普萘洛尔的医药新用途

1.本发明属于细胞生物学和医药技术领域，具体涉及普萘洛尔（propranolol，prop）的医药新用途。


背景技术：

2.我国食管癌发病率为17.87/10万，居恶性肿瘤第6位；死亡率为13.68/10万，居恶性肿瘤第4位。2019年综合国家多中心临床数据分析显示，食管鳞状细胞癌（esophageal squamous cancer，escc）约占食管癌总数的95.5%。在治疗及随访中发现escc易早期转移、易复发，即使外科手术、靶向治疗、生物治疗等多学科综合或联合治疗，晚期escc患者5年生存率仍低于20%。因此，探索新药或新治疗方案是改善疗效及escc患者生存率的迫切需要。
3.普萘洛尔（propranolol, prop）是一种非选择性β1、β2肾上腺素能受体阻滞剂，临床已用于控制交感神经过度活跃的症状，如高血压、嗜铬细胞瘤、心绞痛、心肌梗死和心律失常。近年来，研究发现，交感神经活性增强导致机体肾上腺素能激素水平升高，通过β-肾上腺素受体促进前列腺癌、乳腺癌、卵巢癌、黑色素瘤进展，而prop的肾上腺素能受体阻滞剂功能可抑制这一进展。目前，普萘洛尔临床应用副作用小，至今尚无prop治疗食管鳞癌的相关报道。鉴于食管有交感神经支配且食管癌细胞表达β-肾上腺素受体，因此，prop或以prop为基础制备应用于抗食管鳞癌疾病的药物无疑将提高抗肿瘤疗效并显著降低科研投入及患者的医药负担。


技术实现要素：

4.本发明的目的是提供了普萘洛尔的医药新用途，通过食管鳞癌细胞模型和裸鼠肿瘤模型发现prop抑制肿瘤细胞中akt、mtor的磷酸化水平，增强自噬流通量，促进lc3蛋白表达，从而有效抑制食管鳞癌细胞增殖、迁移、周期并促进凋亡和自噬。
5.本发明为解决上述技术问题采用如下技术方案，普萘洛尔在制备治疗肿瘤药物中的应用，该普萘洛尔的结构式为。
6.进一步限定，所述肿瘤为食管鳞癌，所述普萘洛尔能够抑制食管鳞癌细胞中akt、mtor的磷酸化水平，增强自噬流通量，促进lc3蛋白表达，进而抑制食管鳞癌细胞增殖、迁移、周期并促进凋亡和自噬，从而有效抑制食管鳞癌细胞进展。
7.进一步限定，所述食管鳞癌包括食管鳞状细胞癌、食管腺鳞癌、食管鳞腺癌、转移或复发等已知及未知因素导致的非食管位置情况下的食管鳞癌。
8.一种药物制剂，其中含有治疗有效剂量的普萘洛尔及药学上可接受的载体、佐剂或媒剂。
9.进一步限定，所述药物制剂在制备治疗食管鳞癌药物中的应用。
10.进一步限定，所述食管鳞癌包括食管鳞状细胞癌、食管腺鳞癌、食管鳞腺癌、转移或复发等已知及未知因素导致的非食管位置情况下的食管鳞癌。
11.本发明中，在给予哺乳动物上述普萘洛尔化合物及其药学上可接受的盐，片剂、胶囊剂、丸剂、颗粒剂、混悬剂、滴丸或口服液体制剂以及这些化合物的溶剂化物（这里统称为治疗药物）时，可以单独使用，或者最好是按照规范的制药方法将其与适于药用的载体或稀释剂配合后使用。给药方式可以经各种途径，包括口服、非胃肠道给药或局部给药。这里所指的非胃肠道给药包括但并不限于静脉注射、肌肉注射、腹腔注射、皮下注射和透皮给药。
12.本发明经过实验证明：prop显著抑制食管鳞癌细胞增殖、迁移、周期及裸鼠荷瘤能力并促进凋亡和自噬。实验过程中，所述prop的药物用量为：细胞40-100 μm，动物15 μg/kg。
13.细胞实验结果显示：prop显著抑制食管鳞癌细胞增殖、迁移、周期并促进凋亡和自噬。
14.动物实验结果显示：prop能够显著抑制小鼠皮下异种移植瘤的增殖，且在治疗剂量下对小鼠各主要脏器无明显毒性，且对小鼠体重无任何影响。本发明的优点在于：（1）本发明首次发现了prop抑制食管鳞癌细胞增殖、迁移、周期及裸鼠荷瘤能力并促进凋亡和自噬，并且在有效剂量 下无明显毒性。
15.（2）本发明中首次发现了prop能够抑制β肾上腺素受体下游akt、mtor磷酸化水平并增强自噬流通量，上调lc3b表达。
附图说明
16.图1为实施例中prop对人食管鳞癌细胞eca109、kyse-450、te-1增殖的影响（graphpad prism9.0 , two-sided student’s t test，*p 《 0 .05）；图2为实施例中prop对人食管鳞癌细胞eca109、kyse-450、te-1迁移的影响（graphpad prism9.0 , two-sided student’s t test，*p 《 0 .05）；图3为实例中prop对人食管鳞癌细胞eca109、kyse-450、te-1周期、凋亡的影响（graphpad prism9.0 , two-sided student’s t test，*p 《 0 .05）；图4为实施例prop对人食管鳞癌细胞eca109自噬通量的影响（graphpad prism9.0 , two-sided student’s t test，*p 《 0 .05）；图5为实施例中prop对人食管鳞癌细胞eca109在裸鼠皮下成瘤的影响（graphpad prism9 .0 , two-sided student’s t test，*p 《 0 .05）；图6为实施例中prop对p-mtor、p-akt修饰水平以及lc3b蛋白表达的影响（graphpad prism9.0 , two-sided student’s t test，*p 《 0 .05）。
具体实施方式
17.以下通过实施例对本发明的上述内容做进一步详细说明，但不应该将此理解为本发明上述主题的范围仅限于以下的实施例，凡基于本发明上述内容实现的技术均属于本发明的范围。
18.药物及试剂：本实验所用prop购自sigma公司，其它试剂为市售的分析纯试剂。
19.细胞活力测定：pbs或prop（40-100 μm）分别处理eca109、kyse-450、te-1细胞0 h、
24 h、48 h、72 h，mtt法测定细胞活力。
20.transwell迁移的测定：设置pbs、prop 60 μm、prop 80 μm三组，常规消化eca109、kyse-450、te-1细胞，无血清rpim 1640培养基重悬，调整细胞密度为5.0
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105/ml，下室加600
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l含10%胎牛血清培养基，将小室放入培养板中，取200 μl加入transwell上室，放入37 ℃、体积分数5% co2培养箱中培养40 h。
21.流式细胞术检测细胞周期、凋亡：eca109、kyse-450、te-1细胞分别prop 80
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m预处理48 h。通过离心收集的细胞在预冷pbs中洗涤，并根据制造商的方案用annexin v-fitc和碘化丙啶（pi）染色。细胞周期分析试剂盒用于检测细胞周期进展。细胞用prop 80
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m预处理48 h。通过离心收集的细胞在预冷pbs中洗涤，并根据制造商的方案用碘化丙啶（pi）染色。每个样本重复三次。数据通过流式细胞仪并通过flowjo-v10软件进行分析。
22.自噬通量或lc3定位及表达的测定：细胞按3
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105个/小皿铺板，过夜后细胞贴壁并充分伸展，按照感染复数（multiplicity of infection，moi）=20，plvx-mcherry-c1-egfp-lc3b病毒（1.0
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10
11 tu/l）使用体积为20 μl/ml，按照polybrene说明书使用其终浓度为5 μg/ml，步骤严格按照polybrene试剂说明书进行，经puromycin筛选获得稳定表达lc3b细胞株并常规培养，按是否应用 prop（80 μm）处理设为pbs组（不加药）、prop组，按3
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105个/小皿铺板，细胞贴壁后，按设置的分组加pbs或prop分别处理12 h、24 h、36 h，荧光显微镜下拍照。
23.小鼠皮下异种移植瘤增殖的测定：食管鳞癌eca109细胞按5
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106个/100 μl分别接种于每只裸鼠右侧腋下，分为pbs组和prop组(加药组)，每组5只，接种细胞后即对加药组进行灌胃，隔日1次，0.4 ml/次，持续2周，每3天观察并记录瘤体大小，测量瘤体长径及短径，建立生长曲线。15天后脱臼处死裸鼠，完整剥离瘤体组织，称瘤体质量并计算瘤体体积。体积（mm3）=1/2（长径
×
短径）2；抑瘤率=1-实验组瘤体体积/实验组瘤体体积。
24.细胞中akt、mtor及其磷酸化水平，自噬流强度，lc3蛋白表达水平的表达测定：pbs或prop（60 μm、80 μm）处理eca109、kyse-450、te-1 48 h，收集细胞，依据蛋白提取试剂盒操作说明western blot技术检测细胞中蛋白的表达以及应用荧光显微镜拍照。
25.实施例1细胞活力测定：pbs或prop（40-100 μm）分别处理eca109、kyse-450、te-1细胞0 h、24 h、48 h、72 h，mtt法测定细胞活力。实验结果如图1所示，prop可明显地抑制人食管鳞癌eca109、kyse-450、te-1细胞的增殖。
26.实施例2transwell迁移的测定：设置pbs、prop 60 μm、prop 80 μm三组，常规消化eca109、kyse-450、te-1细胞，无血清rpim 1640培养基重悬，调整细胞密度为5.0
×
105/ml，下室加600
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l含10%胎牛血清培养基，将小室放入培养板中，取200 μl加入transwell上室，放入37℃、体积分数5% co2培养箱中培养40 h。实验结果如图2所示，prop抑制人食管鳞癌eca109、kyse-450、te-1细胞迁移。
27.实施例3流式细胞术检测细胞周期、凋亡：eca109、kyse-450、te-1细胞分别prop 80
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m预处理48 h。通过离心收集的细胞在预冷pbs中洗涤，并根据制造商的方案用annexin v-fitc和碘化丙啶（pi）染色。细胞周期分析试剂盒用于检测细胞周期进展。细胞用prop 80
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m预
处理48 h。通过离心收集的细胞在预冷pbs中洗涤，并根据制造商的方案用碘化丙啶（pi）染色。每个样本重复三次。数据通过流式细胞仪并通过flowjo-v10软件进行分析。实验结果如图3所示，prop抑制人食管鳞癌eca109、kyse-450、te-1细胞周期并促进凋亡。
28.实施例4自噬通量或lc3定位及表达的测定：细胞按3
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105个/小皿铺板，过夜后细胞贴壁并充分伸展，按照感染复数（multiplicity of infection，moi）=20，plvx-mcherry-c1-egfp-lc3b病毒（1.0
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10
11 tu/l）使用体积为20 μl/ml，按照polybrene说明书使用其终浓度为5 μg/ml，步骤严格按照polybrene试剂说明书进行，经puromycin筛选获得稳定表达lc3b细胞株并常规培养，按是否应用 prop（80 μm）处理设为pbs组（不加药）、prop组，按3
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105个/小皿铺板，细胞贴壁后，按设置的分组加pbs或prop分别处理12、24、36 h，荧光显微镜下拍照。实验结果如图4所示，prop增加人食管鳞癌eca109细胞自噬通量。
29.实施例5小鼠皮下异种移植瘤增殖的测定：食管鳞癌eca109细胞按5
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10
6 个/100 μl分别接种于每只裸鼠右侧腋下，分为pbs组和prop组（加药组），每组5只，接种细胞后即对加药组进行灌胃，隔日1次，0.4 ml/次，持续2周，每3天观察并记录瘤体大小，测量瘤体长径及短径，建立生长曲线。15天后脱臼处死裸鼠，完整剥离瘤体组织，称瘤体质量并计算瘤体体积。体积（mm3）=1/2（长径
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短径）2；抑瘤率=1-实验组瘤体体积/实验组瘤体体积。实验结果如图6所示，prop增加人食管鳞癌eca109、kyse-450、te-1细胞自噬通量。实验结果如图5所示，prop抑制人食管鳞癌细胞eca109裸鼠皮下成瘤的增殖。
30.实施例6细胞中akt、mtor及其磷酸化水平，自噬流强度，lc3蛋白表达水平的表达测定：pbs或prop（60 μm、80 μm）处理eca109、kyse-450、te-1 48 h，收集细胞，依据蛋白提取试剂盒操作说明western blot技术检测细胞中蛋白的表达以及应用荧光显微镜拍照。实验结果如图6所示，prop下调p-mtor、p-akt修饰水平，促进lc3b蛋白表达。
31.以上显示和描述了本发明的基本原理，主要特征和优点，在不脱离本发明精神和范围的前提下，本发明还有各种变化和改进，这些变化和改进都落入要求保护的本发明的范围。