莫匹罗星在制备抗牛流行热病毒药物中的应用

1.本发明属于医药技术领域，具体涉及莫匹罗星在制备抗牛流行热病毒药物中的应用。


背景技术：

2.公开该背景技术部分的信息仅仅旨在增加对本发明的总体背景的理解，而不必然被视为承认或以任何形式暗示该信息构成已经成为本领域一般技术人员所公知的现有技术。
3.牛流行热(bovine ephemeral fever，bef)又名牛暂时热、牛三日热，是由牛流热病毒(bovine ephemeral fever virus，befv)引起的一种牛急性热性传染病。该病发病突然、传播迅速,以高热、呼吸促迫、行走障碍或瘫痪等为主要特征。befv广泛流行于非洲、亚洲和大洋洲等许多国家和地区。近年来在我国频繁发生，我国26省份牛群befv感染情况显示部分地区的阳性率高达81％。我国河南地区自1983年至今有8次较大的bef流行，其中最近的报道为2011年，发病率为30％，死亡率为5％，同期在我国山东地区也报道了该病的流行，2014年农业部印发的《牛羊常见疫病防控技术指导意见》，牛流行热被列为牛的重点防控疫病。但是由于befv发病率高，死亡率低，未能引起牧场的足够重视。目前国内befv疫苗免疫覆盖率并不高，实际生产中抵御牛流行热发生的能力不足，为养牛业带来极大不确定性，在预警和风险评估中存在一定得滞后性。这主要体现在缺乏有效的预警监测技术、缺少高效特异的抗牛流行热病毒药物两个方面。本发明提供能有效抑制befv的有效化合物，为规模化奶牛场befv防控提供配套技术。
4.莫匹罗星是一种抗生素类抗感染药。为局部外用抗生素，是由荧光假单胞菌培养液产生的一种物质，即假单胞菌a。其抗菌作用主要是通过可逆性地与异亮氨酸转移rna合成酶结合，阻止异亮氨酸渗入，中止细胞内含异亮氨酸的蛋白质合成而起到杀菌或抑菌的作用。莫匹罗星在很低浓度时显示抑菌作用，在高浓度时起杀菌作用。对与皮肤感染有关的各种革兰阳性球菌尤其是葡萄球菌、链球菌高度敏感，对耐药金黄色葡萄球菌亦有效；对某些革兰阴性菌如大肠杆菌、流感嗜血杆菌和淋球菌具有一定的抗菌作用；对大多数厌氧菌以及皮肤正常菌丛不敏感。体外耐药性变异株的出现率很低。涂于皮肤后，能渗透达角质层下，与人血清蛋白的结合率为95％。吸收后可迅速代谢成无活性的首一酸(摩尼酸，monic acid a)，并经肾脏排泄。口服或注射给药时，吸收后迅速被代谢成无活性代谢物，失去效应。莫匹罗星软膏外用治疗细菌性皮肤病疗效高，不良反应小，临床成功率96％，细菌清除率为94％，均超过内用双氯西林成或红霉素的疗效。目前，莫匹罗星一般都是作为抗生素类抗感染药进行使用，为了进一步扩大莫匹罗星在医药领域中的应用，探究莫匹罗星的其他医药用途将具有重要意义。


技术实现要素：

5.为了解决现有技术的不足，本发明提供莫匹罗星在制备抗befv药物中的应用，本
发明首次证实莫匹罗星能够有效抑制befv的增殖，且对细胞的毒性较小，因此具有开发成抗befv药物的前景。
6.本发明所述化合物莫匹罗星，结构式如式(ⅰ)所示，是一种抗生素类抗感染药。本发明提供了莫匹罗星在制备抗牛流行热病毒药物中的应用，该应用是首次公开，以已知的临床用药用途不同。
[0007][0008]
本发明建立了befv在细胞水平上药物筛选体系，发现化合物莫匹罗星能够有效抑制befv的增殖，且对细胞的毒性相对较小，经实验证明，莫匹罗星对bhk
‑
21细胞的半数细胞毒性浓度(cc50)大于等于100μm，而对befv病毒的半数有效浓度(ec50)为12.5μm；莫匹罗星对befv的治疗指数为8，表明其具有开发成抗befv药物的前景。
[0009]
具体地，本发明具有如下所示的技术方案：
[0010]
本发明第一方面提供一种莫匹罗星或包含莫匹罗星的组合物或其制剂在制备抗befv药物中的应用。
[0011]
本发明第二方面提供一种莫匹罗星或包含莫匹罗星的组合物或其制剂在制备抑制befv病毒增殖的药物中的应用。
[0012]
本发明第三方面提供一种莫匹罗星或包含莫匹罗星的组合物或其制剂在制备灭活befv病毒的药物中的应用。
[0013]
本发明第四方面提供一种莫匹罗星或包含莫匹罗星的组合物或其制剂在制备阻止befv对细胞吸附的药物中的应用。
[0014]
本发明第五方面提供一种抗befv的药物，所述抗肿瘤药物还包含有在药学上可接受的辅料。
[0015]
本发明第六方面提供一种抗befv的药物组合物，所述药物组合物由莫匹罗星与至少一种其它药物活性成分组成。
[0016]
本发明的一个或多个实施方式至少具有以下有益效果：
[0017]
本发明首次发现化合物莫匹罗星能够有效抑制befv的增殖，且对细胞的毒性相对较小，经实验证明，莫匹罗星对bhk
‑
21细胞的半数细胞毒性浓度(cc50)大于等于100μm，而对befv病毒的半数有效浓度(ec50)为12.5μm；莫匹罗星对befv的治疗指数为8，表明其具有开发成抗befv药物的前景，为莫匹罗星开辟了新的药物用途，也为开发高效特异的抗befv药物奠定实验基础并提供新的视野。
附图说明
[0018]
构成本发明的一部分的说明书附图用来提供对本发明的进一步理解，本发明的示意性实施例及其说明用于解释本发明，并不构成对本发明的不当限定。
[0019]
图1为本发明莫匹罗星抗befv损伤细胞的作用图；
[0020]
其中：其中图1a为病毒对照组；图1b为bhk
‑
21正常细胞组；图1c为感染细胞药物试验组(使用25μm莫匹罗星)；
[0021]
图2为实施例2中莫匹罗星对bhk
‑
21细胞的半数细胞毒性浓度(cc50)图；
[0022]
图3为实施例3中莫匹罗星对befv的半数有效浓度(ec50)图；
[0023]
图4为实施例4中莫匹罗星不同时间点给药对befv抑制的效果图；
[0024]
图5为实施例5中莫匹罗星对befv直接杀伤作用效果图。
[0025]
图6实施例5莫匹罗星对befv吸附的阻断作用效果图。
[0026]
图7实施例5莫匹罗星对befv复制的阻断作用效果图。
具体实施方式
[0027]
应该指出，以下详细说明都是示例性的，旨在对本发明提供进一步的说明。除非另有指明，本文使用的所有技术和科学术语具有与本发明所属技术领域的普通技术人员通常理解的相同含义。
[0028]
需要注意的是，这里所使用的术语仅是为了描述具体实施方式，而非意图限制根据本发明的示例性实施方式。如在这里所使用的，除非上下文另外明确指出，否则单数形式也意图包括复数形式，此外，还应当理解的是，当在本说明书中使用术语“包含”和/或“包括”时，其指明存在特征、步骤、操作、器件、组件和/或它们的组合。
[0029]
正如背景技术所介绍的，莫匹罗星一般都是作为抗生素类抗感染药进行使用，为了进一步扩大莫匹罗星在医药领域中的应用，探究莫匹罗星的其他医药用途将具有重要意义。
[0030]
对此，本发明提供莫匹罗星在制备抗牛流行热病毒药物中的应用。
[0031]
具体地，
[0032]
第一方面提供一种莫匹罗星或包含莫匹罗星的组合物或其制剂在制备抗befv药物中的应用。
[0033]
其中，“抗befv药物”表示一种物质，其对befv具有明显的抑制杀灭作用，对病毒的直接杀灭、吸附阻断等方面都有很好的效果。
[0034]
本发明第二方面提供一种莫匹罗星或包含莫匹罗星的组合物或其制剂在制备抑制befv病毒增殖的药物中的应用。
[0035]
本发明第三方面提供一种莫匹罗星或包含莫匹罗星的组合物或其制剂在制备灭活befv病毒的药物中的应用。
[0036]
本发明第四方面提供一种莫匹罗星或包含莫匹罗星的组合物或其制剂在制备阻止befv对细胞吸附的药物中的应用。
[0037]
所上述药物中，莫匹罗星取不低于半数有效浓度(ec50)的药物浓度，莫匹罗星对befv病毒的半数有效浓度(ec50)为12.5μm。莫匹罗星对befv的治疗指数为8。当然，当莫匹罗星与其他具有抑制和/或杀灭或者协助抑制和/或杀灭befv等与本发明内容中所提及的相同应用的药物或活性成分联合使用时，其药物浓度理论上可以低于上述半数有效浓度，但也不排除特殊的例外情况。
[0038]
作为其它药物活性成分的替代或补充，莫匹罗星还可以与其它非药物活性成分组
合使用。
[0039]
本发明第五方面提供一种抗befv的药物，所述抗肿瘤药物还包含有在药学上可接受的辅料。
[0040]
所述在药学上可接受的辅料包括溶剂、填充剂、润滑剂、崩解剂、缓冲剂、助溶剂、抗氧剂、抑菌剂、乳化剂、粘合剂或助悬剂中的至少一种。
[0041]
所述药物的给药剂型包括：液体剂型、固体剂型、外用制剂和喷剂；
[0042]
优选的，包括以下剂型：真溶液类、胶体类、微粒剂型、乳剂剂型、混旋剂型、片剂、胶囊、滴丸、气雾剂、丸剂、粉剂、溶液剂、混悬剂、乳剂、颗粒剂、栓剂、冻干粉针剂、包合物、填埋剂、贴剂、擦剂。
[0043]
施用莫匹罗星与其它至少一种药物活性成分的组合时，可以增强抗befv的作用。
[0044]
为此，本发明第六方面提供一种抗befv的药物组合物，所述药物组合物由莫匹罗星与至少一种其它药物活性成分组成。
[0045]
所述其它药物活性成分包括具有抑制和/或杀灭befv或者协助抑制和/或杀灭befv的物质。
[0046]
为了使得本领域技术人员能够更加清楚地了解本发明的技术方案，以下将结合具体的实施例与对比例详细说明本发明的技术方案。需要说明的是，本技术实施例中使用的befv由山东省农业科学院奶牛研究中心分离获得，具体分离及鉴定方法如下：
[0047]
通过rt
‑
pcr对疑似牛流行热奶牛抗凝血样品进行检测，选取阳性样品颅内接种3日龄乳鼠，7日后乳鼠死亡，鼠脑组织通过pcr鉴定出bffv目的条带，乳鼠颅内重复接种3次，乳鼠发病死亡时间明显提前。选取阳性脑组织接种bhk
‑
21细胞，盲传3代后出现明显细胞病变，特异性引物扩增获得目的条带，测序结果与牛流行热病毒序列一致，表明成功分离到一株牛流行热病毒。
[0048]
实施例1病毒tcid
50
的测定
[0049]
将bhk
‑
21细胞(山东省农业科学院奶牛研究中心保存)消化后以每孔1
×
105个/ml的细胞密度接种到96孔细胞培养板中，放入37℃，5％co2的细胞培养箱中培养成单层细胞后，弃去孔内细胞生长液，将befv连续10倍稀释的病毒稀释液(稀释度分别为10
‑1～10
‑
10
)接种于长满单层细胞的96孔板，每孔100μl，放入37℃、5％co2的培养箱中继续培养，并逐日观察细胞的cpe情况，以及详细记录细胞病变孔数。同时设置正常细胞对照组和空白对照组，每组设3个重复，待不再继续发生细胞病变时判定结果。细胞病变孔是以上的细胞发生病变对应的细胞孔，并按karber法计算病毒tcid
50
。
[0050]
表1 tcid
50 of befv
[0051][0052]
注：tcid
50
，tissue culture infective dose，半数组织培养感染剂量，又称50％组织细胞感染量；即指能在培养板孔或试管内引起半数细胞病变或死亡(cytopathic effect,cpe)所需的病毒量。
[0053]
结果：在显微镜下的形态学观察发现48h时不同浓度的病毒稀释液均造成了细胞病变，细胞的折光性发生改变，单层结构被破坏，细胞出现坏死，逐渐呈拉网状并形成空泡，有的细胞裂解脱落成碎片状，72h后各孔的细胞病变不再继续，统计出不同浓度的cpe孔数,并计算出不同浓度的cpe比率，并按karber法计算befv的tcid
50
值：
[0054]
lgtcid
50
＝l
‑
d(s
‑
0.5)
[0055]
(l:最高稀释度的对数；d:稀释度对数之间的差；s阳性孔比率总和)
[0056]
lgtcid
50
＝l
‑
d(s
‑
0.5)＝
‑1‑1×
(2.67
‑
0.5)＝
‑
3.17
[0057]
tcid
50
＝10
‑
3.17
/0.1ml
[0058]
即将该病毒稀释10
3.17
接种100μl可使50％的细胞发生病变。
[0059]
实施例2莫匹罗星对bhk
‑
21细胞的毒性实验：
[0060]
bhk
‑
21细胞是befv的易感细胞。因此，首先检测莫匹罗星对bhk
‑
21细胞的细胞毒性，具体实验步骤如下：
[0061]
(1)在96孔板内接种100μl细胞(bhk
‑
21 1
×
104个/孔)。
[0062]
(2)培养至bhk
‑
21单层后，进行下一步加药分析。弃去培养基，每孔加100μl含不同药物浓度的2％fbs dmem，每个浓度做3个平行。同时对照孔：加100μl 2％fbs dmem培养基。调零孔：不铺细胞。
[0063]
(3)在37℃，5％co2条件下培养72h后，按cck
‑
8试剂盒说明书操作，用酶标仪测定450nm处的od值。
[0064]
(4)37℃，5％co2条件下继续培养1h后，在450nm测定吸光值。将正常生长细胞的a450nm设为100％细胞对照。
[0065]
(5)分析数据，利用graphpad prism5计算莫匹罗星的半数细胞毒性浓度(cc
50
)值。
其结果如图2所示。
[0066]
结果：莫匹罗星出现剂量依赖关系，即随着药物浓度的增加，则表现出细胞病变较为明显。经统计学分析，确定莫匹罗星半数中毒浓度为50μm。
[0067]
实施例3莫匹罗星对befv的抑制实验：
[0068]
(1)在96孔板的每个孔中接种1
×
104个bhk
‑
21细胞，37℃，5％co2培养箱中过夜培养；
[0069]
(2)弃去培养基，每孔加入100μl 100tcid
50
的befv稀释液(用2％fbs dmem细胞长满后加入病毒稀释液，按照50μm初始浓度，两倍浓度梯度稀释加药，5％co2培养箱中培养；
[0070]
(3)72h后，按cck
‑
8试剂盒说明书操作，用酶标仪测定450nm处的od值。
[0071]
(4)分析数据，病毒抑制率(％)＝(药物处理组d450nm值
‑
病毒对照组d450nm值)/(正常细胞对照组d450nm值
‑
病毒对照组d450nm值)
×
100％，用graphpad prism5软件得化合物的半数有效浓度(ec
50
)值。其结果如图3所示。然后按公式ti＝cc
50
/ec
50
，计算相应的治疗指数ti值。
[0072]
结果：通过cck
‑
8试剂盒检测细胞活力，可以计算出药物对befv的有效抑制率。从结果可以看出，莫匹罗星在安全浓度范围内，其有效抑制率随着药物浓度的增加而增大，呈一定的量效关系。通过分析软件，对befv的半数有效浓度(ec50)为12.5μm。莫匹罗星对befv的治疗指数为8。
[0073]
实施例4作用机制的初步研究
[0074]
通过不同的给药时间，即对应的时刻是先给药后感染病毒(0h之前)、先感染病毒后给药(0h之后)、病毒和药物同时加入细胞(0h)三个时间点，将待测化合物加入到接种了befv的bhk
‑
21细胞中，进而初步判断莫匹罗星的作用时期。具体实验步骤如下：
[0075]
(1)在96孔板的每个孔中接种1
×
104个bhk
‑
21细胞，37℃，5％co2培养箱中培养。
[0076]
(2)根据已测得的相关药物的药效学评价结果，确定实验所需药物的浓度，并用维持培养基把药物稀释至所需浓度。
[0077]
(3)细胞过夜培养后，将96孔板中第二列三个复孔的细胞上清吸走，用磷酸缓冲液清洗细胞2遍。然后加入50μl的待测药物，记为
‑
2h。
[0078]
(4)2h后，将其他孔的细胞上清全部吸走，将稀释好的befv稀释液加到第2～11列的每孔中，每孔加样体积为50μl。同时在第3列的三个复孔中加入50μl相应待测物，此刻记为0h。
[0079]
(5)以后每隔一定时间在下一列的三个复孔中加入相应待测化合物，标记好相应时间。以第11列的bhk
‑
21细胞作为病毒对照组。
[0080]
(6)培养72h后，进行od值测定。分析数据，得出结论，其结果如图4所示。
[0081]
结果：从不同时间点给药实验结果分析可知，莫匹罗星在病毒感染细胞
‑
2h、0h、2h、4h、6h时加药，
‑
2h、0h对病毒有明显的抑制作用，2h、4h、6h时加药对病毒的抑制作用不大。
[0082]
实施例5化合物不同时间加入对befv复制的影响
[0083]
将莫匹罗星分别采用先加药后加病毒、先加病毒后加药、药物和病毒预先作用的3种不同作用方式进行了体外抗病毒抑制试验。
[0084]
(1)药物对病毒的直接杀伤作用
[0085]
将等量的100tcid
50
病毒液与不同浓度的药物稀释液混合均匀置于37℃、5％co2培养箱中预先作用4h后，加入长成单层的96孔细胞培养板中，每个药液梯度100μl/孔，培养箱中作用2h，弃去上清液，加细胞维持液继续培养。本试验同时设置正常细胞对照组、病毒对照组和空白对照组，每个浓度设3个重复，72h进行细胞活力检测，用graphpad prism5软件得化合物的ec
50
。
[0086]
结果：莫匹罗星与befv预先作用的给药方式下，通过分析软件，莫匹罗星对befv的作用效果如图5所示。从图5中可以看出，在这种作用式下，莫匹罗星在安全浓度范围内100μm、50μm、25μm对befv表现出100％的完全抑制作用，12.5μm对befv表现出50％的抑制作用，表明莫匹罗星对befv具有一定的直接灭活的作用。
[0087]
(2)药物对befv吸附的阻断作用
[0088]
按每孔1
×
104个的细胞密度将消化好的细胞接种到孔板中，待长成单层细胞后弃去上清液，将不同浓度的药物稀释液每个药液梯度100μl/孔，加入长成单层的96孔细胞培养板中，培养箱中预先作用4h后，弃去上清液，用pbs洗两遍，加入等量的100tcid
50
病毒液置于37℃、5％co2培养箱中培养。本试验同时设置正常细胞对照组、病毒对照组和空白对照组，每个浓度设3个重复，72h后进行细胞活力检测，并计算该作用方式下不同浓度药物的抗病毒有效率。
[0089]
结果：通过分析软件，莫匹罗星对befv的作用效果如图6所示，结果显示，在安全浓度范围内，50μm及以上浓度对befv的有效抑制率能达到80％，表明莫匹罗星能阻止befv对细胞的吸附作用。
[0090]
(3)药物对befv复制的阻断作用
[0091]
按每孔1
×
104个的细胞密度将消化好的细胞接种到孔板中，待长成单层细胞后弃去上清液，将等量的100tcid
50
病毒液加入长成单层的96孔细胞培养板中，置于37℃、5％co2培养箱中预先作用2h后，然后弃去上清液，pbs将细胞洗2遍，然后加入不同浓度的药物稀释液，每个药液梯度100μl/孔，本试验同时设置正常细胞对照组、病毒对照组和空白对照组，每个浓度设3个重复，置于37℃、5％co2培养箱中培养，72h后进行细胞活力检测，分析数据，得出结论。
[0092]
结果：通过分析软件，莫匹罗星对befv的复制阻断作用效果如图7所示，结果显示，在安全浓度范围内，莫匹罗星对befv的有效抑制率基本为零，表明莫匹罗星不能有效阻断befv在bhk
‑
21细胞内的复制。
[0093]
本发明应用实施例以bhk
‑
21细胞为载体，在细胞致病模型上，采用先加药后加病毒、先加病毒后加药、病毒预先作用再加药物的3种不同作用方式进行了体外抗病毒抑制研究。发现莫匹罗星的新型抗病毒作用，对befv有一定的抑制作用。
[0094]
以上所述仅为本发明的优选实施例而已，并不用于限制本发明，对于本领域的技术人员来说，本发明可以有各种更改和变化。凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。