一种含重组人溶菌酶的面部抗菌护理液的制作方法

1.本发明涉及一种面部抗菌护理液，尤其是含重组人溶菌酶的面部护理液。


背景技术：

2.痤疮也称为青春痘，面部痤疮就是脸上长青春痘，这是一种常见的皮肤病，一般多见于青少年，当然面部痤疮也没有年龄限制。
3.面部痤疮有很多种类型，面部粉刺、丘疹、脓疱、结节等多形性皮损为主。严重的还会化脓。痤疮的发生主要与皮脂分泌过多、毛囊皮脂腺导管堵塞、油脂不能及时排出而堵塞毛孔，则使厌氧菌痤疮丙酸杆菌大量增殖破坏表皮细胞而引发炎症反应。痤疮丙酸杆菌(propionibacterium acnes)作为一种厌氧菌，在有氧条件下不致病，而当皮脂腺导管口闭塞形成，无氧环境时，痤疮丙酸杆菌更容易菌群失调，变成致病菌。同时，表皮葡萄球菌(staphylococcus epidermidis)是皮肤的常驻菌群，研究发现，痤疮患者皮损处的微生物最常见的是痤疮丙酸杆菌和表皮葡萄球菌。金黄色葡萄球菌(staphylococcus aureus)是人类化脓感染中最常见的病原菌，可引起局部化脓感染，金黄色葡萄球菌有时也参与痤疮的炎症反应。马拉色菌(malassezia)属于皮肤常住真菌，malassezia属双相型嗜脂酵母菌，好寄生于人体皮脂分泌旺盛部位，相关人员在临床诊疗中发现炎症较重、病情反复、常规治疗无效的痤疮患者，可能伴随马拉色菌感染，可以考虑是否应用抗真菌治疗。
4.溶菌酶(1ysozyme)是1923年由青霉素的发明者
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英国著名科学家弗莱明在偶然机会中发现的一种天然抗菌物质，又称胞壁质酶(muramidase)或n-乙酰胞壁质聚糖水解酶(n-acetylmuramide glycanohydrlase)，它属于碱性酶，能极大地水解致病菌中黏多糖。溶菌酶可水解肽聚糖中n.乙酰胞壁酸和n.乙酰葡萄糖胺之间的b.1，4糖苷键，在渗透压作用下导致革兰氏阳性菌细胞壁破裂，从而发生重要的溶菌作用。它主要通过破坏细胞壁中的n-乙酰胞壁酸和n-乙酰氨基葡糖之间的β-1,4糖苷键，使细胞壁不溶性黏多糖分解成可溶性糖肽，导致细胞壁破裂内容物逸出而使细菌溶解。溶菌酶还可与带负电荷的病毒蛋白直接结合，与dna、rna、脱辅基蛋白形成复盐，使病毒失活。因此，这种溶菌酶具有抗菌、消炎、抗病毒等重要作用。
5.溶菌酶有自己的作用范围，即溶菌谱。不同来源的溶菌酶，其溶菌谱各不相同。鸡蛋清溶菌酶只对革兰氏阳性菌有溶菌作用。在溶菌酶中，人体中的溶菌酶活性最高，其次是鸡蛋白中的溶菌酶，最低的是牛乳中的溶菌酶。溶菌酶作为防腐剂，其本身是一种天然蛋白质，没有毒性。同时溶菌酶仅能作用于目的微生物的细胞壁，而不能作用于其它物质。


技术实现要素：

6.本发明旨在提供一种面部抗菌护理液，尤其是含重组人溶菌酶的面部抗菌护理液；专用于脸部杀菌、抗菌、止痒、祛痘、修复过敏性皮肤，疏通毛孔用于脱皮、干性皮肤和控油治疗毛囊炎症。
7.本发明的作用还在于杀灭粉刺、痤疮、毛囊炎、酒糟鼻、毛囊堵塞和受伤后引起金
黄色葡萄球菌化脓感染预防炎症发生。
8.本发明的面部抗菌护理液重要活性成分为重组人溶菌酶。
9.为了进一步提高的本面部护理液抑制痤疮的功能，本发明的面部抗菌护理液还可含有杜鹃花酸，水杨酸，柠檬酸，烟酰胺中的一种或数种辅助杀菌、抑菌物质合用。其中，杜鹃花酸能改善油脂分泌旺盛，并具有较强的抑菌杀菌功能。水杨酸是一种角质松解剂，其作用机理主要是溶解胞间粘合质从而破坏上皮的完整性，具有较弱的抗炎作用，低浓度下还有抑制真菌和细菌的作用。烟酰胺(nicotinamide)是维生素b3的活性酰胺，其作用机理是抑制皮脂腺细胞的分泌功能，从而减少皮肤油脂，其结构中特有的吡啶环具有抗炎活性，能消除炎症反应中起主要作用的超氧阴离子自由基。寻常痤疮的形成原因之一是毛囊漏斗部角朊细胞粘连性增加，角化物堆积造成毛囊口堵塞，致使皮脂腺不能通畅的排泄皮脂，柠檬酸可使角质层粘连性减弱，使毛囊漏斗部引流通畅，因而可以改善痤疮。
10.综上，为实现本发明的目的，本发明采用以下技术方案：
11.一种面部抗菌护理液，其特征在于所述面部抗菌护理液含有重组人溶菌酶。
12.进一步地，每毫升面部抗菌护理液中，含4000-40000溶菌酶国际单位。
13.基因重组人溶菌酶来源丰富，制备工艺简单，使用方便，价格低廉，安全无毒副作用，无免疫原性。所述重组人溶菌酶的制备方法可以采用，人溶菌酶毕赤酵母重组表达，然后再经离子交换柱吸附后洗脱纯化，经透析后冷冻干燥得产品。
14.进一步地，所述面部抗菌护理液可含有以下组分：
15.重组人溶菌酶每毫升4000-40000溶菌酶国际单位；
[0016][0017]
所述面部抗菌护理液用纯化水补足100质量份。
[0018]
进一步地，所述面部抗菌护理液可含有以下辅料中的一种或数种：乙基己基甘油，辛酰羟肟酸，月桂酰胺丙基甜菜碱。
[0019]
乙基己基甘油，能显著改善化妆品的皮肤感觉，有保湿作用，可赋予配方令人愉快的肤感。一般用量0.5～2％(质量分数)
[0020]
辛酰羟肟酸，属于椰子油衍生物，用量0.045～0.063％.
[0021]
月桂酰胺丙基甜菜碱，属烷基丙基甜菜碱产品系列中的一种，具有优良的性能，极低刺激性的两性表面活性剂，可广泛与阳离子、阴离子、非离子表面活性剂配伍，具有理想的洗涤、调理、抗静电和杀菌作用，有优良的柔软性，对皮肤作用温和，泡沫丰富而稳定，并且有良好的粘度调节作用，用量1～2％。
[0022]
基于以上技术方案，本发明含重组人溶菌酶的面部抗菌护理液具有以下用途；
[0023]
在改善痤疮和青春痘的皮肤表面清洁用品中的应用。
[0024]
在用于脸部杀菌、抗菌、止痒、祛痘、修复过敏性皮肤以及疏通毛孔而用于脱皮、干性皮肤和控油治疗毛囊炎症的护理用品中的应用。
[0025]
根据广谱抗菌和深度抗菌原理，通过面膜或者喷在面部后，在皮肤表面形成一层保护膜，保护膜厚度约0.5毫米，这个厚度内的皮肤是无菌状态的。本发明的上述皮肤表面清洁用品、护理用品可以为面膜或喷涂剂。
[0026]
本发明的溶菌酶组合护理液具有较强的抑菌效果，应用于常见化妆品传统水剂配方中可有效抑制化妆品中的常见细菌，真菌，有效改善痤疮。本发明产品无过敏现象，可单独或与其它合格护肤品配合使用。
附图说明
[0027]
图1为实施例1制备的人溶菌酶冻干粉的照片。
[0028]
实施方式
[0029]
实施例1，重组人溶菌酶的制备
[0030]
依据p.pastoris其偏爱密码子，人工合成了去除自身信号肽的人溶菌基因(ncbi登录号：nm_000239.2)序列，并构建由酿酒酵母α-因子信号肽引导表达具有天然n端人溶菌酶基因的重组ppic9k-lyc6分泌型毕赤酵母表达载体。将线性化重组质粒分别电转入gs115中，定点整合至酵母基因组，并通过营养筛选与多拷贝鉴定，获得具有稳定整合表达载体的多拷贝插入菌株。通过摇瓶培养和诱导表达，初步筛选出蛋白表达量和活性较高的菌株，然后，在50l和500l发酵罐中进行密度发酵放大，发酵液经离心、过滤处理后采用复合型阳离子交换柱bestarose mmc diamond捕获蛋白，然后用bestdex g-25凝胶过滤柱进行缓冲液置换，最后阳离子交换柱sp bestarose ff浓缩目的蛋白，hplc检测终产品为单一峰，纯度大于99％；人源溶菌酶纯品为白色冻干粉，无味，溶于水，不溶于乙醚和丙酮。纯度》99％(sds-page)，活性》120,000u/mg(参考国家标准gbt 25879-2010测定)
[0031]
实施例2
[0032]
一种含人源溶菌酶的面部护理液，其中含：
[0033]
重组人溶菌酶，每毫升10000溶菌酶国际单位；杜鹃花酸2％；柠檬酸5％；水杨酸0.5％；烟酰胺0.5％；乙基己基甘油0.5％；辛酰羟肟酸0.045％，月桂酰胺丙基甜菜碱1％，其余由纯化水混配制成。
[0034]
实施例3
[0035]
一种含人源溶菌酶的面部护理液，其中含：
[0036]
重组人溶菌酶每毫升20000溶菌酶国际单位；杜鹃花酸4％；柠檬酸5％；水杨酸1.5％；烟酰胺3％；乙基己基甘油2％；辛酰羟肟酸0.05％，月桂酰胺丙基甜菜碱1％，其余由纯化水混配制成。
[0037]
实施例4
[0038]
一种含人源溶菌酶的面部护理液，其中含：
[0039]
重组人溶菌酶每毫升40000溶菌酶国际单位；杜鹃花酸5％；柠檬酸5％；水杨酸1.5％；烟酰胺2％；乙基己基甘油1％；辛酰羟肟酸0.05％，月桂酰胺丙基甜菜碱1％，其余由纯化水混配制成。
[0040]
实施例5
[0041]
将实施例2的面部护理液制成保湿面膜，其液体成分为其中含重组人溶菌酶每毫升20000溶菌酶国际单位；杜鹃花酸4％；柠檬酸5％；水杨酸1.5％之间；烟酰胺3％；乙基己
基甘油2％；辛酰羟肟酸0.05％，月桂酰胺丙基甜菜碱1％，其余由纯化水混配制成。
[0042]
实施例6，牛津杯法检测面部护理液的抑菌活性
[0043]
抑菌试验是指在体外测定样品的抑菌或杀菌能力。在药品、功能食品、保健品和化妆品等行业中，所用物质的抑菌性能是一个重要指标。抑菌试验常用的方法有抑菌圈法、菌落计数法、最小抑菌浓度法和比浊法等。牛津杯法属于抑菌圈法的一种，其原理是利用待测药物在琼脂平板中扩散使其周围的细菌生长受到限制而形成透明圈——抑菌圈，根据抑菌圈大小判定待测药物抑菌效价。它既可用于定性试验，也可用于定量分析，并且操作便捷、结果准确可靠，在多个领域被广泛使用。
[0044]
在制备双层检测平板最后，待上层培养基冷却后，放入已灭菌的牛津杯数个，并按一定次序排放整齐。用一次性移液枪头分别吸取100～200微升面部护理液或面部护理液稀释液(实施例4)，以无菌操作加入到牛津杯内，同时每个培养皿中保留一个牛津杯加入相同量的无菌蒸馏水作为负对照。将该检测平板放入37℃培养箱内，正置培养16～24h后，照相记录抑菌圈大小，并采用十字交叉法测量其直径(mm)。
[0045][0046]
实施例7面部护理液对痤疮丙酸杆菌抑菌活性
[0047]
试验概述：将痤疮丙酸杆菌接种在厌氧菌血平皿上，厌氧培养48h(厌氧手套箱中),厌氧罐(72h)中，取一定量(3-5个菌落)混悬在不抑制厌氧菌生长的透明肉汤中(布氏菌肉汤)。稀释法调节痤疮丙酸杆菌浓度使终浓度为106cfu/ml。将面部护理液和5倍稀释面部护理液用于抑菌研究。
[0048]
接种：用1mm接种环取一满环105～106/ml菌液，或1.5～3.0
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108ml菌液取0.001～0.003ml。接种于面部护理液和5倍稀释面部护理液(实施例4)，和生理盐水的平板上，9cm平板培养基可接种4～8株，按照划线2cm左右，10分钟处理毕，置厌氧培养37℃，48小时观察结果。
[0049]
试验结果：37℃厌氧培养48小时，我们发现面部护理液和5倍稀释面部护理液组痤
疮丙酸杆菌均不生长，而生理盐水组痤疮丙酸杆菌正常生长。