醋炙五味子多糖提取物在制备治疗糖尿病的药物中的应用的制作方法

1.本发明属于药物领域，具体涉及醋炙五味子多糖及其制备方法和治疗糖尿病的医药用途。


背景技术：

2.五味子为木兰科植物五味子schisandra chinesis(turcz.)baill.的干燥成熟果实，主产于我国东北地区，故习称北五味子。南五味子为木兰科植物华中五味子schisandra sphenanthera rehd.et wils.的干燥成熟果实。五味子收敛固涩，益气生津，补肾宁心。用于久嗽虚喘，梦遗滑精，遗尿尿频，久泻不止，自汗，盗汗，津伤口渴，短气脉虚，内热消渴，心悸失眠。醋炙五味子是生品五味子醋炙炮制后的又一中药材，归肺、心、肾经，具有收敛固涩、益气生津、补肾宁心的功效，是治疗中医中消渴症的著名中药，醋炙后酸涩收敛之性增强，一直以来被用于治疗梦遗滑精、遗尿尿频、内热消渴等疾病的治疗，有着悠久的药用历史。
3.糖尿病(diabetes mellitus)是一组以高血糖为特征的代谢障碍疾病，高血糖则是由于胰岛素分泌缺陷或其生理作用受损，或两者兼有引起。糖尿病时长期存在的高血糖，导致各种组织，特别是眼、肾、心脏、血管、神经的慢性损害功能障碍，临床表现为多饮、多尿、多食、消瘦、疲乏无力及肥胖，严重高血糖时出现典型的“三多一少”症状，发生酮症或酮症酸中毒的“三多一少”明显。此外，糖尿病均存在明显得遗传异质性，存在家族发病倾向，临床上至少有60种以上得遗传综合征可伴有糖尿病。同时，随着当今社会的发展和人们生活方式的改变，大多数人养成了懒于运动并且高糖高脂的饮食习惯，进食过多，体力活动减少导致的肥胖是糖尿病最主要的环境因素，使具有糖尿病遗传易感性的个体容易发病。而且，糖尿病患者存在免疫系统异常，在某些病毒如柯萨奇病毒、风疹病毒、腮腺病毒等感染后导致自身免疫反应，破坏胰岛β细胞，单纯注射胰岛素降糖的治疗难以改变糖尿病的发生与发展，目前尚无根治的方法，只能通过多种治疗手段来对其进行控制，主要包括糖尿病患者的教育、自我监测血糖、饮食治疗、运动治疗和药物治疗，在治疗的同时效果也因人而异，所以针对糖尿病的药物研发为临床迫切所需。
4.中医药在治疗糖尿病上有独特的优势，其作用机制不是直接的降低血糖含量，而是通过影响受体后糖代谢的某些环节，进而增加肝糖原，抑制糖原异生而产生降血糖作用，是中药通过长期临床实践验证的。近年来研究发现，五味子多糖具有降血糖效果，且无毒副作用。根据现有技术的报道，cn107163157a公开了五味子酸多糖在制备用于抗氧化、改善记忆力、降血糖和/或抗肝损伤的药物或保健品中的应用。陶雪等(《北华大学学报(自然科学版)》，第20卷，第1期，第43
‑
46页，2019年1月)报道了五味子多糖对ii型糖尿病大鼠肝脏的保护作用。杜兴旭等(《吉林大学学报(医学版)》，第46卷，第1期，第50
‑
55页，2020年1月)报道了五味子多糖对ii型糖尿病大鼠血清中炎症因子的影响及其作用机制。
5.但是，目前尚无对醋炙五味子多糖提取物对ii型糖尿病的治疗作用和作用机制进行研究。


技术实现要素：

6.本发明通过相应的药理实验和活性成分研究创新发现了针对醋炙五味子多糖提取物对ii型糖尿病的治疗作用及其作用机制，继而完成本发明。
7.本发明第一方面涉及一种醋炙五味子多糖提取物。
8.所述醋炙五味子多糖提取物中多糖含量在60w/w％以上，优选60w/w％至80w/w％。
9.所述多糖提取物中糖醛酸含量为8w/w％至15w/w％，糖蛋白含量为20w/w％至40w/w％。
10.优选地，所述多糖提取物中多糖含量为63.6w/w％、糖醛酸含量为9.21w/w％、糖蛋白含量为25.6w/w％。
11.在一个具体的实施方式中，所述多糖由木糖、阿拉伯糖、葡萄糖、鼠李糖、甘露糖、半乳糖、葡萄糖醛酸和半乳糖醛酸组成。
12.优选地，所述多糖提取物中多糖含量为63.6w/w％，且包含2.67w/w％木糖、30.02w/w％阿拉伯糖、2.01w/w％葡萄糖、6.56w/w％鼠李糖、1.25w/w％甘露糖、22.51w/w％半乳糖、2.18w/w％葡萄糖醛酸和16.44w/w％半乳糖醛酸组成。
13.本发明第二方面涉及一种醋炙五味子多糖提取物的制备方法。
14.所述醋炙五味子按照以下步骤制备：
15.(1)五味子饮片加入米醋，拌匀，室温闷润；
16.(2)蒸至醋被吸进，表面显紫黑色，去除干燥；
17.优选的步骤(1)：采用五味子饮片与米醋混合比例为5：1，闷润1.5小时；优选的步骤(2)：采用蒸制时间为5小时。
18.所述醋炙五味子粗多糖按照以下步骤制备：
19.(1)醋五味子加95v/v％乙醇回流提取，4层纱布过滤，合并滤液；
20.(2)晾干后用蒸馏水回流提取，水提液过16层纱布过滤，合并滤液后离心抽滤；
21.(3)抽滤后浓缩，再加95v/v％乙醇醇沉，静置；
22.(4)抽滤，滤液回收保存，滤渣用无水乙醇和丙酮交替洗涤；
23.(5)洗涤后用去离子水溶解后冷冻干燥，制得醋炙五味子粗多糖。
24.优选的步骤(1)；乙醇回流提取2次，每次2小时；
25.优选的步骤(2)：采用30倍量水回流2次，每次3小时；
26.优选的步骤(3)：滤液浓缩至原体积的1/2，加4倍体积的乙醇醇沉；
27.优选的步骤(4)：交替洗涤2～3次，至溶液无色。
28.本发明第三方面涉及醋炙五味子多糖提取物在制备预防和/或治疗有需要的受试者的糖尿病的药物中的应用。
29.所述糖尿病为ii型糖尿病。
30.所述醋炙五味子多糖提取物增强所述受试者的糖耐量，加速外源性葡萄糖的消耗，降低所述受试者的血糖浓度
31.所述醋炙五味子多糖提取物提高所述受试者的血浆胰岛素水平，恢复所述受试者胰岛β细胞的正常细胞形态。
32.本发明还提供一种用于治疗糖尿病的药物组合物，所述药物组合物包含醋炙五味子多糖提取物和药物学上可接受的载体或赋形剂。
33.在一个实施例中，所述药物组合物是口服给药剂型。
34.在一个实施例中，所述药物组合物是固体制剂或液体制剂。
35.在一个实施例中，所述药物组合物是片剂、胶囊、口服液、悬浮液、颗粒剂、粉剂、合计、丸剂或滴丸。
36.在一个实施例中，所述药物组合物还包含临床上常用的其他抗糖尿病药物。
37.优选地，所述其他抗糖尿病药物为dpp
‑
4抑制剂或sglt
‑
2抑制剂。
38.所述dpp
‑
4抑制剂选自西格列汀、沙格列汀、维格列汀、利格列汀和阿格列汀的一种或多种。优选地，所述dpp
‑
4抑制剂为西格列汀。
39.所述sglt
‑
2抑制剂选自达格列净、恩格列净和卡格列净的一种或多种。优选地，所述sglt
‑
2抑制剂为恩格列净。
40.进一步优选地，醋炙五味子多糖提取物与其他抗糖尿病药物的重量比为5：1
‑
20：1，更优选地为10：1。
附图说明
41.图1醋炙五味子多糖提取流程图。
42.图2苯酚
‑
硫酸法测定醋炙五味子粗多糖的含量标准曲线。
43.图3硫酸
‑
咔唑法测定醋炙五味子粗多糖中糖醛酸含量标准曲线。
44.图4考马斯亮蓝法测定醋炙五味子粗多糖中的蛋白含量标准曲线。
45.图5气相质谱联用的方法测定醋炙五味子粗多糖的单糖组成图。
46.图6醋炙五味子多糖(svp)对糖尿病大鼠体重的影响。
###
p<0.001vs.正常对照组；*p<0.05和**p<0.01vs.模型组。
47.图7醋炙五味子多糖(svp)对糖尿病大鼠血糖值的影响。
###
p<0.001vs.正常对照组；*p<0.05和**p<0.01vs.模型组。
48.图8醋炙五味子多糖(svp)对糖尿病大鼠口服糖耐量的影响。图8a svp对糖尿病大鼠口服糖耐量的影响；图8b糖耐量实验auc结果。
###
p<0.001vs.正常对照组；*p<0.05和**p<0.01vs.模型组。
49.图9醋炙五味子多糖(svp)对糖尿病大鼠血浆胰岛素水平的影响。
#
p<0.001vs.正常对照组；*p<0.05和**p<0.01vs.模型组。
50.图10醋炙五味子多糖(svp)对糖尿病大鼠胰岛β细胞超微结构的影响。
51.有益效果
52.药理学实验表明，相比于生五味子多糖，本发明的醋炙五味子多糖具有显著更强的降血糖作用，且无毒副作用。可以用于制备药物组合物或配方，用于治疗糖尿病及高血糖所致的并发症，制备方法简单的优点，适合工业化生产。
53.本发明还发现，将采用本发明方法制备的醋炙五味子多糖与临床上常用的dpp
‑
4抑制剂或sglt
‑
2抑制剂联用能够产生协同的降血糖作用，尤其在特定重量比的条件下两者协同作用最佳，从而在应用中可以显著降低这两者的给药剂量，减少相关毒副作用。
具体实施方式
54.实施例1：醋炙五味子的制备方法
55.取五味子饮片5kg，加入米醋1l，拌匀，室温闷润1.5小时；在常压下蒸制5小时，蒸至醋被吸进，表面显紫黑色，去除干燥，即得。
56.实施例2：醋炙五味子粗多糖多糖提取物的制备方法
57.取实施例1的方法制备的醋炙五味子饮片1kg，加95v/v％乙醇500ml回流提取2次，每次2小时；取4层纱布过滤，合并滤液；晾干后用30倍量蒸馏水回流提取2次，每次3小时；水提液过16层纱布过滤，合并滤液后离心抽滤；抽滤后浓缩至原体积的1/2，加4倍体积的95v/v％乙醇醇沉，静置10小时；抽滤，滤液回收保存，滤渣用无水乙醇和丙酮交替洗涤2～3次，至溶液无色；洗涤后用去离子水溶解后冷冻干燥，制得醋炙五味子粗多糖。
58.实施例3：苯酚
‑
硫酸法测定醋炙五味子粗多糖的含量。
59.优化的条件为：以不同浓度的葡萄糖标准品溶液，加6w/v％苯酚试剂摇匀，迅速滴加浓硫酸摇匀，于490nm处测定吸光度值，以葡萄糖含量(μg)为横坐标，以吸光度值为纵坐标，绘制标准曲线，获得回归方程为：y＝0.0079x+0.1246(r2＝0.9979)(见图2)。
60.测定醋炙五味子粗多糖样品吸光度值，平行测定三次，从回归方程中求出供试液中葡萄糖的含量，按下式计算样品中多糖含量：
61.多糖含量(w/w％)＝c
×
d/w
×
100w/w％。
62.w为醋炙五味子粗多糖质量(mg)，c为醋炙五味子粗多糖中葡萄糖浓度(mg/ml)，d为醋炙五味子粗多糖的稀释倍数。
63.结果：根据标准曲线测得醋炙五味子粗多糖中多糖含量为63.6w/w％。
64.实施例4：硫酸
‑
咔唑法测定醋炙五味子粗多糖中糖醛酸含量
65.优化的条件为：以不同浓度的半乳糖醛酸标准品溶液加入四硼酸钠/硫酸溶液6ml，混匀后水浴加热5分钟，而后在冰水浴中加入1.5mg/ml间羟基联苯溶液100μl，于530nm处测定吸光度值，以半乳糖醛酸浓度值(μl/ml)为横坐标，以吸光度值为纵坐标，绘制标准曲线，获得回归方程为：y＝0.0029x+0.0105(r2＝0.9911)(见图3)。
66.结果：根据标准曲线测得醋炙五味子粗多糖中糖醛酸含量为9.21w/w％。
67.实施例5：马斯亮蓝法测定醋炙五味子粗多糖中的蛋白含量
68.优化的条件为：以不同浓度的蛋白质标准品溶液加入5ml考马斯亮蓝g
‑
250试剂，于595nm处测定吸光度值，以蛋白质浓度值(μg/ml)为横坐标，以吸光度为纵坐标，绘制标准曲线，获得回归方程为y＝0.0021x+0.0011(r2＝0.9997)(见图4)。
69.结果：根据标准曲线测得醋炙五味子粗多糖中蛋白含量为25.6w/w％。
70.实施例6：气相质谱联用的方法测定醋炙五味子粗多糖的单糖组成
71.(1)采用在110℃条件下tea水解多糖，水解时间4小时，甲醇带干；
72.(2)氨水及nabh4还原多糖，用盐酸甲醇带干；
73.(3)还原后加入六甲基二硅氮烷、三甲基氯硅烷放置70℃水浴锅中硅醚化反应，反应时间12小时；
74.(4)三氯甲烷和蒸馏水萃取后果有机滤膜进行气质分析
75.结果：测得醋炙五味子粗多糖由木糖、阿拉伯糖、葡萄糖、鼠李糖、甘露糖、半乳糖、葡萄糖醛酸和半乳糖醛酸组成(见图5)。
76.实施例7：生、醋炙五味子多糖含量及单糖组成的变化
77.根据实施例2的方法制备五味子多糖。
78.根据葡萄糖标准曲线y＝0.0079x+0.1246(r2＝0.9979)线性良好，以此计算生、醋炙五味子多糖含量，结果如表1所示。从表1可以看出，生五味子多糖含量最高，达到69.76w/w％，经醋炙后，多糖含量降低。
79.表1：生、醋炙五味子多糖含量及单糖组成的测定
[0080][0081]
实施例8：醋炙五味子对高脂饮食联合链脲佐菌素(stz)诱导ii型糖尿病(t2dm)大鼠作用效果研究
[0082]
1.醋炙五味子多糖(svp)对大鼠体重的影响
[0083]
实验过程中，大鼠体重变化如图6所示，大鼠建模成功后，与对照组相比，糖尿病模型组大鼠体重急剧下降(p<0.001)。大鼠给药4周后，与模型组相比，svp
‑
l(50mg/kg，以下实验用量相同)、svp
‑
h(100mg/kg，以下实验用量相同)组及met组大鼠体重均有升高，svp
‑
h组大鼠体重增加了32.3％(p<0.01)。生五味子多糖的用量为100mg/kg，以下实验用量相同。
[0084]
2.醋炙五味子多糖(svp)对糖尿病大鼠血糖值的影响
[0085]
高血糖是糖尿病主要特征之一，由图7所示，大鼠尾静脉注射stz后，与对照组相比，糖尿病大鼠血糖水平显著升高(p<0.001)。svp
‑
l、svp
‑
h治疗4周后，与模型组相比，大鼠血糖值分别降低32.3％及38.6％(p<0.05)。由此可见，svp对stz诱导的ii型糖尿病大鼠体重和血糖均具有很好的恢复作用。
[0086]
3.醋炙五味子多糖(svp)对糖尿病大鼠口服糖耐量的影响
[0087]
如图8a所示，灌胃葡萄糖0.5h后，糖尿病大鼠血糖值显著升高，在1.0h左右达到峰值，与模型组相比，各给药组大鼠血糖浓度升高幅度均有下降，其中svp
‑
h给药组大鼠血糖峰值降低，且显著提前。同时，与模型组相比，svp
‑
h治疗组大鼠血糖曲线下面积(auc＝(0h+0.5h)
×
0.25+(0.50h+1h)
×
0.25+(1h+2h)
×
0.25+(2h+4h)
×
0.25)显著降低(p<0.05，图8b)。因此推断，svp有效增强糖尿病大鼠糖耐量，加速其对外源性葡萄糖的消耗，降低血糖浓度。
[0088]
4.醋炙五味子多糖(svp)对糖尿病大鼠血浆胰岛素水平的影响
[0089]
胰岛素是由胰岛β细胞分泌的机体内唯一降血糖类激素，胰岛素抵抗是ii型糖尿病主要发病原因。如图9所示，与空白组相比，糖尿病大鼠血浆胰岛素水平显著降低(p<0.001)，svp
‑
l和盐酸二甲双胍治疗组大鼠血浆胰岛素水平均显著提高(p<0.05)，svp
‑
h治疗组大鼠血浆胰岛素水平提高极其显著(p<0.001)。
[0090]
5.醋炙五味子多糖(svp)对糖尿病大鼠胰岛β细胞超微结构
[0091]
各组大鼠胰岛β细胞的透射电镜见图10。正常对照组大鼠的胰岛β细胞核呈卵圆形或圆形，胞质内有大量大小不一的分泌颗粒，颗粒内有大小不同的致密核芯，核芯与界膜之间有较宽的清亮间隙。糖尿病模型大鼠胰岛β细胞核固缩，核膜凹陷，分泌颗数量减少，空晕增宽，核芯缩小，有的界膜破裂，相互融合。svp
‑
h组和met组相似，β细胞分泌颗粒数量较糖尿病模型组增加，且svp
‑
h组强于met组，分泌颗粒的核芯与界膜之间空晕较清晰。随svp剂量的增加分泌颗粒有增多的趋势。
[0092]
由以上实验结果可知，在上述各项实验中，生五味子多糖针对各检测指标的疗效
均不及实验中采样的两个剂量水平的醋炙五味子多糖。醋炙五味子多糖提取物对于大鼠无毒副作用，能够显著降低ii型糖尿病大鼠血糖值，显著增加ii型糖尿病大鼠口服糖耐量，显著提高ii型糖尿病大鼠血浆胰岛素水平，恢复胰岛β细胞正常形态，对ii型糖尿病有确切的治疗作用。
[0093]
并且，虽然醋炙五味子多糖提取物中多糖含量低于五味子多糖提取物，但是与相同剂量(100mg/kg)的五味子多糖提取物相比，醋炙五味子多糖提取物对ii型糖尿病具有更好地治疗效果，两者之间有显著性差异(p<0.05)。由此可知，醋炙的过程使五味子中多糖的结构和/或组成发生了变化，醋炙后的五味子多糖生物活性进一步提高，对糖尿病的治疗效果更佳，属于预料不到的技术效果。
[0094]
6.醋炙五味子多糖(svp)与其他抗糖尿病药物联用的协同增效作用
[0095]
高脂饮食联合链脲佐菌素(stz)诱导ii型糖尿病(t2dm)大鼠模型中，在第2部分实验考察醋炙五味子多糖(svp)对糖尿病大鼠血糖值的影响的同时还研究了svp与其他抗糖尿病药物联用的协同增效作用。
[0096]
协同指数采用金正均q值法进行判定，q值由以下的公式求得：q＝p
a+b
/(p
a
+p
b
‑
p
a
×
p
b
)。式中p
a
、p
b
和p
a+b
分别为a药组、b药组和两药联用组治疗率。q＜1说明两药合用后产生拮抗作用；q＞1，说明两药合用后产生协同作用，q＝1说明两药合用后产生相加作用。
[0097]
在本部分实验中，以血糖降低％作为计算q值的指标。血糖降低％采用表2中所示各种受试药物治疗4周后各组动物的平均血糖结果计算，具体公式如下：血糖降低(％)＝(模型组动物平均血糖
‑
受试药物组动物平均血糖)/模型组动物平均血糖
×
100。
[0098]
具体结果如下表2所示。
[0099]
表2：生、醋炙五味子多糖与其他抗糖尿病药物联用的协同增效作用
[0100]
[0101][0102]
从表2中的结果可以看出，生五味子多糖与西格列汀或恩格列净联用在降血糖方面均无协同增效作用。低剂量和高剂量的炙五味子多糖与西格列汀或恩格列净的组合均显示出协同增效作用，并且以高剂量的炙五味子多糖与西格列汀或恩格列净以特定用量比例联用的协同作用最佳。
[0103]
以上描述了本发明优选实施方式，然其并非用以限定本发明。本领域技术人员对在此公开的实施方案可进行并不偏离本发明范畴和精神的改进和变化。