一种蛋白质包裹铜基纳米晶的药物及其制备方法与应用

1.本发明属于生物医药技术领域，尤其是指一种蛋白质包裹铜基纳米晶的药物及其制备方法与应用。


背景技术：

2.铜是人体必不可少的微量元素，参与各种生物过程如哺乳动物胚胎的发育、红细胞的形成、线粒体的呼吸作用、自由基抑制、结缔组织成熟、铁代谢以及神经系统等，进而调节细胞稳态。在临床研究中，铜离子主要通过口服葡萄糖酸铜或静脉注射氯化铜溶液的方式给药来治疗铜缺乏症。目前，在肿瘤治疗研究中，铜离子对肿瘤的治疗作用主要是依赖其在肿瘤部位催化双氧水发生类芬顿反应，产生羟基自由基。此外，许多螯合铜离子的络合物也具有很高的细胞毒性，能够有效杀伤肿瘤。
3.而铜离子半衰期短，易于消除，如果采用铜离子系统给药的方式会增加体内总铜离子水平，缺乏对肿瘤细胞的选择性，造成靶向性差、毒副作用大等问题。纳米药物载体(如聚合物胶束、囊泡等)利用载药纳米粒在肿瘤部位的高通透性和滞留效应，实现药物的靶向递送，可提高药物在肿瘤组织的蓄积、改善肿瘤治疗效果。然而，铜离子由于水溶性好，化学性质活泼，多采用化学偶联或前药修饰等方式实现其在载体中的负载。周等就曾将可溶性铜离子转化为亲脂性油酸铜复合物后再加载到聚乙二醇化脂质体中，有效延长了铜在体内的循环时间，因而协同双硫仑纳米粒后在肝癌模型中显示出良好的抗癌效果，但脂质体对于铜的装载效率并不高。而后吴等也设计了中空介孔二氧化硅纳米粒用于铜离子的输送，但这类载体中硅元素较难降解，生物相容性较差，导致其临床应用受到明显限制。白蛋白载体是一种生物相容性良好的肿瘤靶向递送材料。利用白蛋白作为载体，通过生物矿化的方法制备载铜白蛋白纳米粒，可实现铜离子的有效递送。由于白蛋白能在酸性或碱性溶液中膨胀，而且其表面拥有大量的带电基团和和灵活的分子链段，从而表现出中空纳米笼的构象。因此，可以采用具有空腔结构的单分子白蛋白纳米反应器，通过金属离子与蛋白质结合，然后再经过氧化/还原/沉淀反应，使得金属纳米晶体或团簇成核生长，制备出白蛋白纳米药物。白蛋白作为载体制备的纳米粒具有较好的组织渗透性，可以渗透进入肿瘤深部，并且肿瘤细胞膜表面具有白蛋白的特异性受体，使得药物的摄取增加，摄取后定位在溶酶体，通过溶酶体内的特异性的蛋白水解酶将白蛋白水解，使其包裹的药物释放出来，从而充分发挥效果。
4.除了药物载体的发展，研究学者对于不同种类铜基药物本身的探索也历经几代。硫化铜纳米晶最早被发现用于肿瘤的光治疗，由于硫化铜本身的光化学性质，可以将近红外光能转变为热能，致使肿瘤部位局部温度升高(>45℃)，进而诱导肿瘤细胞凋亡或坏死。而根据肿瘤微环境独特的生理特征进行设计，依赖于肿瘤部位较高水平的谷胱甘肽，步文博教授团队设计出二价铜离子与半胱氨酸的自组装复合物，利用gsh可以将cu
2+
还原为cu
+
，从而触发cu
+
介导的类芬顿反应；而根据肿瘤部位微酸性的特点还可以设计出ph响应性的纳米粒，例如陈小元教授团队提出的过氧化铜纳米点，在酸性刺激下能释放出铜离子和过
氧化氢，从而发挥出更加高效的肿瘤杀伤作用。以上这些基础研究都为铜基药物的开发提供了思路。
5.利用白蛋白、转铁蛋白、铁蛋白等蛋白质作为载体，依据生物矿化原理，通过金属离子与蛋白质的相互作用，加入沉淀剂等试剂诱导氧化/还原/沉淀等反应，促进含金属的纳米晶体或团簇成核与生长，制备出蛋白质铜基药物纳米晶。蛋白质铜基药物纳米晶具有良好的生物相容性，在体内具有较好的组织渗透性，可在肿瘤组织有效蓄积。而在本领域，亟需解决的是铜基药物纳米晶在肿瘤部位的释药问题，以实现铜离子的靶向递送，提高铜基药物的抗肿瘤效果。


技术实现要素：

6.为解决上述技术问题，本发明提供了一种蛋白质包裹铜基纳米晶的药物及其制备方法与应用。
7.一种蛋白质包裹铜基纳米晶的药物，所述药物呈核壳结构，所述核为铜基纳米晶，所述药物的壳层为包裹在铜基纳米晶表面的蛋白质。
8.本发明采用蛋白质作为分子反应器，首先配制适宜浓度的蛋白水溶液；并进一步引入铜离子通过静电吸附作用与蛋白结合，再加入配体离子与铜离子发生配位沉淀反应，实现铜基无机纳米晶在蛋白质内腔中的可控生长，从而制得载铜蛋白纳米粒。根据加入的配位基团的响应性可以实现整个载铜蛋白纳米晶的响应性释放。本发明提供了一种向肿瘤部位递送铜离子的新策略，有效解决了铜离子全身给药所带来的毒副作用等问题，并且相较于其他载体包载的策略，本发明能够实现安全高效的递送。同时本发明提供的载铜蛋白纳米晶可作肿瘤微环境响应性释药的设计，能够实现对肿瘤更加精准高效的治疗。
9.在本发明的一个实施例中，所述蛋白质材料选自人血清白蛋白、牛血清白蛋白、人重组血清白蛋白、人血清转铁蛋白和人重组铁蛋白中的一种或多种。
10.在本发明的一个实施例中，所述蛋白质选自人血清白蛋白、人血清转铁蛋白和人重组铁蛋白中的一种或多种。
11.在本发明的一个实施例中，所述铜基选自氢氧化铜、碱式碳酸铜、过氧化铜和氧化亚铜中的一种或多种。
12.在本发明的一个实施例中，所述蛋白质包裹铜基纳米晶的药物的粒径为2nm～20nm；所述蛋白质包裹铜基纳米晶的药物的水合粒径为10nm～100nm。
13.在本发明的一个实施例中，所述蛋白质与铜基纳米晶的摩尔比为2:1～400:1。
14.在本发明的一个实施例中，所述药物的剂型为注射液或冻干粉。
15.一种蛋白质包裹铜基纳米晶的药物的制备方法，包括以下步骤：将蛋白质水溶液与铜离子水溶液混合，在沉淀剂诱导作用下在25～60℃下反应0.5～12h，获得所述蛋白质包裹铜基纳米晶的药物。
16.在本发明的一个实施例中，所述铜离子与沉淀剂的摩尔比为1:0.2
‑
1:5。
17.在本发明的一个实施例中，所述蛋白质溶液为水溶液，蛋白质浓度为1～100mg/ml。
18.在本发明的一个实施例中，所述铜离子水溶液选自氯化铜水溶液、硫酸铜水溶液、硝酸铜水溶液和乙酸铜水溶液中的一种或几种。
19.在本发明的一个实施例中，所述铜离子水溶液浓度为10～100mm。
20.在本发明的一个实施例中，所述沉淀剂为氢氧化钠、氢氧化钾、碳酸钠、碳酸氢钠或双氧水。
21.所述的蛋白质包裹铜基纳米晶的药物在制备抗肿瘤药物中的应用。
22.本发明的上述技术方案相比现有技术具有以下优点：
23.本发明首次采用一步制备方法，成功制备了蛋白质铜基药物纳米晶，制得的纳米晶分散均匀、粒径均一，平均粒径小于10nm；具有良好的肿瘤细胞杀伤作用，ic
50
为0.37mmol/ml。本发明首次通过生物矿化反应在白蛋白空腔内制备了可响应性释放铜离子的载铜蛋白纳米晶，氢氧化铜、碱式碳酸铜、过氧化铜和氧化亚铜等纳米晶在肿瘤组织或肿瘤细胞溶酶体内酸性环境中释放铜离子，从而发挥铜离子诱导的靶向抗肿瘤效应；以简单可控的合成制备工艺解决了传统铜治疗药物的安全靶向递送问题，解决了对肿瘤组织的深部穿透问题。其次，该纳米晶可通过双向协同策略增强化学动力学治疗效果，实现多模态协同治疗，为该蛋白纳米体系在肿瘤治疗领域中的应用奠定了一定的科学基础。
附图说明
24.为了使本发明的内容更容易被清楚的理解，下面根据本发明的具体实施例并结合附图，对本发明作进一步详细的说明，其中
25.图1为本发明中实施例一制备的纳米晶的电镜图片；
26.图2为本发明中实施例二制备的纳米晶的水合粒径分布图片；
27.图3为本发明中实施例三制备的纳米晶的水合粒径分布图片；
28.图4为本发明中实施例四制备的纳米晶的水合粒径分布图片；
29.图5为本发明中实施例五制备的纳米晶的水合粒径分布图片；
30.图6为本发明中实施例六制备的纳米晶的电镜图片；
31.图7为本发明中实施例七制备的纳米晶的电镜图片；
32.图8为本发明中实施例八制备的纳米晶的电镜图片；
33.图9为本发明中实施例九制备的纳米晶的电镜图片；
34.图10为本发明中实施例十制备的纳米晶的电镜图片；
35.图11为本发明中实施例十一制备的纳米晶的电镜图片；
36.图12为本发明中实施例十二制备的纳米晶的电镜图片；
37.图13为本发明中实施例十三制备的纳米晶的电镜图片；
38.图14为本发明中实施例一制备的纳米晶的x
‑
射线衍射图谱；
39.图15为本发明中实施例一制备的纳米晶的x
‑
射线电子能谱；
40.图16为本发明中实施例一制备的纳米晶的释药曲线；
41.图17为本发明中实施例一制备的纳米晶的活性氧产生结果；
42.图18为本发明中实施例一制备的纳米晶和游离氯化铜对4t1细胞株的细胞存活率柱状图；
43.图19为本发明中实施例一制备的纳米晶在荷瘤小鼠体内的组织分布结果；
44.图20为本发明中实施例一制备的纳米晶对荷瘤小鼠在21天内的抑瘤曲线图；
45.图21为本发明中实施例一制备的纳米晶对mda
‑
mb
‑
231细胞株的细胞存活率柱状
图。
具体实施方式
46.下面结合附图和具体实施例对本发明作进一步说明，以使本领域的技术人员可以更好地理解本发明并能予以实施，但所举实施例不作为对本发明的限定。
47.实施例一
48.载铜蛋白纳米晶制备，其具体步骤如下：
49.配制5mg/ml人血清白蛋白(hsa)溶液，向该蛋白溶液中加入30mm铜溶液，铜溶液与蛋白溶液的体积比为1：10，用2m naoh溶液调节溶液ph，之后引入配体碳酸钠(na2co3)即得反应液，铜离子与配体碳酸根离子之间的摩尔比为1：1.2；将反应液至于55℃水浴条件下反应4小时，取出反应液，加入到超滤管中，2500rpm离心除去游离碳酸根离子、钠离子、氯离子等，制得碱式碳酸铜白蛋白纳米晶。
50.对制备的碱式碳酸铜白蛋白纳米晶进行透射电镜拍摄，结果如图1所示，制得的纳米晶分散均匀、尺寸均一，平均粒径为9.4
±
0.4nm；纳米晶具有良好的肿瘤细胞杀伤作用，ic
50
为0.37mmol/ml。
51.实施例二
52.本实施例步骤与实施例一基本相同，其区别在于铜离子与配体离子摩尔用量之比为1：1，对制备的纳米晶进行水合粒径的监测，结果如图2所示，制得的纳米晶水合粒径为23.41，分散系数为0.252。
53.实施例三
54.本实施例步骤与实施例一基本相同，其区别在于铜离子与配体离子摩尔用量之比为1：2，对制备的纳米晶进行水合粒径的监测，结果如图3所示，制得的纳米晶水合粒径为60.80，分散系数为0.164。
55.实施例四
56.本实施例步骤与实施例一基本相同，其区别在于反应温度调整为25℃，对制备的纳米晶进行水合粒径的监测，结果如图4所示，制得的纳米晶水合粒径为39.72，分散系数为0.431。
57.实施例五
58.本实施例步骤与实施例一基本相同，其区别在于反应温度调整为37℃，对制备的纳米晶进行水合粒径的监测，结果如图5所示，制得的纳米晶水合粒径为43.74，分散系数为0.477。
59.实施例六
60.本实施例步骤与实施例一基本相同，其区别在于人血清白蛋白浓度调整为2mg/ml，对制备的纳米晶进行透射电镜的拍摄，结果如图6所示，制得的纳米晶平均粒径为10.2
±
0.3nm。
61.实施例七
62.本实施例步骤与实施例一基本相同，其区别在于人血清白蛋白浓度调整为10mg/ml，对制备的纳米晶进行透射电镜的拍摄，结果如图7所示，制得的纳米晶平均粒径为8.6
±
0.2nm。
63.实施例八
64.本实施例步骤与实施例一基本相同，其区别在于人血清白蛋白浓度调整为50mg/ml，对制备的纳米晶进行透射电镜的拍摄，结果如图8所示，制得的纳米晶水合粒径为80.6
±
15.5nm。
65.实施例九
66.本实施例步骤与实施例一基本相同，其区别在于反应时间调整为0.5h，对制备的纳米晶进行透射电镜的拍摄，结果如图9所示，制得的纳米晶平均粒径为5.4
±
0.2nm。
67.实施例十
68.本实施例步骤与实施例一基本相同，其区别在于反应时间调整为2h，对制备的纳米晶进行水合粒径的监测，结果如图10所示，制得的纳米晶平均粒径为9.7
±
0.3nm。
69.实施例十一
70.本实施例步骤与实施例一基本相同，其区别在于反应时间调整为12h，对制备的纳米晶进行透射电镜的拍摄，结果如图11所示，制得的纳米晶平均粒径为10.9
±
0.8nm。
71.实施例十二
72.本实施例步骤与实施例一基本相同，其区别在于使用牛血清白蛋白(bsa)作为蛋白溶液制备由bsa包裹的铜基蛋白纳米晶，对制备的纳米晶进行透射电镜的拍摄，结果如图12所示，制得的纳米晶平均粒径为9.8
±
0.5nm。
73.实施例十三
74.本实施例步骤与实施例一基本相同，其区别在于加入过氧化氢引入过氧根离子，对制备的纳米晶进行透射电镜的拍摄，结果如图13所示，制得的纳米晶平均粒径为9.9
±
0.4nm。
75.测试例一
76.对实施例一中制备的碱式碳酸铜白蛋白纳米晶结构功能进行测试：具体步骤为：对制备的纳米晶进行x射线衍射(xrd)、x射线电子能谱(xps)分析，并利用透析法研究其响应性释药能力。xrd图谱(图14)分析可说明碱式碳酸铜纳米晶与游离碱式碳酸铜晶型一致，证明了碱式碳酸铜纳米晶在蛋白质空腔中生长；xps结果(图15)显示，该载铜蛋白纳米晶中铜的价态为正二价，并且该碱式碳酸铜纳米晶能够响应肿瘤部位高表达的谷胱甘肽，从而完成向正一价的转变；同时其释放行为(图16)也呈现出明显的酸性响应性释放的特点。
77.测试例二
78.对实施例一中制备的碱式碳酸铜白蛋白纳米晶进行体外活性氧产生的测试，具体步骤为：用ph 4.5的醋酸
‑
醋酸钠缓冲液稀释3,3',5,5'
‑
四甲基联苯胺母液(溶解于二甲基亚砜)至2μg
·
ml
‑1作为检测液，准备不同浓度的双氧水(从0、0.1、0.2、0.5、0.8、1、2、5、10mmol
·
l
‑1)作为反应底物，然后设置纳米晶组(实施案例一)和辣根过氧化物酶组，纳米晶组与谷胱甘肽提前孵育4h，所用浓度为1μmol
·
l
‑1而辣根过氧化物酶为1unit。将纳米晶或辣根过氧化物酶和检测液共同加入到石英皿中，最后加入双氧水，至于搅拌器上使其充分反应，在不同的时间点(0、10、20、30、60、90、120、150、180、210、240、270、300s)分别取出，利用紫外分光光度计进行检测，根据其652nm处的吸收值进行数据分析。结果如图17，纳米晶与天然过氧化物酶具有相近的催化效率，均能催化大量活性氧的产生
79.测试例三
80.对实施例一中制备的碱式碳酸铜白蛋白纳米晶进行细胞毒性的测试，具体步骤为：取对数生长期的4t1细胞铺设96孔板，接种密度为1
×
105/ml，每孔100μl，放入细胞培养箱恒温培养12小时，待细胞贴壁后，倒掉培养液，用磷酸盐缓冲液洗涤1
‑
2次，加入用培养基稀释好的碱式碳酸铜白蛋白纳米晶溶液，每孔100μl，浓度梯度设置为0、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0、1.2mmol/l
‑1，每个浓度5个复孔，同时配制相同浓度的氯化铜溶液作为对照组；放入培养箱培养24小时后，更换培养液，加100μl浓度为0.5mg/ml的噻唑蓝溶液，4小时后弃去上清液，加入100μl的dmso，振荡10分钟，酶标仪492nm处测定吸光度值，结果参见图18，结果表明该纳米粒对4t1细胞株具有较低的ic
50
值，而游离氯化铜对细胞毒性作用较小，说明发明所述的蛋白纳米晶能更加有效地杀伤肿瘤细胞。
81.测试例四
82.将铂类药物蛋白纳米粒加入生理盐水中，配置成肿瘤治疗药物，进行小鼠体内组织分布实验：具体实验步骤如下所述：
83.1、肿瘤模型的建立：培养4t1肿瘤细胞，将其消化制备成1
×
107个/ml细胞混悬液，保证细胞分散均匀，在balb/c小鼠后腿处种瘤，每只小鼠皮下注射50μl，每天监测肿瘤体积大小。肿瘤体积公式：肿瘤体积＝(长
×
宽2)/2；
84.2、尾静脉注射上述实施例一中所得碱式碳酸铜白蛋白纳米晶(3mg/kg)至两组荷瘤裸鼠体内，在注射后24h后分别取出三组裸鼠的心、肝、脾、肺、肾和肿瘤，并用王水对组织进行高温硝解，待组织消解完全之后定容至3.0ml，用0.22μm微孔滤膜过滤之后用icp
‑
oes对各组织中的铜元素进行定量。通过上述测量方法得到裸鼠各组织中铜含量的分布结果(图19)，由图可知本发明所述纳米晶对4t1肿瘤模型具有较好的肿瘤靶向性。
85.测试例五
86.对实施例一所述纳米晶进行小鼠体内抑瘤效果的考察：
87.1、肿瘤模型的建立：培养4t1稳转荧光素酶肿瘤细胞(4t1
‑
luc)，将其消化制备成1
×
107个/ml细胞混悬液，保证细胞分散均匀，在balb/c小鼠腋下种瘤，每只小鼠皮下注射50μl，每天监测肿瘤体积大小。肿瘤体积公式：肿瘤体积＝(长
×
宽2)/2；
88.2、按照以下设计给药：碱式碳酸铜白蛋白纳米晶(实施例一)单剂量注射浓度3mg/kg组，生理盐水组，每组5只，每5天给药一次。由图20小鼠肿瘤的变化效果可知，注射生理盐水组，对4t1
‑
luc肿瘤的生长均无影响；而注射纳米晶组对4t1
‑
luc肿瘤的生长都具有明显的抑制作用，并且在观察期间小鼠状态良好未出现死亡现象，说明本发明的蛋白纳米粒能有效抑制耐药肿瘤的生长。
89.测试例六
90.在本实施例中考察实施例一制备的蛋白纳米晶对天然双氧水高表达的细胞株mda
‑
mb
‑
231的细胞毒性，取对数生长期的mda
‑
mb
‑
231细胞铺设96孔板，接种密度为1
×
105/ml，每孔100μl，放入细胞培养箱恒温培养12小时，确定细胞贴壁后，倒掉培养液，用磷酸盐缓冲液洗1
‑
2次，加入用培养基配好的碱式碳酸铜白蛋白纳米晶溶液，每孔100μl，浓度梯度设置为0、0.05、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0mmol/l
‑1，每个浓度5个复孔，放入培养箱培养24小时后，更换培养液，加100μl浓度为0.5mg/ml的噻唑蓝溶液，4小时后弃去培养液，加入100μl的dmso，振荡10分钟，酶标仪492nm处测定吸光度值，其余步骤同上述细胞毒性实验，结果参见图21，可见该纳米晶对mda
‑
mb
‑
231细胞株ic
50
为0.15mmol/ml说明发明的蛋白纳米晶对天然
双氧水高表达的细胞株mda
‑
mb
‑
231具有更强的细胞毒作用，预示着该发明可能广泛应用于其他肿瘤。
91.显然，上述实施例仅仅是为清楚地说明所作的举例，并非对实施方式的限定。对于所属领域的普通技术人员来说，在上述说明的基础上还可以做出其它不同形式变化或变动。这里无需也无法对所有的实施方式予以穷举。而由此所引申出的显而易见的变化或变动仍处于本发明创造的保护范围之中。