1.本发明涉及生物工程技术领域，具体地说涉及一种用益生菌发酵中药“新七白”的发酵方法。
背景技术：
2.中药发酵获得的功效原料在化妆品领域具有广泛的应用。由于植物细胞具有结构致密的细胞壁，阻隔了位于细胞胞浆中的有效成分的释放；二是中药有效成分的分子量一般比较大，不易突破皮肤屏障被人体吸收。而中药材通过微生物发酵处理，可以大大提高有效成分的利用率，这是由于微生物在代谢过程中会产生纤维素酶、果胶酶等多种胞外酶，它们可以分解植物细胞的细胞壁，使中药材细胞破裂，让有效成分得以暴露出来。此外，微生物代谢产生的各种酶能降低有效成分的分子量，同时去除多种大分子杂质，使其更好地被人体吸收利用。
3.益生菌是指对机体健康有益的微生物，截至2019年，我国先后在《可用于保健食品的益生菌菌种名单》(卫法监发〔2001〕84号)、《可用于保健食品的真菌菌种名单》(卫法监发〔2001〕84号)、《可用于食品的菌种名单》(卫办监督发〔2010〕65号)以及《可用于婴幼儿食品的菌种名单》(卫生部公告〔2011〕25号)上发布了食品领域可用的益生菌种类，包括了35个种或亚种。
4.乳酸是世界上公认的三大有机酸之一，它的用途极为广泛。乳酸、乳酸盐及其衍生物广泛应用于食品、医药、饲料、化工等领域。人体中只含有l
‑
乳酸脱氢酶，只能代谢l
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乳酸。l
‑
乳酸在食品工业中的使用是绝对安全的，因此世界卫生组织提倡在食品及医药行业使用l
‑
乳酸取代目前广泛使用的dl
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乳酸。
5.在众多的产乳酸微生物中，米根霉(rhizopusoryzae/as3.819)由于具有产物光学纯度高、营养消耗简单、产物易于分离等特点而成为生产高光学纯度l
‑ꢀ
乳酸的理想菌株。通过米根霉发酵产生的大米发酵液具有促进皮肤渗透的功效，对生物体的安全性高，同时还具有保湿、美白、祛皱的功效。
6.公开号cn101463370b发明名称为利用米根霉发酵马铃薯淀粉制备l
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乳酸的方法,公开的方法包括(1)制备米根霉孢子；(2)将米根霉孢子制备成米根霉孢子乳悬液；(3)将米根霉孢子乳悬液固定到固定化载体上得到固定化米根霉种子； (4)将固定化米根霉种子接种到发酵培养基中进行固定化发酵。本发明方法培育出了高产的米根霉菌株并将其固定到棉布载体上得到固定化米根霉种子；该方法使用固定化载体用以固定化米根霉种子进行发酵。
7.公开号cn101153297a发明名称为米根霉菌球体单罐半连续高强度发酵高光学纯度l
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乳酸新工艺方法的发明专利申请，公开的方法包括如下步骤：(1)制备高密度高活性米根霉孢子乳悬液，(2)米根霉菌球体细胞无菌转接至500l机械搅拌罐的扩培，(3)500l罐单罐首批发酵，(4)500l罐单罐重复发酵，(5)500l 罐单罐连续进行15批次半连续高强度发酵。本发酵工艺方法中悬浮培养体系所形成菌球体的形状规则、大小较均一；能够成功实现
反复发酵，节约菌体消耗的n源及其它无机盐，降低发酵成本；该方法采用半连续发酵的方式，具有发酵周期短，发酵强度大的特点。
8.公开号cn101085982发明名称为利用乳酸杆菌和酵母菌生产微生物多糖制剂的制备方法的发明专利申请，公开的方法包括采用有益菌株的液体培养；离心收集菌体细胞壁；然后将菌群进行固体扩大培养，在培养物中添加收集富含多糖的细胞壁。本发明的优点是产品中的高浓度乳酸菌能显著提高水产动物的消化吸收功能，同时产生的肽聚糖增加了水产动物对病原体的免疫能力；产品中高浓度的酵母菌能提高鱼体生长需要的丰富的单细胞蛋白，同时，酵母细胞被充分破壁，释放出大量的β
‑
1，3葡聚糖，显著提高对革兰氏阳性和阴性菌的免疫能力，该方法采用粮食作物和常用饲料载体作为主要培养基原料，使用常用的发酵及生产设备，易于在水产养殖中推广。
9.流传甚久的七白膏是最受欢迎的美白方之一，经典七白膏最早出现在宋朝的《太平圣惠方》中，后来又出现在元代的《御药院方》中，其成分包括白术、白茯苓、白蔹、白及、白芷、白附子、细辛，外加鸡子白。实验表明外用七白膏可显著降低皮肤黑色素指数水平，抑制黑素细胞活性，减少黑素生成，缓解 uvb所致的皮肤色素沉着。现代研究表明白芷中含有一种物质欧前胡内酯，具有光敏性，在无光时使用的确可以润泽肌肤，但是一旦经过长时间光照的话就会引起皮肤发黑长斑，严重时还会引起抽搐、高血压以及孕妇流产等，因此目前化妆品目录禁用白芷。
10.传统用法将七白中药粉碎成细粉，以生鸡蛋清调和成药丸，药丸大小如鸡蛋黄或如人小拇指状或饼状，阴干。每晚洁面后，用药丸蘸温浆水在瓷器内磨汁，用药汁涂面。传统方法使用麻烦，而且中药中的有效成分提取不完全，吸收度低。而传统的溶剂提取方法离不开加热，容易造成活性成分的氧化，聚合。因此，发明一种温和提取中药有效成分，降解中药大分子的发酵方法具有重要的意义。
技术实现要素：
11.为了克服现有技术的不足，本发明的一个目的是提供用益生菌发酵中药“新七白”高产乳酸益生菌的发酵方法；克服传统使用中药七白药膏的利用效率问题。
12.在本发明技术方案中，所述方法的原料新七白包括：白茯苓、桑白皮、白芍、白蔹、白鲜皮、白芨和白参。
13.所述用益生菌发酵中药“新七白”高产乳酸益生菌的发酵方法包括：
14.步骤一、将所述原料打粉过50目筛，按照重量1:1混以糯米粉，形成混合原料；
15.步骤二、所述混合原料加水浸泡，混合原料与水的比例，以重量计，为3:7；
16.步骤三、以上步骤二混合原料加水浸泡形成的发酵物料投入发酵罐中发酵；
17.步骤四、步骤三得到的发酵液经固液分离，用200目活性炭脱色脱味，滤除活性炭后得到新七白乳酸菌发酵原液。
18.所述新七白乳酸菌发酵原液可用于化妆品亮肤，美白原料。
19.在本发明技术方案中，所述原料，以重量份计，为白茯苓180
‑
220份、桑白皮45
‑
55份、白芍45
‑
55份、白蔹45
‑
55份、白鲜皮45
‑
55份、白芨45
‑
55 份和白参45
‑
55份；优选所述原料，以重量份计，为白茯苓200份、桑白皮50 份、白芍50份、白蔹50份、白鲜皮50份、白芨50份和白参50份。
20.进一步，所述发酵使用的微生物为米根霉和乳酸杆菌
21.所述乳酸杆菌选自嗜酸乳杆菌、干酪乳杆菌、詹氏乳杆菌、拉曼乳杆菌中的一种。
22.进一步，其中，所述方法步骤三所述的发酵为：
23.将颗粒状米根霉以体积百分数3
‑
8％接入所述发酵物料中，在35℃、 200r/min条件下，以碳酸钠控制ph值，ph值控制在4.0
‑
5.0，发酵24
‑
36h，乳酸产量达到3
‑
5g/l。以氨水调节ph值至7.5
‑
8.0，温度维持35℃，以体积百分数2
‑
5％接入乳酸杆菌悬浊液，与米根霉共培养，再发酵培养24
‑
36h乳酸产量达到10
‑
13g/l。所述乳酸杆菌悬浊液，以10mmol/l的磷酸盐缓冲液(ph8.0) 配置乳酸杆菌悬浊液，以重量份计，所述乳酸杆菌与磷酸盐缓冲液比例为1
‑
15： 100。
24.进一步，步骤三中，在发酵罐中进行发酵，每50l发酵罐装25l发酵物料，发酵的ph值为4.0
‑
5.0，发酵温度为32
‑
34℃，发酵周期为60小时；自发酵开始至第20小时，将通气流速控制为0.3l/l
·
min，转速控制为50
‑
80rpm；自发酵第20小时至第40小时，将通气流速控制为0.6l/l
·
min，转速控制为450rpm；自发酵第40小时至第60小时，将通气流速控制为0.6l/l
·
min，转速控制为 50rpm；在发酵初期添加消泡剂，消泡剂的添加量为0.0lwt％，从发酵的第30h 开始逐步添加至0.1wt％；
25.其中，所述米根霉和乳酸杆菌的培养，包括如下步骤：
26.(1)将米根霉、乳酸杆菌分别接种至液态发酵培养基进行培养，得到二个菌种的种子液。
27.(2)将上述二个菌种的种子液接入培养基进行发酵培养。
28.(3)将步骤(2)所得的发酵物料烘干。
29.进一步，乳酸杆菌经种子培养后，再经扩大培养；其中，所述的扩大培养，先在30℃下发酵培养36h，再在32℃下继续发酵培养36h；
30.进一步，本发明所述的技术方案，米根霉经种子培养形成孢子悬浊液，再经发酵基础培养直至形成颗粒状菌体；将经过发酵基础培养后的米根霉接种于发酵培养基中，以碳酸钠控制ph值4.0
‑
5.0，35℃下发酵，发酵24
‑
36h后，用氨水调节ph值至7.5
‑
8.0，再接入步骤(1)得到的乳酸杆菌，维持35℃，与米根霉共培养。
31.步骤(1)中，所述的乳酸杆菌经种子培养和扩大培养后，菌体密度为30g湿菌体/l以上。
32.步骤(1)中，乳酸杆菌的种子培养，其种子培养基和种子培养方法为乳酸杆菌的常规种子培养基和常规种子培养方法，例如种子培养基优选配方如下：葡萄糖60g/l，尿素2.0g/l，kh2po
4 0.6g/l，氯化铵30g/l，mgso47h2o 0.5g/l，酵母膏0.5g/l，液体石蜡20g/l，溶剂为水；种子培养方法优选为：将乳酸杆菌种子接种于种子培养基中，在30℃、200r/min条件下，培养24h。
33.步骤(1)中，乳酸杆菌的扩大培养，其培养基为乳酸杆菌的常规发酵扩大培养基，例如扩大培养基优选配方如下：葡萄糖60g/l，尿素2.0g/l，kh2po
4 0.6g/l，氯化铵30g/l，mgso47h2o 0.5g/l，酵母膏0.5g/l，液体石蜡20g/l，溶剂为水。扩大培养方法采用变温培养的方式，优选为：以体积百分数10％将种子液接入发酵扩大培养基中，在33℃、200r/min条件下，发酵培养48h，而后温度提高至35℃，继续培养48h，此时菌体密度大于等于30g湿菌体/l。扩大培养后，过滤回收菌体，4℃低温保藏备用。使用时，以10mmol/l的磷酸盐缓冲液
(ph8.0) 配置乳酸杆菌悬浊液。
34.米根霉的种子培养，其培养基和培养方法为米根霉种子培养的常规种子培养基和种子培养方法，例如优选采用如下配方：酵母膏30g/l，麦芽浸出液30g/l，蛋白胨30g/l，甘油20g/l，琼脂20g/l，溶剂为水；种子培养方法优选为：35℃恒温培养5
‑
7天，取一支新鲜的斜面菌种，加入一定量的无菌水，制成孢子悬浊液。
35.米根霉的发酵基础培养，其培养基和培养方法为米根霉的常规液体培养的基础培养基和常规液体培养方法，例如优选采用如下配方：葡萄糖50g/l，尿素 2g/l，kh2po
4 0.6g/l，mgso4·
7h2o 0.5g/l，znso4·
7h2o 0.0176g/l，feso4·
7h2o 0.000498g/l，溶剂为水；发酵基础培养方法优选为：将孢子悬浊液，以体积百分数10％接入发酵基础培养基，在35℃、200r/min的条件下，恒温培养24h，米根霉菌体形态呈现颗粒状。形成颗粒状菌体，颗粒直径0.5
‑
2mm。
36.所述的发酵培养基为米根霉常规液体培养的培养基，碳源为纤维素水解葡萄糖。优选配方如下：纤维素水解葡萄糖60
‑
140g/l；(nh4)2so
4 0.5g/l，kh2po
4 0.6g/l，mgso47h2o 0.5g/l，znso4·
7h2o 0.0176g/l，feso4·
7h2o 0.00498g/l，溶剂为水。
37.进一步，步骤(2)中，乳酸杆菌的扩大培养，使用超声波生物刺激生长仪进行刺激培养，超声波生物刺激生长仪处理参数为超声频率30khz，功率10w，超声时间10s，间隔时间20s，共进行30分钟超声波刺激。
38.有益效果：本发明方法克服了传统方法使用麻烦，中药中的有效成分提取不完全，吸收度低的缺陷。本发明通过微生物发酵处理，可以提高有效成分的利用率，所述微生物在代谢过程中会产生纤维素酶、果胶酶等多种胞外酶，它们可以分解植物细胞的细胞壁，使中药材细胞破裂，让有效成分得以暴露出来。此外，微生物代谢产生的各种酶能降低有效成分的分子量，同时去除多种大分子杂质，使其更好地被人体吸收利用。
39.为使本发明具体实施方式的目的和技术方案更加清楚，下面将结合本发明的具体实施方式的实施实例，对本发明具体实施方式的技术方案进行清楚、完整地描述。显然，所描述的具体实施方式是本发明的一部分具体实施方式，而不是全部的具体实施方式。基于所描述的本发明的具体实施方式，本领域普通技术人员在无需创造性劳动的前提下所制备的所有其它具体实施方式，都属于本发明保护的范围。
具体实施方案
40.以下通过具体的实施例，进一步说明本发明的技术方案。在以下具体实施例中，所述原料除特别说明外，皆是市售商品，采购于相关生产企业或商业部门。超声波生物刺激生长仪处理参数为超声频率30khz，功率10w。
41.实施例1：
42.原料按照重量份白茯苓200份、桑白皮50份、白芍50份、白蔹50份、白鲜皮50份、白芨50份和白参50份的关系，称量共2000g原料，粉碎过50目筛，按照重量1:1混以糯米粉，形成混合原料；以重量比3:7将所述混合原料与纯净水混合浸泡48小时得到发酵物料；
43.在本实施例中，乳酸杆菌选用嗜酸乳杆菌。
44.将所述发酵物料全部投入到50l发酵罐中，以体积百分数3％将颗粒状米根霉接入所述发酵物料中，在35℃、200r/min条件下，以碳酸钠控制ph值，ph 值控制在4.5，发酵24h，
以氨水调节ph值至7.5，温度维持35℃，以体积百分数2.5％接入嗜酸乳杆菌悬浊液，与米根霉共培养，再发酵培养36h。所述嗜酸乳杆菌悬浊液，以10mmol/l的磷酸盐缓冲液(ph8.0)配置嗜酸乳杆菌悬浊液，以重量份计，所述嗜酸乳杆菌与磷酸盐缓冲液比例为2：100。得到的发酵液经固液分离，用200目活性炭脱色脱味，滤除活性炭后得到新七白乳酸菌发酵原液14.8l。
45.其中，所述米根霉和嗜酸乳杆菌的培养，如下：
46.步骤(1)嗜酸乳杆菌的种子培养，将嗜酸乳杆菌种子按照体积百分数5％接种于种子培养基中，在30℃、200r/min条件下，培养24h；种子培养基配方如下：葡萄糖60g/l，尿素2.0g/l，kh2po
4 0.6g/l，氯化铵30g/l，mgso47h2o 0.5g/l，酵母膏0.5g/l，液体石蜡20g/l，溶剂为水。
47.步骤(2)嗜酸乳杆菌的扩大培养，嗜酸乳杆菌经种子培养后，再经扩大培养；其中，所述的扩大培养，先在30℃下发酵培养36h，再在32℃下继续发酵培养36h；嗜酸乳杆菌的扩大培养，使用超声波生物刺激生长仪进行刺激培养，超声波生物刺激生长仪处理参数为超声频率30khz，功率10w，超声时间10s，间隔时间20s，共进行30分钟超声波刺激。步骤(2)中，嗜酸乳杆菌的扩大培养，其培养基为配方如下：葡萄糖60g/l，尿素2.0g/l，kh2po
4 0.6g/l，氯化铵30g/l， mgso47h2o 0.5g/l，酵母膏0.5g/l，液体石蜡20g/l，溶剂为水。扩大培养方法采用变温培养的方式，以体积百分数10％将种子液接入发酵扩大培养基中，在 33℃、200r/min条件下，发酵培养48h，而后温度提高至35℃，继续培养48h，此时菌体密度大于等于30g湿菌体/l。扩大培养后，过滤回收菌体，4℃低温保藏备用。使用时，以10mmol/l的磷酸盐缓冲液(ph8.0)配置嗜酸乳杆菌悬浊液。
48.步骤(3)米根霉的种子培养，其培养基采用如下配方：酵母膏30g/l，麦芽浸出液30g/l，蛋白胨30g/l，甘油20g/l，琼脂20g/l，溶剂为水；种子培养方法为：35℃恒温培养5
‑
7天，取一支新鲜的斜面菌种，加入一定量的无菌水，制成孢子悬浊液。
49.步骤(4)米根霉的发酵扩大培养，采用如下配方：葡萄糖50g/l，尿素2g/l， kh2po
4 0.6g/l，mgso4·
7h2o 0.5g/l，znso4·
7h2o 0.0176g/l，feso4·
7h2o 0.000498g/l，溶剂为水；发酵扩大培养方法为：将孢子悬浊液，以体积百分数 10％接入发酵扩大培养基，在35℃、200r/min的条件下，恒温培养24h，米根霉菌体形态呈现颗粒状。形成颗粒状菌体，颗粒直径0.5
‑
2mm。
50.实施例2
51.原料按照重量份白茯苓180份、桑白皮55份、白芍50份、白蔹45份、白鲜皮50份、白芨55份和白参45份的关系，称量共2000g原料，粉碎过50目筛，按照重量1:1混以糯米粉，形成混合原料；以重量比3:7将所述混合原料与纯净水混合浸泡60小时得到发酵物料；
52.在本实施例中，乳酸杆菌选用干酪乳杆菌。
53.将所述发酵物料全部投入到50l发酵罐中，以体积百分数5％将颗粒状米根霉接入所述发酵物料中，在35℃、200r/min条件下，以碳酸钠控制ph值，ph 值控制在4.5，发酵24h，以氨水调节ph值至7.5，温度维持35℃，以体积百分数3％接入干酪乳杆菌悬浊液，与米根霉共培养，再发酵培养36h。所述干酪乳杆菌悬浊液，以10mmol/l的磷酸盐缓冲液(ph8.0)配置干酪乳杆菌悬浊液，以重量份计，所述干酪乳杆菌与磷酸盐缓冲液比例为5：100。得到的发酵液经固液分离，用200目活性炭脱色脱味，滤除活性炭后得到新七白乳酸菌发酵原液
13.6l。
54.其中，所述米根霉和干酪乳杆菌的培养，如下：
55.步骤(1)干酪乳杆菌的种子培养，将干酪乳杆菌种子按照体积百分数6％接种于种子培养基中，在30℃、200r/min条件下，培养24h；种子培养基配方如下：葡萄糖60g/l，尿素2.0g/l，kh2po
4 0.6g/l，氯化铵30g/l，mgso47h2o 0.5g/l，酵母膏0.5g/l，液体石蜡20g/l，溶剂为水。
56.步骤(2)干酪乳杆菌的扩大培养，干酪乳杆菌经种子培养后，再经扩大培养；其中，所述的扩大培养，先在30℃下发酵培养36h，再在32℃下继续发酵培养36h；干酪乳杆菌的扩大培养，使用超声波生物刺激生长仪进行刺激培养，超声波生物刺激生长仪处理参数为超声频率30khz，功率10w，超声时间10s，间隔时间20s，共进行30分钟超声波刺激。步骤(2)中，干酪乳杆菌的扩大培养，扩大培养基配方如下：葡萄糖52g/l，尿素1.2g/l，kh2po
4 0.6g/l，氯化铵22g/l， mgso47h2o 0.5g/l，酵母膏0.5g/l，液体石蜡10g/l，溶剂为水。扩大培养方法采用变温培养的方式，以体积百分数10％将种子液接入发酵扩大培养基中，在 33℃、200r/min条件下，发酵培养48h，而后温度提高至35℃，继续培养48h，此时菌体密度大于等于30g湿菌体/l。扩大培养后，过滤回收菌体，4℃低温保藏备用。使用时，以10mmol/l的磷酸盐缓冲液(ph8.0)配置干酪乳杆菌悬浊液。
57.步骤(3)和步骤(4)同实施例1.
58.实施例3
59.原料按照重量份白茯苓220份、桑白皮50份、白芍55份、白蔹45份、白鲜皮55份、白芨55份和白参50份的关系，称量共2000g原料，粉碎过50目筛，按照重量1:1混以糯米粉，形成混合原料；以重量比3:7将所述混合原料与纯净水混合浸泡60小时得到发酵物料；
60.在本实施例中，乳酸杆菌选用拉曼乳杆菌。
61.将所述发酵物料全部投入到50l发酵罐中，以体积百分数3％将颗粒状米根霉接入所述发酵物料中，在35℃、200r/min条件下，以碳酸钠控制ph值，ph 值控制在4.5，发酵24h，以氨水调节ph值至7.5，温度维持35℃，以体积百分数5％接入拉曼乳杆菌悬浊液，与米根霉共培养，再发酵培养36h。所述拉曼乳杆菌悬浊液，以10mmol/l的磷酸盐缓冲液(ph8.0)配置拉曼乳杆菌悬浊液，以重量份计，所述拉曼乳杆菌与磷酸盐缓冲液比例为5：100。得到的发酵液经固液分离，用200目活性炭脱色脱味，滤除活性炭后得到新七白乳酸菌发酵原液14.2l。
62.其中，所述米根霉和拉曼乳杆菌的培养如下：
63.步骤(1)拉曼乳杆菌的种子培养，将拉曼乳杆菌种子以体积百分数8％接种于种子培养基中，在30℃、200r/min条件下，培养24h；种子培养基配方如下：葡萄糖56g/l，尿素1.2g/l，kh2po
4 0.6g/l，氯化铵30g/l，mgso47h2o 0.5g/l，酵母膏0.5g/l，液体石蜡20g/l，溶剂为水。
64.步骤(2)拉曼乳杆菌的扩大培养，拉曼乳杆菌经种子培养后，再经扩大培养；其中，所述的扩大培养，先在30℃下发酵培养36h，再在32℃下继续发酵培养36h；拉曼乳杆菌的扩大培养，使用超声波生物刺激生长仪进行刺激培养，超声波生物刺激生长仪处理参数为超声频率30khz，功率10w，超声时间10s，间隔时间20s，共进行30分钟超声波刺激。步骤(2)中，拉曼乳杆菌的扩大培养，扩大培养基配方如下：葡萄糖56g/l，尿素1.2g/l，kh2po
4 0.6g/l，
氯化铵30g/l， mgso47h2o 0.5g/l，酵母膏0.5g/l，液体石蜡20g/l，溶剂为水。扩大培养方法采用变温培养的方式，以体积百分数5％将种子液接入发酵扩大培养基中，在 33℃、200r/min条件下，发酵培养48h，而后温度提高至35℃，继续培养48h，此时菌体密度大于等于30g湿菌体/l。扩大培养后，过滤回收菌体，4℃低温保藏备用。使用时，以10mmol/l的磷酸盐缓冲液(ph8.0)配置拉曼乳杆菌悬浊液。
65.步骤(3)和步骤(4)同实施例1.
66.以上结合具体实施例，对本发明技术方案的具体实施方式进行了进一步描述，此具体实施方案是为了对本技术方案的详细描述，而不是为了限制本技术方案。以上所述的具体实施方案，仅仅是对本发明的优选实施方式进行描述，并非对本发明的技术构思和保护范围进行限定，在不脱离本发明设计构思的前提下，本领域普通技术人员对本技术方案作出的各种变型和改进，均应落入本发明的保护范围。