所建立的紧密连接模型。caco2细胞进行培养21天形成致密的单层膜屏障后无血清培养24h。组别设置：实验组(pte组)提前加入pte预处理6h后，再加入30ng/ml的tnf-α处理24h；阳性对照组(tnf-α组)直接加入tnf-α处理24h；空白对照组(con组)不进行任何处理。24h后在基底层加入提前预热到37℃的pbs缓冲液600μl，上层加入用pbs缓冲液稀释到1mg/ml的fitc-dextran，培养1h后分别从基底层及上层吸取100ml的培养液加入全黑的96孔板上按要求测其吸光度。结果如表2和图2所示。可以看出加入tnf-α刺激细胞可使细胞的通透率增高，而pte预处理6h可显著抑制细胞的通透率增加(p<0.05)。提示pte可保护细胞单层膜屏障遭到破坏，对体外膜屏障具有一定的保护作用。表2各组的细胞通透率注：“****”表示p<0.0001ter实验与细胞通透性实验是验证细胞模拟的体外上皮完整性是否遭到破坏的重要指标，实验结果初步表明pte可抑制tnf-α刺激导致的对肠上皮细胞层完整性的破坏，pte具有减少tnf-α诱导的体外上皮完整性损伤的潜力。实施例3pte对小鼠肠上皮屏障的保护作用研究肠道损伤小鼠模型的健康评价实验动物培养选用8-10周雄性c57bl/6小鼠，体重20-23g，购自北京华阜康生物科技股份有限公司。所有的小鼠均置于中国医学科学院放射医学研究所动物实验中心，在室温23±3℃，湿度50％±10％条件下饲养，在12h的明暗交替循环下，正常饮食观察一周后，无任何病症后用于本实验。所有动物实验均通过天津商业大学伦理委员会批准。建立小鼠肠道损伤模型小鼠随机分为3组：正常对照组、葡聚糖硫酸钠盐(dss，分子量：36-50kda)处理组、pte组，每组10只。空白对照组饮食正常，其余两组在饮用水中加入2.5％dss，紫檀芪组每天灌胃10mg/kg的pte，连续喂养7天静脉取血后脱颈处死。小鼠造模过程如图3所示。健康检测(1)体重记录小鼠适应一周后便开始实验，从实验加上的第一天开始记录小鼠体重，当小鼠的体重比前一天下降15％时，则认为小鼠处于病态。若24小时内，体重下降明显，超过20％或显示出濒死迹象，如退回行为、体温降低、弓背、翘毛、脱毛等，则对小鼠给予安乐死。(2)疾病活动指数评分在小鼠造模期间，每日对小鼠进行体重、大便稠度以及大便出血情况的监测。此次实验采用腹泻评分法，根据表3和表4的评分规则，对小鼠活动进行评分。首先根据粪便的成型情况对小鼠进行结肠评分，0分表示为正常的粪便；1分表示已失去已有形状的粪便；2分表示明显的痢疾和伴有肛门附近明显的污秽；3分表示血便或者严重的痢疾，尾部和肛门处伴有大量的污秽。同时根据体重下降，腹泻及直肠出血情况进行临床疾病活动评分。一般在dss作用后的第三天左右，开始出现腹泻的症状，在dss处理后的第4到7天的时间里，是腹泻的高发期，病情开始加重，每天对小鼠进行炎症评分，监测小鼠发病情况。表3结肠评分表(0-4分)表4临床疾病活动表(0-4分)不同组别小鼠的结果如表5和图4-图7所示。表5小鼠的体重表从图4生存曲线图可以看出，在小鼠造模七天后，dss组小鼠死亡率为20％，而pte小鼠虽然也出现了死亡现象，但其死亡率为10％，低于dss组。从图5可以看出，dss模型组在第三天体重开始下降，而pte可以明显逆转dss导致的体重下降(p<0.01)。在第6天时，dss组小鼠体重已经下降到20g以下，而pte组体重始终保持在20g以上，说明pte可以保护dss所致的体重下降。除了生存率与体重外，小鼠腹泻程度也是dss造模过程中的一个关键性指标。小鼠在被dss刺激后的第三天便开始出现轻微的腹泻现象，第四天开始便出现严重的腹泻，随着时间的增加，会出现便血现象，严重的会出现弓毛，行动变缓，绒毛湿润，更严重的会死亡。由图6a可以看到在dss作用后的第三天，是腹泻的高峰期，dss组大部分老鼠已经开始出现粪便不成形、绒毛潮湿的现象。在第四天小鼠普遍出现拉稀的情况，部分小鼠开始出现血便现象。随着时间的增加，dss处理组小鼠的血便和稀便情况越发严重，而在pte组小鼠出现粪便不成形的现象明显减少，稀便和血便的现象也得到缓解。上述结果提示，pte对dss诱导的肠道损伤具有保护作用。结肠的表观特征是评价肠道损伤的另一个重要指标。从图7a小鼠的结肠解剖图中可以看到，dss模型组出现严重充血水肿、肠壁增厚和溃疡，结肠内还有血便的累积；pte处理组小鼠较模型组虽也含有血便，但充血水肿等现象得到改善。图7b显示的是我们对小鼠结肠长度进行测量的结果，从图中可以看出紫檀芪明显改善了小鼠的结肠长度(p<0.05)。以上结果说明pte可改善dss诱导的小鼠肠道损伤。实施例4病理学检测苏木素(hematoxylin)和伊红(eosin)染色简称he染色。因苏木素染液为碱性，它可以使细胞核内的染色质以及胞质内的核糖体染成紫蓝色，而伊红使酸性染料，可以使细胞质和细胞外基质中的成分染为红色。切片制作首先将组织固定在4％甲醛溶液中，固定48h后将标本放入组织脱水浸蜡机中，依次放进70％乙醇、75％乙醇、85％乙醇、90％乙醇、95％乙醇、无水中及二甲苯中浸泡，在65℃条件下浸蜡后行进行石蜡包埋。将包埋以后的蜡块置于冰上进行冷却。再将其切成厚度约为的4μm切片，置于43℃烤片机上烘烤半小时左右，再放入65℃烤箱中烘烤2小时，最后收进切片盒中备用。伊红-苏木素(hematoxylinandeosin，he)染色组织行脱蜡复水：(1)石蜡切片置于烘箱中烤1-2小时，使石蜡脱落(2)二甲苯ⅰ20min(3)二甲苯ⅱ20mi(4)无水乙醇ⅰ5min(5)无水乙醇ⅱ5min(6)95％乙醇3min(7)90％乙醇3min(8)85％乙醇3min(9)75％乙醇3min(10)蒸馏水3min苏木素核染：切片脱蜡复水之后，将切片放入pbs缓冲液中洗3次，每次洗5min。之后将切片放入苏木素染液中染色5min，染色完毕后用流水冲洗掉多于的染色液，注意勿正对组织冲洗。冲洗完毕后可在显微镜下观察苏木素的染色情况，如果颜色太深可用1％的盐酸酒精分化，分化时间不易太长，几秒即可。如蓝色太浅可继续放在苏木素染液中进行染色。伊红染色：苏木素染色完毕后，将切片放入伊红染液中进行染色10min，取出切片，用流水冲洗掉多余的伊红染液。然后在显微镜下观察，如果红色染色太浅则可继续放于伊红染液中延长染色时间。脱水透明及封片：切片染色完毕后进行脱水封片处理。先将切片依次用75％、80％、90％的乙醇处理30s，再用95％的乙醇处理1min，无水乙醇ⅰ、无水乙醇ⅱ处理3min，二甲苯ⅰ、二甲苯ⅱ依次处理5min，最后用中性树胶进行封片，于数字光学显微镜下观察并进行拍照。将实施例3构建成功的3组小鼠(正常对照组、葡聚糖硫酸钠盐(dss，分子量：36-50kda)处理组、pte组，每组10只。空白对照组饮食正常，其余两组在饮用水中加入2.5％dss，紫檀芪组每天灌胃10mg/kg的pte，连续喂养7天静脉取血后脱颈处死)分别进行上述石蜡切片和he染色操作，结果如图8所示。病理检测可以直观的看到小鼠结肠的变化情况。通过he染色病理检测(图8)，可知，dss组小鼠的杯状细胞明显减少，隐窝消失，绒毛遭到破坏，几乎看不到完整的结构，伴有明显的肠绒毛脱落的现象。而pte组小鼠，基本保留了完整的肠绒毛结构，并无明显的肠绒毛脱落现象，也能看见完整的杯状细胞及隐窝，而且中性粒细胞浸润现象明显减少。组织病理学评分显示pte组得分明显较dss组低(p<0.01)。组织学评分分级如下：a)炎症严重度：0＝无；1＝轻微；2＝中等；3＝严重；4＝非常严重；b)病变深度：0＝无；1＝粘膜层；2＝粘膜下层；3＝肌肉层；4＝透壁的；c)隐窝损害：0＝无；1＝基础1/3损坏；2＝基础2/3损坏；3＝仅表面上皮完好无损；4＝整个隐窝和上皮丧失。实施例5体内肠黏膜屏障检测血液中fitc-dextran的检测(1)将fitc-dextran溶于生理盐水中配置成终浓度为100mg/ml的溶液。配制fitc-dextran溶液时应全程避光。根据实施例3分别构建成功的3组小鼠体重给小鼠灌入fitc-dextran，按照44mg/100g的剂量对小鼠进行灌胃。灌胃前一天晚上对小鼠进行断水断食处理。灌胃时，给每只小鼠按照灌胃顺序进行标记，每只小鼠间隔5min灌胃。4h后，对小鼠进行眼静脉丛取血处理，加入到1.5ml离心管中，离心管用锡箔纸包裹，取血时应注意规范操作，避免溶血。将取得的血液常温避光静置2h后于3000r/min、4℃条件下离心10min，离心完毕后取上清置于超低温冰箱避光保存。(2)将fitc-dextran用生理盐水分别稀释成0，250，500，2000，6000，8000ng/ml的浓度梯度。在485nm激发光，528nm发射光条件下用酶标仪检测其吸光度并绘制标准曲线。以未进行灌胃的fitc-dextran的小鼠血清为背景值，灌胃fitc-dextran的小鼠血清样品按照1：1的比例用生理盐水稀释，稀释后的样品加入200μl到全黑的96孔板内，同样在485nm激发光，528nm发射光下检测其吸光度，并按照标准曲线计算血清中的fitc浓度以确定肠道的“肠漏”程度。dss诱导肠道损伤模型通常使肠上皮屏障遭到破坏，发生“肠漏”现象。fitc-dextran是一种荧光标记物，采用灌胃的方法将fitc-dextran注入小鼠体内，如果小鼠肠道屏障发生破坏，带有荧光的fitc-dextran就会进入血液，可通过检测小鼠血清的荧光值来评价小鼠肠道屏障的破坏程度。在小鼠灌胃fitc-dextran4小时后，静脉取血收集小鼠血清，采用带有荧光功能的酶标仪在激发波长为480nm，发射波长为520nm的条件下测定荧光值。结果如图9所示。从图9可以看出dss组小鼠血清中荧光值明显高于空白对照组，而pte明显降低了荧光值(p<0.01)，表明pte对小鼠肠黏膜屏障具有良好的保护作用，有效地抑制dss刺激导致的“肠漏”现象。实施例6菌群移位检测肠上皮屏障遭到破坏会导致细菌从肠管腔转移到肠系膜淋巴结，在肠系膜淋巴结检测到的细菌量越多则说明肠屏障破坏越严重。为了进一步证明pte对小鼠肠上皮屏障是否有保护作用，本发明分别取实施例3构建成功的3组小鼠(con组、pte组和dss组)的肠系膜淋巴结以及肝脏，测量其菌含量以探究肠黏膜的破坏程度，具体步骤如下：(1)大肠杆菌trans10的培养：用接种环在冻存液里蘸取大肠杆菌trans10用划线法接种于平皿内于37℃过夜培养，挑取单菌落接种于含有lb液体培养基的试管中于37℃过夜培养。(2)基因组dna的提取：取米粒大小的肠系膜淋巴结称重，放于已灭菌的1.5ml离心管中，用组织破碎机使之破碎，后续步骤按照天根生化科技(北京)有限公司的血液/组织/细胞基因组提取试剂盒(dp304)说明书提取样品中的基因组dna。根据天根生化科技(北京)有限公司的血液/组织/细胞基因组提取试剂盒(dp302)说明书提取大肠杆菌trans10中的基因组dna，用来绘制标准曲线。(3)采用16sr-rna基因的v6-v8可变序列设计引物，序列如下：968-f：5’-aacgcgaagaaccttac-3’和r-1401:5’-cggtgtgtacaaggccc-3’。(4)将大肠杆菌trans10的基因组dna梯度稀释，进行rt-pcr，以单位重量基因组dna为横坐标，相对应的ct值为纵坐标绘制标准曲线。与肝脏有关的操作同肠系膜淋巴结。参照标准曲线，对肠系膜淋巴结和肝脏中的基因组dna进行分析，计算单位重量组织中细菌的基因组dna的重量，绘图。本发明将大肠杆菌trans10的基因组dna梯度稀释，进行rt-pcr，以单位重量基因组dna为横坐标，相对应的ct值为纵坐标绘制标准曲线，再取肠系膜淋巴结以及肝脏的基因组dna进行rt-pcr，计算单位重量组织的细菌组dna。结果如图10所示。从图10可以看出，用dss处理7天后，小鼠肠系膜淋巴结中细菌基因组dna的含量明显上升，而pte组可明显抑制菌群向肠系膜淋巴结转移(p<0.001)，而从肝脏基因组dna的检测结果来看，三个处理组的小鼠均未发现菌群易位的现象，原因可能是七天的造模时间细菌还未转移至肝脏老鼠就被处死。由实施例3-实施例6可知，本发明通过体内实验研究发现加入pte以后可以改善小鼠的健康状况，并且显著降低小鼠的死亡率。对小鼠进行解剖后可以看到dss组的结肠长度明显短于空白对照组，而加入pte后可以使之得到改善，除此之外在结肠解剖图中可以看到dss组的粪便不成形，并伴有血便，结肠出现水肿、肠壁增厚等现象。而在pte组粪便相对成型，虽也有血便的产生，但结肠长度相对dss组更长，并且没有出现水肿现象。从小鼠结肠的石蜡切片he染色图，我们也可以更加直观的看到dss组肠道遭到严重破坏，出现隐窝消失，绒毛结构不完整等现象，在pte组可明显看到较完整的隐窝及绒毛结构。以上结果表明pte对小鼠肠上皮屏障具有良好的保护作用。在上述病理学的基础上进一步对小鼠进行了功能评价。利用血清中fitc-葡聚糖的荧光方法，发现dss组的荧光值显著高于空白对照组，说明dss严重破坏小鼠肠上皮屏障完整性，发生“肠漏”，而pte可以显著降低血清中的荧光值，明显改善dss造成的小鼠肠上皮屏障破坏，支持pte对小鼠肠上皮屏障具有保护作用，可以有效的抑制“肠漏”。进一步的肠道菌群移位实验表明dss组的肠道屏障遭到破坏，细菌从肠道移位到肠系淋巴结，而pte组中肠系淋巴结中细菌含量明显低于dss组，进一步说明pte对肠上皮屏障具有保护作用。实施例7pte对肠上皮屏障的保护机制研究紧密连接蛋白由位于临近细胞之间的上皮顶部附近的多种蛋白质组装而成，控制细胞旁运输途径的通透性。紧密连接蛋白如occludin、claudin-2、claudin-4、zo-1被认为是维持肠上皮屏障功能的关键蛋白。不同的是occludin，claudin-4，zo-1参与了细胞旁屏障的形成，阻止分子通过肠上皮屏障。claudin-2被认为能够形成足够的阳离子选择性通道，将一个“紧密”的紧密连接变成一个漏的连接。因此，本发明分别剪取实施例3构建成功的3组小鼠(con组、pte组和dss组)结肠提取总pcr，用rt-pcr对小鼠中紧密连接分子occludin、claudin-2、claudin-4、zo-1的表达进行测定，具体操作如下：实时定量pcr检测结肠组织中rna的提取(1)取米粒大小的结肠组织放于1.5mlrnase的ep管中，然后在ep管中加入trizol试剂，加入的体积约为ep管的2/3体积，再加入2.00mm磁珠3颗，放入已提前放入-20℃预冷的组织细胞破碎仪中设置四档每30s进行破碎一次，重复几次直至破碎成匀浆为止。(2)结肠组织打成匀浆后，于12000r/min，4℃离心5min。(3)取上清，加入200μl的氯仿，静置5min后12000r/min，4℃离心10min，此时溶液会分为三层，分别是有机相、中间层、水相。(4)取上层的水相按1：1的比例加入异丙醇，转到均匀后于室温放置20min后12000r/min，4℃离心10min。(5)弃上清，加入用depc水配制的75％的乙醇，混匀，12000r/min，4℃离心10min，重复2次。(6)室温干燥后加入30μl的depc水使沉淀溶解。注意：干燥时不可过于干燥，否则很难溶解。(7)已溶解rna的水作为空白对照，在nanodrop仪器上加入1μl的样品可直接测量出rna浓度，取1μg的rna用于反转录为cdna，未用完的rna储存于-80℃备用。查询该基因信息(1)打开网站ucscgenome选择genomebrowser(2)选择种属(mouse)，然后点go(3)输入目的基因，点击go(4)单击方框内的深色区域(5)在新的对话框中选择genomicsequece,在弹窗中选择cdsexons和introns(即编码区外显子和内含子)，并选择exonsinuppercase,everythingelseinlowercase(外显子为大写形式，其他为小写形式)，然后点击submit(6)将弹出的序列复制到snapgene中，打开snapgene软件，选择newdnafile，粘贴复制好的基因序列，单击ok，选择sequence界面。设计引物(1)打开primerbank主页：https://pga.mgh.harvard.edu/primerbank/(2)选择keyword查询，选择种属mouse，输入文本，单击submit。引物特异性校验将备选引物拷贝到snapgene的查询页面中，检验其是否是跨内含子的引物。blast检查引物是否有其他非特异性扩增。打开页面：http://www.ncbi.nlm.nih.gov/tools/primer-blast/index.cgilink_loc＝blasthome，输入上下游引物，选择种属(小鼠：musmusculus)，点击getprimers，查看引物特异性。引物检验溶解曲线和循环数：运用实时定量pcr(rt-pcr)对已设计的引物进行校验，用正常加入模板的与没有加模板的引物进行对比，检测指标：1.扩增产物的溶解曲线是否是双峰，若为双峰则需要重新设计引物；2.rt-pcr的循环数空白水对照是否有ct值；若有，重新设计引物；3.琼脂糖凝胶鉴定：将pcr扩增的产物进行琼脂糖凝胶电泳，检测产物分子量。4.检测产物扩增效率：十倍稀释cdna模板，每个稀释浓度检测该引物扩增效率，通常选用5个稀释浓度绘制标准曲线。逆转录聚合酶链式反应(rt-pcr)按照罗氏公司逆转录试剂盒产品说明书推荐方法进行逆转录，反应体系：mgcl24μl10×buffer2μlrnasin0.5μl10mmdntp2μlrandomprimer1μlrtranscriptase0.5μltotalrna1μgrnafreeh2o补齐至20μl反应条件：25℃10min，50℃60min，85℃5min，4℃无限长时间。获得cdna后，加无rnase水稀释特定浓度后使用，-20℃储存备用。实时定量pcr反应采用rochepcr试剂盒进行荧光定量聚合酶链式反应，反应体系：cdna1μl上游引物0.5μl下游引物0.5μlh2o3μl2×sybrgreen5μl反应总体积10μl实时定量pcr反应在rochelc96上进行，反应条件为：95℃预变性10min每一样品均设3个重复孔，以18s为内参计算其平均值作为rq值。每次pcr反应后均进行溶解曲线分析以确认扩增产物的特异性。实验所用到的引物序列如表6：表6rt-pcr所用引物结果如图11所示。由图11可以看出紧密连接蛋白zo-1,claudin-4，occludin的表达水平在dss的刺激下明显降低，而控制阳离子出入的紧密连接蛋白claudin-2的蛋白含量增高，说明dss刺激使肠上皮屏障被破坏，控制细胞旁屏障形成的紧密连接蛋白含量降低，而pte可显著的使zo-1(p<0.0001)，claudin-4(p<0.0001)，occludin(p<0.0001)的表达上调，并降低了claudin-2的表达水平，初步推测pte可通过调节紧密连接的表达水平对肠上皮屏障起到保护作用。实施例8pte对肠上皮屏障的保护机制研究蛋白表达在基因层面证实了pte可以上调紧密连接蛋白的表达的基础上，本发明继续在蛋白层面进行进一步的确认，分别提取实施例3构建成功的3组小鼠(con组、pte组和dss组)结肠的总蛋白，利用蛋白免疫印迹的方法检测紧密连接蛋白claudin-2、claudin-4、zo-1和occludin的表达，gapdh为内参，具体步骤如下：结肠总蛋白提取分别取20mg实施例3构建成功的3组小鼠(con组、pte组和dss组)的结肠组织加入200ul的pipa及pmsf混合液进行破碎匀浆，pmsf与pipa的比列为1：100，注意组织破碎仪应提前两小时放入冰箱-20℃预冷。匀浆后的组织应在4℃条件下离心，135000r/10min。取上清液。此时上清液即为提取的结肠蛋白。采用碧云天细胞核蛋白与细胞浆蛋白抽提试剂盒进行对已提取的组织蛋白进行定量。按1：3的比例在蛋白液里加入上样缓冲液，于100℃条件下煮沸10min，使蛋白变性。煮沸完毕后进行分装，避免反复冻融使蛋白变性，分装后的蛋白于-80℃冰箱保存。蛋白免疫印迹(1)清洗玻璃板：先用自来水将玻璃板两面搓洗干净，尤其注意胶缝之间不要有残余胶和杂质，否则配出来的胶会有气泡，再用蒸馏水冲洗干净。(2)检漏：将两块玻璃板放在配胶架子上，先在两板中注满蒸馏水，半小时后观察蒸馏水水位是否下降，如有此现象，则说明板子漏水，应重新放置玻璃板。(3)配胶：分离胶加样顺序(注意不同的胶浓度加样体积不同)：tris-buffer1.5mph8.8ddh2o30％丙烯酰胺10％sds10％apstemed按顺序加完上述试剂后轻轻摇晃烧杯混匀。(4)灌胶：用1ml的枪吸取混合液，沿着玻璃板的一边灌胶，待液体到达玻璃板的3/4左右即可。然后沿着玻璃板边缘再注入1-2ml的异丙醇进行压胶以去除气泡及使胶面更直，半小时左右待胶凝固后，倒去胶上层的异丙醇用蒸馏水洗2-3次后用吸水纸吸干。(5)配制浓缩胶，沿着玻璃板内壁向下插入梳子，注意不要出现气泡。(6)起梳子：待浓缩胶凝固后，两手分别捏住梳子的两边竖直向上轻轻将其拔出。(7)安装跑胶板：将胶安装在跑胶的夹子上，小玻璃板向内，大玻璃板向外，置入电泳槽内，应注意电极的位置，注入1×的电泳液。(8)上样：将蛋白样品从-80℃冰箱取出，充分混匀，沿着上样孔缓慢加入蛋白，若上样速度太快会使样品冲出加样孔。(9)电泳：将电泳仪连接在电泳槽上，注意电极的正负极，调节电压，先用80v电压，待样品跑至分离胶时，将电压换至120v，电泳至溴酚蓝刚跑出即可终止电泳，进行转膜。(10)转膜：电泳结束后，将胶取下，放入提前预冷的电转液中，剪与胶大小合适的pvdf膜，放入甲醇溶液中浸泡1.5min，将膜浸入转膜液中，夹板的黑色板朝下，从下往上依次是：海绵-滤纸-胶-膜-滤纸-海绵(黑胶白膜)，赶出气泡，置于转膜槽中，夹板的黑色面与转膜板的黑色面处于一个方向，接通电流250ma，90min。(11)封闭：用tbst配制5％的脱脂牛奶封闭液室温封闭1h，脱脂奶应现配现用。(12)孵育一抗：根据claudin-2、claudin-4、zo-1、occludin和gadph抗体说明书(均购于abcam公司，稀释比例为1：1000)，用5％的脱脂牛奶按一定比例对一抗进行稀释，现配现用，4℃摇床过夜。(13)孵育二抗：将膜取出，放在室内平衡1h后用1*tbst洗膜10min，重复三次。加入与一抗相对应的种属的二抗，用5％的脱脂牛奶按一定比例稀释二抗，孵育1h，后用1*tbst洗脱10min，重复三次。(14)显色：显色液a与显色液b以1：1比例混匀，将膜放入混合显色液中1min显色，曝光。结果如图12所示，在dss组小鼠紧密连接蛋白明显下调；而pte的加入可以抑制紧密连接蛋白以及与之相连的闭合蛋白zo-1的表达下调，同时下调了claudin-2的蛋白水平。这一结果与基因层面检测结果一致，均证明了pte对紧密连接分子的调节作用。实施例9免疫荧光检测为了更进一步验证pte可调节紧密连接蛋白的表达，用免疫荧光共聚焦实验分别对实施例3构建成功的3组小鼠(con组、pte组和dss组)的紧密连接蛋白zo-1和occludin进行共定位研究。具体步骤如下：(1)小鼠解剖后，每只小鼠将结肠取3段长5mm的组织置于4％的甲醛固定溶液中固定过夜。把样本放在去离子水中浸泡10min。(2)脱水透明浸蜡过程如表7所示。表7脱水透明浸蜡过程步骤试剂时间温度170％乙醇30分钟室温270％乙醇30分钟室温380％乙醇30分钟室温485％乙醇30分钟室温590％乙醇30分钟室温695％乙醇30分钟室温795％乙醇30分钟室温8无水乙醇130分钟室温9无水乙醇230分钟室温10二甲苯无水乙醇混合液5分钟室温11二甲苯110分钟室温12二甲苯210分钟室温13石蜡150分钟58-60度14石蜡250分钟58-60度(3)小鼠十二指肠包埋方法包埋机提前四小时开机预热。包埋机的设置：储模室设置温度70℃，蜡槽设置温度70℃，热台设置温度70℃，融蜡台设置温度70℃，冷台应提前预冷。将取下来的结肠横断面立着并按平放在包埋盒内，注意包埋蜡的温度不能超过62℃。将包埋好的组织块置于-20℃或者冰上，切片5微米，然后烤片过夜。(4)脱蜡复水过程如表8所示。表8脱蜡复水过程(5)抗原修复：组织切片置于盛满柠檬酸修复液的修复盒中，于微波炉内先中高火煮8min，停火7min，再中低火煮8min，此过程中应防止修复液蒸发导致干片。放置室温自然冷却后用pbs(ph＝7.4)缓冲液在脱色摇床上洗涤3次，每次洗5min。(6)阻断内源性过氧化物酶：滴100μl的3％的过氧化氢在切片的组织上，孵育20分钟，阻断内源性过氧化物酶，以减少非特异性背景染色。(7)封闭：用pbs缓冲液在脱色摇床上洗涤3次，每次5分钟，组化笔画圈(防止抗体流走)，在圈内滴加100μl的山羊血清均匀覆盖，室温封闭30min。(8)孵育一抗：甩掉e液，加zo-1的一抗(配制好的一抗工作液置于离心机中12000转离心5分钟，滴加一抗时，吸取上层的，底部的30μl舍弃不用)，避光湿盒4℃过夜孵育，湿盒内应放入适当的水，避免时间过长干片。(9)加二抗：用pbs缓冲液在脱色摇床上洗涤3次，每次5分钟，加入配制的与第一抗体相对应的hrp标记的二抗，室温孵育50min。(10)fitc荧光信号：用pbs缓冲液在脱色摇床上洗涤3次，每次5分钟，加入100μl已稀释过的fitc溶液，配制fitc的过程全程避光，湿盒室温孵育10分钟。(11)第二次抗原修复：用pbs缓冲液在脱色摇床上洗涤3次，每次5分钟，再用超纯水在脱色摇床上洗涤3次，每次5分钟，组织切片置于盛满柠檬酸修复液的修复盒中，于微波炉内先中高火煮8min，停火7min，再中低火煮8min，此过程中应防止修复液蒸发导致干片。放置室温自然冷却后用pbs缓冲液在脱色摇床上洗涤3次，每次洗5min。(12)封闭：在组织笔画的圈内滴加100μl的山羊血清均匀覆盖，室温封闭30min。(13)第二抗体孵育：甩掉e液，加occludin的一抗(配制好的一抗工作液置于离心机中12000转离心5分钟，滴加一抗时，吸取上层的，底部的30μl舍弃不用)，避光湿盒4℃过夜孵育。(14)二抗孵育：用pbs缓冲液在脱色摇床上洗涤3次，每次5分钟，加入配制的与第二抗体相对应的hrp标记的二抗，室温孵育50min。(15)cy3荧光信号:用pbs缓冲液在脱色摇床上洗涤3次，每次5分钟，加入100μl已稀释过的cy3溶液，配制cy3的过程全程避光，湿盒室温孵育10分钟。(16)dapi核染：用pbs缓冲液在脱色摇床上洗涤3次，每次5分钟，加入100μldapi染核，室温孵育5分钟。(17)淬灭组织自发荧光：加入荧光猝灭剂室温孵育5min，淬灭组织自发荧光。(18)封片：流水冲洗20min后，用抗荧光猝灭封片剂进行封片。结果如图13所示，在正常组小鼠肠上皮，zo-1(绿色)和occludin(红色)主要分布在细胞膜上，并且表达量比较高；而在dss组zo-1和occludin的表达量明显降低，zo-1甚至基本没有表达；当给予pte治疗后，在小鼠肠上皮可看到zo-1和occludin的表达量明显提高。图13b是本发明对上述考察的紧密连接蛋白荧光表达量定量分析的结果，从图中可以明显看到pte对dss诱发的zo-1及occludin表达抑制具有调节作用。综合上述实验结果，表明pte可以逆转dss刺激对紧密连接蛋白表达量的影响，从而维护肠上皮的稳定。实施例10经过上述实施例可知，pte通过上调紧密连接分子的表达改善肠道上皮的稳定性。本发明进一步研究了pte调节紧密连接蛋白的机制。肠上皮紧密连接蛋白受细胞骨架的肌球蛋白轻链(mlc)控制，而肌球蛋白轻链的激酶mlck又介导mlc磷酸化(pmlc)，从而调节肠上皮紧密连接分子和细胞旁渗漏通路。具体地讲，就是肠上皮细胞的zo-1将紧密连接与肌球蛋白连接在一起，当mlck-pmlc通路被激活，肌球蛋白发生收缩，导致zo-1及与其相连的紧密连接蛋白发生重排。所以，本发明的研究工作聚焦于pte是否可以抑制mlck-pmlc通路的激活从而提高紧密连接的表达从而保护肠上皮屏障。本发明分别对实施例3所构建的3组小鼠(con组、pte组和dss组)结肠的总蛋白进行提取，利用蛋白免疫印迹的方法检测p-mlc、mlc、mlck的表达情况，β-actin为内参，具体步骤同实施例8，并且针对于本实施例具体的蛋白情况进行适应性调整。结果如图14所示，dss刺激可以激活mlck，而mlck是使mlc磷酸化的一种酶，当mlck被激活，导致mlc磷酸化；而在pte组，可明显降低由dss诱导的mlck激活和mlc的磷酸化。这一结果表明，mlck-pmlc通路是pte发挥肠上皮屏障稳定作用的靶信号。实施例11在确定pte调控肠上皮mlck-pmlc信号通路的基础上，本发明又进一步探讨pte如何调节mlck。本发明分别对实施例3所构建的3组小鼠(con组、pte组和dss组)结肠的总蛋白进行提取，利用蛋白免疫印迹的方法检测p-p65、laminb1、p65、p-iκbα、iκbα的表达情况，gapdh和β-actin为内参，具体步骤同实施例8，并且针对于本实施例具体的蛋白情况进行适应性调整。结果如图15所示，dss刺激下，小鼠肠上皮nf-κb信号活化，iκbα在胞浆内被磷酸化激活，导致nf-κb分子的p65组分被激活并进入细胞核；而pte处理可明显抑制dss刺激所致的小鼠肠上皮细胞iκbα(p<0.0001)和p65(p<0.001)的激活，说明pte确实可以靶向调节nf-κb这条通路抑制dss所致的肠道损伤。实施例12既然pte可以抑制dss所指的肠上皮nf-κb信号活化，结合nf-κb激活可以上调mlck的知识，本发明又进一步研究pte是否调节nf-κb介导的mlck-pmlc通路。本发明分别对实施例3所构建的3组小鼠(con组、pte组和dss组)结肠的总蛋白进行提取，用免疫荧光共聚焦实验分别对实施例3构建成功的3组小鼠(con组、pte组和dss组)的mlck和p65进行共定位研究，具体步骤同实施例9，并且针对于本实施例具体的蛋白情况进行适应性调整。结果如图16所示，可以看到在正常条件下小鼠肠上皮mlck(绿色)的表达量很少，p65(红色)的表达也主要在细胞胞浆并没有入核；而一旦受到dss刺激，小鼠肠上皮细胞的mlck明显被激活，其表达量明显升高，并且伴有明显的p65从胞浆向核转移现象。具体地说，从图中可见在dss组小鼠肠上皮细胞中可见红色的nf–κb/p65亚单位进入细胞核内与蓝色标记的细胞核结合为紫色，亦即图中可看到大面积的紫色区域，说明p65大量被激活入核；而且，p65被激活的背景下，肠上皮细胞胞质中的mlck含量也随之升高，说明mlck受nf-κb/p65刺激后表达上调。与dss组相反，加入pte处理后，dss所致的小鼠肠上皮mlck与p65的表达明显降低，说明pte可有效的抑制nf–κb活化及相应的p65进入细胞核，从而抑制mlck的激活。综上可知，本发明首先通过rt-pcr验证紧密连接的表达情况，再通过western-blot以及免疫荧光共聚焦实验进一步证明pte可调节dss刺激导致的紧密连接发生改变。mlck-pmlc是调节细胞骨架的一条通路。本发明发现pte可以抑制dss诱发的肠上皮mlck激活和mlc磷酸化，支持pte具有肠上皮紧密连接蛋白保护功能。进一步地，鉴于nf-κb是mlck的激活分子，nf-κb通过与mlck的启动区结合从而激活mlck，本发明利用western-blot实验结合免疫荧光共聚焦定位证明pte可抑制dss诱导的nf-κb的激活，进一步抑制mlck的激活。所以，本发明清晰地解析了pte的肠上皮屏障保护作用及其机制：pte通过抑制dss诱发的肠上皮细胞nf-κb介导的mlck-pmlc途径调节肠上皮紧密连接分子的表达，从而维持肠上皮的完整性。以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本
技术领域：
的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。当前第1页12