抑制剂RBL在制备治疗心血管疾病的药物中的应用

抑制剂rbl在制备治疗心血管疾病的药物中的应用
技术领域
1.本发明属于心血管疾病临床应用领域，具体地说，涉及一种抑制剂rbl 在制备治疗心血管疾病的药物中的应用。


背景技术：

2.心血管疾病(cardiovascular disease,cvd)是世界范围内危害人类健康的主要危险因素。根据全球疾病负担研究(global burden of diseasestudy,gbd)调查显示，截至2015年，全球心血管疾病患病人数接近4.3 亿人次；据2016年统计，我国统计缺血性心脏病患病人数达1100万。而其中，缺血性心脏病(ischemic heart disease,ihd)是造成cvd相关死亡的首要原因，随着人们生活水平的提高和现代生活节奏的加快，ihd的发病率仍在逐年提高。由此可见，ihd已成为全球范围的主要健康负担。
3.目前对于缺血性心脏病的治疗，主要集中于冠脉血流的及早贯通以及对损伤心肌的挽救。保护心肌缺血损伤的策略包括缺血预处理、后处理等，临床通过冠状动脉内溶栓、冠脉狭窄的球囊扩张及冠脉搭桥等内外科治疗手段，已被证明能有效恢复心肌血流供应，挽救缺血心肌。然而不容忽视的是，再灌注治疗是一把“双刃剑”，急性复流会导致心肌线粒体内钙超载、氧化应激增加，炎症浸润等，使线粒体通透性转换孔(mitochondrialpermeability transition pore,mptp)开放，导致缺血心肌进一步损伤，造成心肌不可逆的坏死，称为缺血/再灌注损伤(ischemia/reperfusioninjury,i/r injury)。i/r损伤可造成ihd患者预后不良甚至死亡。然而，目前对于缺血/再灌注损伤的治疗方法却是很少报道，因此若能找到一种可以改善心肌缺血/再灌注损伤的小分子药物可望在临床上减轻再灌注损伤导致的预后不良和患者死亡的情况。


技术实现要素：

4.有鉴于此，本发明针对现有技术存在的问题，提供了一种抑制剂rbl在制备治疗心血管疾病的药物中的应用，孟加拉红内酯rbl可以广泛抑制驱动蛋白活性，可在分子层次上或者临床上用于缓解和治疗心肌缺血/再灌注损伤，改善由于缺血/再灌注损伤导致的缺血性心脏病患者预后不良甚至死亡的现状。
5.为了解决上述技术问题，本发明所采用的技术方案是：
6.本发明的一个方面，提供了一种抑制剂rbl在制备治疗心血管疾病的药物中的应用。
7.进一步地，抑制剂rbl能够改善心肌缺血/再灌注损伤。
8.进一步地，抑制剂rbl能够显著降低心肌梗死血清标志物ldh水平。
9.进一步地，缺血时，抑制剂rbl能够显著减少心肌缺血/再灌注损伤后的心肌细胞凋亡。
10.进一步地，抑制剂rbl能够改善再灌注心律失常。
11.进一步地，抑制剂rbl能够显著减少心肌缺血/再灌注损伤后的氧化应激水平。
12.本发明的第二个方面，提供了一种治疗心血管疾病的药物，包括抑制剂 rbl。
13.驱动蛋白(kinesin)是一类马达蛋白，广泛存在于真核生物中，能够水解atp将化学能转化为机械能并沿微管定向运动，将各种货物(如囊泡、线粒体等)运输至细胞内特定的位置。自1985年首次发现驱动蛋白以来，人中已经发现14个亚家族的45个成员，形成驱动蛋白超家族。大量研究表明驱动蛋白功能异常与肿瘤、神经退行性病变、糖尿病等疾病的发生发展密切相关，然而其在心血管疾病中得研究较少。研究表明，缺血后恢复血流供应瞬间，代谢底物大量涌入，并且氧供恢复，导致大量活性氧(reactiveoxygen species,ros)产生，从而激活凋亡和坏死途径，导致心肌不可逆损伤。因此，目前普遍认为心肌再灌注损伤的直接因素是ros，而其使动环节是能量代谢障碍。研究表明驱动蛋白kif5b可以介导脂肪酸转运蛋白cd36 和葡萄糖转运蛋白glut4的膜转位，从而介导葡萄糖和脂肪酸进入胞内，因此其可能在再灌注期间参与糖脂代谢调控和诱发氧化应激。因此，抑制驱动蛋白活性可能能够抑制再灌注初期的代谢紊乱和氧化应激，进而改善缺血/ 再灌注损伤。
14.孟加拉红内酯(rose bengal lactone,rbl)是一种驱动蛋白抑制剂，结构式为：
[0015][0016]
分子式是c
20
h4cl4i4o5，分子量为973.67。被证实可以与微管竞争性结合，从而降低驱动蛋白对微管的亲和力，但不会干扰驱动蛋白对atp的亲和力。
[0017]
本发明通过对抑制剂rbl在动物模型上的实验与分析，发现抑制剂rbl 可以改善心肌缺血/再灌注损伤。这是rbl在心血管疾病方面的首次发现。通过对机制的进一步探究，发现rbl可以改善心肌缺血/再灌注损伤可能是通过调控氧化应激介导的糖脂代谢，减少再灌注后糖脂大量涌入而发挥作用。
附图说明
[0018]
此处所说明的附图用来提供对本发明的进一步理解，构成本发明的一部分，本发明的示意性实施例及其说明用于解释本发明，并不构成对本发明的不当限定。在附图中：
[0019]
图1是rt-pcr检测sham组、is组与i/r组心肌组织中驱动蛋白kif5b 的转录水平；*p《0.05，sham vs.i/r；n＝3，所有值均以平均值
±
sem表示；
[0020]
图2是western blot检测sham组、is组与i/r(30)与i/r(120)组(sham: 假手术组；is：缺血30min；i/r(30)：缺血30min，再灌注30min；i/r(120)：缺血30min，再灌注120min)心肌组织中驱动蛋白kif5b的表达水平；
[0021]
图3是ttc-evans blue双染色及aar/lv比率(ratio of area at risk volume to left ventricle volume)、inf/aar比率(ratio of infarct volume to area at risk volume)和ldh检测试剂盒检测血清ldh水平(u/l)；
[0022]
#
p《0.05，sham vs.i/r+v；**p《0.01,i/r+v vs.ir+rbl；
$
p《0.001, i/r+v vs.i/r+
rbl；n＝3,所有值均以平均值
±
sem表示；
[0023]
图4是心脏切片上tunel染色的代表性图像(
×
400)及tunel染色结果；
$
p《0.0001,sham vs.i/r；
$
p《0.0001,i/r+v vs.i/r+rbl；n＝3，所有值均以平均值
±
sem表示；
[0024]
图5是小鼠心律失常评分、室性期前收缩(premature ventricular complexes,pvc)，室性心动过速(ventricular tachycardia,vt)和心室纤颤(ventricular fibrillation,vf)的典型心电图；
[0025]
图6是两组心律失常评分统计、vt+vf的持续数量、两组vt+vf的持续时间、心率的统计结果。**p《0.01,sham vs.i/r；*p《0.05,i/r+v vs. i/r+rbl；n＝4,所有值均以平均值
±
sem表示；
[0026]
图7是心脏切片上dhe染色的代表性图像(
×
100)及dhe染色结果；
[0027]
图8是用mda检测试剂盒所检测的脂质氧化水平。
具体实施方式
[0028]
以下将配合实施例来详细说明本发明的实施方式，借此对本发明如何应用技术手段来解决技术问题并达成技术功效的实现过程能充分理解并据以实施。
[0029]
驱动蛋白(kinesin)是一类马达蛋白，广泛存在于真核生物中，能够水解atp将化学能转化为机械能并沿微管定向运动，将各种货物(如囊泡、线粒体等)运输至细胞内特定的位置。自1985年首次发现驱动蛋白以来，人中已经发现14个亚家族的45个成员，形成驱动蛋白超家族。大量研究表明驱动蛋白功能异常与肿瘤、神经退行性病变、糖尿病等疾病的发生发展密切相关，然而其在心血管疾病中得研究较少。研究表明，缺血后恢复血流供应瞬间，代谢底物大量涌入，并且氧供恢复，导致大量活性氧(reactiveoxygen species，ros)产生，从而激活凋亡和坏死途径，导致心肌不可逆损伤。因此，目前普遍认为心肌再灌注损伤的直接因素是ros，而其使动环节是能量代谢障碍。研究表明驱动蛋白kif5b可以介导脂肪酸转运蛋白cd36 和葡萄糖转运蛋白glut4的膜转位，从而介导葡萄糖和脂肪酸进入胞内，因此其可能在再灌注期间参与糖脂代谢调控和诱发氧化应激。因此，抑制驱动蛋白活性可能能够抑制再灌注初期的代谢紊乱和氧化应激，进而改善缺血/ 再灌注损伤。
[0030]
孟加拉红内酯(rose bengal lactone，rbl)是一种驱动蛋白抑制剂，结构式为：
[0031][0032]
分子式是c
20
h4cl4i4o5，分子量为973.67。被证实可以与微管竞争性结合，从而降低驱动蛋白对微管的亲和力，但不会干扰驱动蛋白对atp的亲和力。
[0033]
本发明通过对抑制剂rbl在动物模型上的实验与分析，发现抑制剂rbl 可以改善心肌缺血/再灌注损伤。这是rbl在心血管疾病方面的首次发现。通过对机制的进一步探究，发现rbl可以改善心肌缺血/再灌注损伤可能是通过调控氧化应激介导的糖脂代谢，减少再
灌注后糖脂大量涌入而发挥作用。
[0034]
【实验一】探求心肌缺血/再灌注各阶段驱动蛋白kif5b的转录和表达变化
[0035]
所使用动物为8-12周的c57bl/6j雄性小鼠。拟将小鼠随机分为三组：假手术组(sham)、缺血组(is)、缺血/再灌注组(i/r)。
[0036]
①
i/r模型的建立：
[0037]
术前通过腹膜内注射戊巴比妥钠溶液(60mg/kg)麻醉小鼠。麻醉后记录心电图，并连接小型动物呼吸机，潮气量为15ml/kg，呼吸频率为70次 /min。冠状动脉左前降支用7-0缝合线缝合在一根管子上，深度约1.5-2mm，宽度3-4mm。结扎点远端st段持续升高和心肌苍白表明心肌缺血。缺血30 min后除去连接线，再灌注2hr，此时st段降低，缺血性苍白心肌变红，表明再灌注成功。假手术组与i/r模型进行了相同的开胸和处理时间，但不进行缺血和再灌注。
[0038]
②
手术后，取左心室结扎线以下部分组织分别提蛋白和rna进行rt-pcr 和western blot检测，检测kif5b在手术各阶段的表达和转录水平。
[0039]
通过rt-pcr和western blot检测发现，如图1和图2所示，kif5b的转录和表达水平在再灌注时期较缺血时期有显著降低的趋势，此种变化表明 kif5b在小鼠心肌缺血/再灌注期间可能发挥重要作用。
[0040]
【实验二】从动物实验层面阐明rbl抑制驱动蛋白在i/r中的作用
[0041]
(1)动物实验：所用老鼠为8-12周的c57bl/6j雄性小鼠
[0042]
拟将小鼠随机分为三组：假手术组(sham)、缺血/再灌注组(i/r+v)、药物干预组(i/r+rbl)。
[0043]
①
i/r模型的建立：前处理如前所述，不同之处在于要进行rbl处理。在缺血15-20min后，腹腔注射rbl(1mg/kg，溶于dmso中)，10-15min 后除去连接线，再灌注2hr。
[0044]
②
梗死面积的确认：i/r模型后，取出心脏用生理盐水灌流至腔内无积血，然后用1％ttc溶液冲掉残留的生理盐水，将其放入含有9ml 1％ttc 溶液预先加热的器皿中，放入37℃水浴锅中孵育5min。然后将样品在-20℃冰箱中冰冻至形态固定后切片(冰上操作)，然后使用0.5％evans blue将切片染色。染色完毕后再将切片放入4％多聚甲醛中固定，4℃过夜后拍照观察。
[0045]
③
检测心肌酶谱指标：
[0046]
测定小鼠血清中的ldh水平：i/r模型后，通过颈动脉收集血样，并以 3000rpm离心10min。收集血清后用ldh检测试剂盒检测血清ldh含量。
[0047]
rbl是驱动蛋白的抑制剂，探究rbl能否改善心肌缺血再灌注损伤，探讨其临床应用的潜在价值。对c57bl/6j小鼠行左前降支冠状动脉结扎，缺血后15-20min腹腔注射rbl(1mg/kg)或等体积的dmso，缺血30min 和再灌注2hr后检测心肌梗死面积。ttc-evans blue染色结果表明rbl可以显著降低缺血/再灌注导致的心肌梗死。此外检测了血清中心肌梗死血清标志物ldh水平，如图3所示，结果表明rbl能够显著降低血清ldh水平。上述结果均表明抑制剂rbl能够改善心肌缺血/再灌注损伤。
[0048]
④
检测心肌细胞凋亡：取心肌组织样本进行冰冻切片，使用tunel试剂盒染色并通过共聚焦显微镜检测心肌细胞凋亡情况。
[0049]
凋亡是再灌注后细胞死亡的主要方式。取各组心肌组织进行冰冻切片，通过tunel
染色计算并比较各组心肌细胞凋亡情况。如图4所示，结果表明缺血时rbl处理可以显著减少i/r后的心肌细胞凋亡。
[0050]
心肌i/r损伤常见的临床表现之一即为再灌注后的心律失常的发生，特别是室性心律失常。故而手术过程中记录心电图并保存，实验后根据兰贝斯(lambeth)公约(ⅱ)对再灌注后30min内的室性心律失常进行评估。
[0051]
再灌注后心律失常是再灌注损伤的一个重要指标。通过记录再灌注后的小鼠心电图，并根据lambeth惯例评估每组小鼠在再灌注后30分钟内心律失常评分、pvc、vt和vf在每组中的发生率和持续时间。如图5和图6所示，结果表明rbl可以改善再灌注心律失常，且具有显著统计差异。
[0052]
【实验三】驱动蛋白抑制剂rbl改善心肌缺血/再灌注损伤的机制
[0053]
动物实验：拟将小鼠随机分别分为三组：假手术组(sham)、缺血/再灌注对照组(i/r+v)、药物干预组(i/r+rbl)。再灌注2hr后，取血样和组织蛋白检测氧化应激和代谢相关指标。
[0054]
①
脂质氧化检测：
[0055]
颈动脉取血，收集血清，用mda检测试剂盒，检测脂质氧化水平。
[0056]
②
ros荧光探针-dhe染色：
[0057]
取左心室结扎线以下部分组织，将取好的组织置于液氮中暂时保存，随后做冰冻切片。对切片进行二氢乙啶(dihydroethidium,dhe)染色，在共聚焦显微镜下拍照，计算并比较组织中ros水平。
[0058]
通过分别对各组小鼠进行处理后，取心肌组织进行冰冻切片，用dhe试剂盒染色计算并比较各组心肌细胞的着色程度。如图7和图8所示，通过统计分析发现，rbl处理可以显著减少i/r后的氧化应激水平。
[0059]
上述说明示出并描述了发明的若干优选实施例，但如前所述，应当理解发明并非局限于本文所披露的形式，不应看作是对其他实施例的排除，而可用于各种其他组合、修改和环境，并能够在本文所述发明构想范围内，通过上述教导或相关领域的技术或知识进行改动。而本领域人员所进行的改动和变化不脱离发明的精神和范围，则都应在发明所附权利要求的保护范围内。