一种基于海藻酸钠、纳晶纤维素的抗菌止血多孔微球

1.本发明属于高分子材料领域，具体涉及一种基于海藻酸钠、纳晶纤维素的抗菌止血多孔微球。


背景技术：

2.近年国内外研制的止血剂或止血敷料很多，其中也不乏含抗菌性能的止血敷料，但是大部分产品是利用材料进行抗生素类药物的载药复合或是复合抗菌作用的金，银，碘等抗菌粒子。然而，抗生素类药物的复合虽然可以减少口服或注射抗生素的用量，却不可避免抗生素长久使用的耐药性问题；更重要的是以银、碘等抗菌粒子复合的止血敷料，不可被人体吸收和降解，仅限于体表皮肤的使用，不适合作为体内使用的止血敷料，从而无法满足许多重要临床手术和医用急救的特殊止血处理。
3.天然高分子材料纤维素具有良好的生物相容性和生物可降解性，基于纤维素的止血微球材料已有较多报道。但目前已有的微球材料虽然止血效果良好，但不具有抗菌性能，在止血后，由于微球较强的亲水性能，容易造成伤口的细菌滋生和感染。此外，目前所制备的纤维素基止血微球材料大量使用环氧氯丙烷、三羟甲基丙烷等化学交联剂，交联剂的残留容易引起较强的细胞毒性，影响微球的生物相容性。


技术实现要素：

4.基于上述问题，本发明提供了一种具有良好的生物相容性、无毒性和生物降解性的抗菌止血多孔微球的制备，一种基于海藻酸钠、纳晶纤维素的抗菌止血多孔微球的制备，其使用反相乳液法制备海藻酸钠/纤维素纳米晶多孔微球，具体包括以下步骤：
5.1)油相的制备：向液体石蜡中加入司盘80，700rpm，45℃搅拌1h；
6.2)水相的制备：将海藻酸钠和纤维素纳米晶溶解于30ml去离子水中；
7.3)微球的制备：将水相滴加进油相中，800rpm搅拌2h，再滴加6ml氯化钙溶液(20wt％)， 800rpm搅拌4h；随后分别用正己烷、无水乙醇、去离子水洗涤2遍，离心去除上清，冷冻干燥得到海藻酸钠/纤维素纳米晶sa/ncc多孔微球；将冷冻干燥后的sa/ncc多孔微球100mg投入20ml聚赖氨酸溶液中，200rpm搅拌24h，离心后冷冻干燥，得到海藻酸钠/纤维素纳米晶负载ε-聚赖氨酸sa/ncc@pl多孔微球。
8.作为优选，所述步骤1)中司盘80与液体石蜡的重量比为3％。
9.作为优选，所述步骤2)中海藻酸钠和纤维素纳米的重量比为5:1。
10.作为优选，所述步骤2)中海藻酸钠与去离子水的重量比为1.25％。
11.作为优选，所述步骤3)中水相与油相的重量比为1:3。
12.作为优选，所述步骤3)中氯化钙溶液的质量浓度为20wt％。
13.作为优选，所述步骤3)中聚赖氨酸溶液的质量体积浓度为6mg/ml。
14.另一方面，本发明提供了一种上述方法制备得到的基于海藻酸钠、纳晶纤维素的抗菌止血多孔微球。
15.本发明海藻酸钠、纳晶纤维素的抗菌止血多孔微球的制备方法简单，材料易得，且安全系数好；本发明方法制备得到的海藻酸钠/纤维素纳米晶负载ε-聚赖氨酸多孔微球应用于创面止血，可快速吸收血液减少血流，促进红细胞、凝血因子、血小板等在伤口局部聚集，从而促进止血；此外由于其具有抗菌的性能，可防止创面感染和促进组织愈合。本发明制备得到的多孔微球具有良好的生物相容性、抗菌性、无毒性等特性，有望在伤口止血和创面愈合等方面显现出独特优势。
附图说明
16.图1为不同比例的sa/ncc@pl多孔微球的吸液率。
17.图2为不同比例的sa/ncc@pl多孔微球的孔隙率。
18.图3为不同材料的凝血指数。
19.其中，control为阴性对照组blue crown为蓝冠牌壳聚糖粉，sa为海藻酸钠，sa/ncc 为海藻酸钠/纤维素纳米晶，a为(4％op 3:1 1.5％)，b(3％op 5:1 1.5％)
20.图4为不同材料的溶血率。
21.其中，n.cont.为阴性对照组，p.cont.为阳性对照组sa为海藻酸钠，sa/ncc为海藻酸钠/纤维素纳米晶，sa/ncc@pl为多孔微球(3％op 5:1 1.5％)。
22.图5为sa/ncc多孔微球和sa/ncc@pl多孔微球的扫描电镜图。
23.图6为不同浓度sa/ncc@pl多孔微球的细胞存活率。
24.图7为不同材料对大肠杆菌、金黄色葡萄球菌和铜绿假单胞菌的抑菌率和抑菌图。
25.图8为sa/ncc@pl多孔微球粘附血小板和红细胞和缠绕不溶性纤维蛋白的扫描电镜图。其中，a、b为sa/ncc@pl多孔微球粘附血小板和红细胞的扫描电镜图，c、d为sa/ncc@pl 多孔微球缠绕不溶性纤维蛋白的扫描电镜图。
26.图9为不同材料在小鼠肝出血模型中的止血时间和出血量。
27.图10为不同材料在小鼠创伤模型中的愈合能力。
28.图11为创伤后第10天对新组织的h&e染色结果。
具体实施方式
29.下列实施例用于进一步解释说明本发明，但是，它们并不构成对本发明范围的限制或限定。
30.实施例1
31.1)油相：向90g液体石蜡中加入不同量的司盘80(2％，3％，4％，5％，6％)，700rpm，45℃搅拌1h；
32.2)水相：将海藻酸钠和纤维素纳米晶(两者在水相中的不同质量比：1:1，2:1，3:1，4:1， 5:1和两者总和占水相质量比：0.5％，1.0％，1.5％，2.0％，2.5％)溶解于30ml去离子水中。
33.3)将水相滴加进油相中(水相与油相的重量比为1:3)，800rpm搅拌2h，再滴加6ml氯化钙溶液(20wt％)，800rpm搅拌4h；随后分别用正己烷、无水乙醇、去离子水洗涤2遍，离心去除上清，冷冻干燥得到sa/ncc多孔微球；将冷冻干燥后的sa/ncc多孔微球100mg投入20ml 聚赖氨酸溶液(6mg/ml)中，200rpm搅拌24h，离心后冷冻干燥，得到不同量的司盘80
(op)，不同量不同比例的海藻酸钠和纤维素纳米晶条件下制备的sa/ncc@pl多孔微球。
34.实施例2
35.测定实施例1制备得到的不同量的司盘80(op)，不同量不同比例的海藻酸钠和纤维素纳米晶的sa/ncc@pl多孔微球的吸液率和孔隙率，相关结果见图1及图2，得到两组较佳配比的微球制备条件a(4％op 3:1 1.5％)；b(3％op 5:1 1.5％)。
36.多孔微球的吸液率的测定：将冻干的sa/ncc@pl多孔微球称量为w1，浸泡在含有去离子水的离心管中充分膨胀。然后用低速离心去除多余的液体，称重湿多孔微球，记为w2。按公式计算吸液率:
[0037][0038]
多孔微球的孔隙率的测定：将一定重量的冻干sa/ncc@pl多孔微球浸泡在4ml无水乙醇中，超声振荡10min。然后加入无水乙醇至4ml。冻干多孔微球的重量记为wa。无水乙醇在多孔微球中浸泡前的重量记为wb。记录超声后液体和无水乙醇补充的多孔微球的总体积为wc。吸收乙醇的湿多孔微球用wd表示。sa/ncc@pl多孔微球的孔隙率(p)由下式计算:
[0039][0040]
实施例3
[0041]
比较不同材料与阴性对照组和市售蓝冠牌壳聚糖止血粉的凝血指数(bci％)，最终得到 b(3％op 5:1 1.5％)组的凝血指数最低，凝血效果最好，相关结果见图3。
[0042]
凝血指数的测定：将10mg sa/ncc@pl多孔微球置于玻璃瓶底部，37℃预热10min。然后加入新鲜抗凝兔血200ul混合均匀，加入20ulcacl2溶液37℃混合培养10min。在玻璃烧瓶中加入5ml去离子水，振动(50rpm)2min，以清洁未凝固的红细胞。用紫外分光光度计在540nm 处测定所得溶液的吸光度。以200ul未凝固全血在5ml去离子水中的吸光度作为阴性对照。根据以下公式计算bci:
[0043][0044]
溶血率的测定：将新鲜兔抗凝血与ph＝7.4的pbs混合，离心收集血清中的红细胞。用pbs 稀释获得的红细胞。用玛瑙将样品压碎，加入pbs，超声制备悬浮液2h。将pbs稀释的红细胞加入到含不同样品和不同浓度sa/ncc@pl多孔微球的pbs悬液中。去离子水和pbs分别作为阳性对照组和阴性对照组。所有组均于37℃摇床中孵育3h，离心后用紫外分光光度计在540nm 处测定吸光度。按以下公式计算溶血率％:
[0045][0046]
式中as、aw、ap分别为样品、去离子水和pbs的吸光度。
[0047]
溶血率是评价植入物血液相容性的一种简单可靠的方法。相关溶血率的结果见表4，根据国际标准，只有溶血率低于5％的产品才能满足临床应用的血液安全性要求。sa/ncc@pl组的溶血率仅为0.99％，说明sa/ncc@pl多孔微球对血液是安全的，适合开发用作止
血材料。
[0048]
用扫描电镜(fei quanta 250，日本)对制得的sa/ncc和sa/ncc@pl多孔微球进行sem 表征，以观察微球表面的形貌特点，结果如图5所示。
[0049]
通过sem表征结果发现，微球大小在2μm附近。相比于sa/ncc微球，负载聚赖氨酸后微球表面孔隙更密集，更均匀。高孔隙率的sa/ncc@pl微球在用于出血创面时，具有较好的血液吸收能力，从而聚集血小板和血细胞，促进血块迅速形成。
[0050]
实施例4
[0051]
用成纤维细胞(l929)和mtt法评价sa/ncc@pl多孔微球的细胞毒性。sa/ncc@pl多孔微球灭菌后，浸泡在mem培养基中(37℃)孵育24h。将不同浓度的多孔微球浸出液逐渐稀释，采用 mtt法检测细胞活力，未添加多孔微球的空白培养基作为阴性对照组。相对细胞活力计算如下:
[0052][0053]
相关测定结果如图6所示，根据细胞存活率(《50％，毒性；51-70％，低细胞毒性；》70％，无细胞毒性)对结果进行分类。在所有测试浓度下，sa/ncc@pl的细胞存活率均高于80％，尤其当sa/ncc@pl浓度为30μg/ml时，相对细胞活性接近于90％。因此，sa/ncc@pl多孔微球在体外对细胞是安全的。
[0054]
实施例5
[0055]
为了抵抗感染和促进创伤愈合，我们选择金黄色葡萄球菌(s.aureus)、大肠杆菌(e.coli) 和铜绿假单胞菌(p.aeruginosa)进行抑菌试验。蓝冠壳聚糖粉、sa、sa/ncc,sa/ncc@pl10mg 含有不同浓度的pl(1.0,2.0,3.0,4.0,6.0mg/ml)和10ml细菌悬液(在无菌水,104cfu /ml)(37℃)孵化1h。然后,50ul孵化细菌悬液均匀地涂布在固体琼脂培养基和培养(37℃)12 h。最后记录固体琼脂培养基上的活菌数，计算材料的抑菌率(ar，％)。阳性对照组为市售蓝冠壳聚糖止血粉，阴性对照组为活性相同的菌悬液，不经任何处理。抑菌率计算公式如下:
[0056][0057]
其中nn为阴性对照组的菌落数，ns为样品的菌落数。
[0058]
结果如图7所示，sa/ncc@pl多孔微球抑菌率均接近于100％，具有显著的抗菌性能。尤其对金黄色葡萄球菌的抑菌率达到98％。而没有负载pl的材料抑菌率均低于60％。
[0059]
实施例6
[0060]
用扫描电镜(fei quanta 250，日本)表征了sa/ncc@pl多孔微球对血小板和红细胞的粘附以及纤维蛋白的形成。pbs(37℃)浸泡sa/ncc@pl多孔微球2h，加入新鲜兔全血，37℃孵育 1h。然后用pbs冲洗3次，2.5％戊二醛在4℃下固定2h,90％和100％乙醇溶液分别浸泡10min。冻干12h后，扫描电镜观察到多孔微球粘附血小板和红细胞和缠绕的纤维蛋白。
[0061]
结果如图8所示，sa/ncc@pl显示出强大的红细胞和血小板结合能力，微球周围有大量的红细胞和血小板粘附与聚集。尤其可以看出微球周围的血小板呈现许多假足变形和伸展，表明血小板被激活并参与止血过程。此外，sa/ncc@pl微球与纤维蛋白聚集体相互交
叉缠绕，最终形成稳定的血液凝块。
[0062]
实施例7
[0063]
肝出血模型是检验止血性能的常用动物模型。考察不同材料在小鼠肝出血模型中的止血时间和出血量。本所有样品在试验前均用紫外辐射灭菌1h。在暴露的小鼠肝脏上进行约1cm的十字型切口。实验结束时，用静脉注射空气杀死所有小鼠。记录不同材料的肝出血的凝固时间和出血量，结果如9所示。
[0064]
数据表明，sa/ncc@pl治疗后，出血量由阴性组的55mg降至13mg，止血时间由73s缩短至48s。出血量与出血时间与市售蓝冠止血粉相近。sa/ncc@pl在出血模型的治疗中显示出明显的优势。
[0065]
图10为小鼠创伤模型上观察到的创伤愈合过程。在第0天、第2天、第6天和第10天观察伤口愈合情况。第2天sa/ncc@pl治疗的创面面积收缩更多，且创面周围毛发生长迅速。第 10天时，sa/ncc@pl组创面已接近愈合完全，剩余创面面积明显小于其他组。创伤愈合过程中， sa/ncc@pl组一直处于领先地位，证明sa/ncc@pl多孔微球显著促进了全层缺损创面的愈合。
[0066]
为了评估新形成的皮肤组织的质量，在第10天通过h&e染色进一步进行组织学分析。结果如图11所示，术后第10天，空白组新生真皮无毛囊和皮脂腺，角质形成不完全，其他组均呈现出较多的毛囊和皮脂腺，表皮层和真皮层分层明显。sa/ncc@pl组毛囊已经开始变形，形成与正常皮肤相似的完整真皮。