1.本发明涉及生物技术领域，具体是一种骨髓间充质干细胞复合人脱细胞真皮的方法及制得的组织工程皮肤在修复皮肤缺损中的用途。
背景技术：
2.皮肤作为人体的天然保护屏障，对维持内环境的稳定和阻止外界微生物的入侵具有重要的作用。各种原因引起的皮肤缺损在临床上十分常见，目前最常用的治疗方法是通过自体皮移植，同种异体皮或异种皮移植，以及复合皮移植等。但这些方法具有供区不足，皮源紧张，免疫排斥及传播疾病等缺点。因此，寻找更好的皮肤代替物来治疗皮肤缺损显得尤为必要。
3.随着组织工程学的发展，组织工程皮肤的研究逐渐成为热点，多种类型的组织工程皮肤开始应用到临床，并取得了良好的效果。构建组织工程皮肤的种子细胞和支架材料多种多样，选择合适的种子细胞和支架材料以及探索合适的构建方法，将直接影响到组织工程皮肤对皮肤缺损修复的效果。
技术实现要素：
4.本发明就是为了解决现有技术中存在的问题，所提出了一种骨髓间充质干细胞复合人脱细胞真皮的方法及制得的组织工程皮肤在修复皮肤缺损中的用途。
5.本发明采用了如下的技术方案。
6.一种骨髓间充质干细胞复合人脱细胞真皮的方法，包括以下步骤：a.将脱细胞真皮放入细胞培养板上，加入完全培养基浸泡18-24h，置于37℃培养箱中孵育 1-2h；b.将处于对数生长期的第3代骨髓间充质干细胞用 0.25％胰蛋白酶液消化，消化3-5min后终止消化，吹打悬浮细胞，收集悬液，1200-1500rpm/min离心5-8min，弃上清；采用完全培养基重悬细胞，在37℃孵育 36-60h，1200-1500rpm/min离心5-8min，弃上清，再次重悬细胞；c按细胞密度10
3-105/孔将步骤b中获得的骨髓间充质干细胞接种于含有脱细胞真皮的细胞培养板中，置于 37℃，5％c0
2 ，95％湿度的无菌培养箱中培养，每隔2-3天换液一次，观察细胞成活及生长情况。
7.进一步的，步骤a中，脱细胞真皮的制备方法如下：人源真皮清洗消毒后，用低渗溶液反复浸泡清洗皮肤；将清洗后的皮肤用2-3mg/ml dispaseⅱ溶液处理过夜；将处理后的皮肤去除表皮，用生理盐水清洗；将获得的真皮用0.1-1mol/l ca
2+
的高渗盐溶液处理18-36h；弃去高渗溶液用生理盐水清洗；将清洗后的真皮置于脱细胞液中，处理3-5h；最后将脱细胞真皮用生理盐水清洗。
8.进一步的，所述脱细胞液包括以下成分：0.1-0.5％胰酶，0.5-1%sds。
9.进一步的，步骤b中，所述骨髓间充质干细胞的分离培养方法如下：在无菌条件下用含有肝素抗凝剂的干细胞培养基反复冲洗骨髓腔，收集骨髓悬液并用d-hanks液稀释，在离心管加入ficoll分离液，将稀释后的骨髓悬液缓慢加在ficoll分离液上，1500-2000 rpm/min离心10-20分钟，收集富含有核细胞的界面层细胞并用d-hanks液清洗，调整细胞浓度为 1
×
10
4-105/ml接种于的培养瓶，在37℃、5％co2、饱和湿度条件下静置培养。
10.进一步的，步骤b中，所述骨髓间充质干细胞的传代方法如下：细胞长至瓶底的 80%-90%进行传代，用无菌 pbs 冲洗细胞后加入 0.25%胰蛋白酶液，消化1-2min后终止消化，吹打悬浮细胞，收集悬液，1200-1500rpm/min离心5-8min，弃上清；采用完全培养基重悬细胞于培养瓶中，2-3 天传代一次。
11.一种上述骨髓间充质干细胞复合人脱细胞真皮的方法制备获得的组织工程皮肤。
12.一种上述的组织工程皮肤在修复皮肤缺损中的用途。
13.本发明获得了如下有益效果。
14.本发明的骨髓间充质干细胞复合人脱细胞真皮对皮肤缺损创面具有很好的促进愈合作用，尤其是对难愈性创面，如大面积深度烧伤，烧伤残余创面，压疮，骨质、肌腱缺损，肿瘤切除术后，慢性溃疡创面等也具有一定的促进愈合的作用，具有广阔的应用前景。
具体实施方式
15.以下参照实施例对本发明进行进一步的技术说明。
16.实施例1一种骨髓间充质干细胞与人脱细胞真皮的复合方法：包括以下步骤：a.将脱细胞真皮放入细胞培养板上，加入完全培养基浸泡18h，置于37℃培养箱中孵育 1h；b.将处于对数生长期的第3代骨髓间充质干细胞用 0.25％胰蛋白酶液消化，消化3min后终止消化，吹打悬浮细胞，收集悬液，1200rpm/min离心8min，弃上清；采用完全培养基重悬细胞，在37℃孵育 36h，1200rpm/min离心8min，弃上清，再次重悬细胞；c按细胞密度103/孔将步骤b中获得的骨髓间充质干细胞接种于含有脱细胞真皮的细胞培养板中，置于 37℃，5％c0
2 ，95％湿度的无菌培养箱中培养，每隔2天换液一次，观察细胞成活及生长情况。
17.步骤a中，脱细胞真皮的制备方法如下：人源真皮清洗消毒后，用低渗溶液反复浸泡清洗皮肤；将清洗后的皮肤用2mg/ml dispaseⅱ溶液处理过夜；将处理后的皮肤去除表皮，用生理盐水清洗；将获得的真皮用0.1mol/l ca
2+
的高渗盐溶液处理18h；弃去高渗溶液用生理盐水清洗；将清洗后的真皮置于脱细胞液中，处理3h；最后将脱细胞真皮用生理盐水清洗。
18.所述脱细胞液包括以下成分：0.1％胰酶，1%sds。
19.步骤b中，所述骨髓间充质干细胞的分离培养方法如下：在无菌条件下用含有肝素抗凝剂的干细胞培养基反复冲洗骨髓腔，收集骨髓悬液并用d-hanks液稀释，在离心管加入ficoll分离液，将稀释后的骨髓悬液缓慢加在ficoll分离液上，1500rpm/min离心20分钟，收集富含有核细胞的界面层细胞并用d-hanks液清洗，调整细胞浓度为 1
×
104/ml接种于的培养瓶，在37℃、5％co2、饱和湿度条件下静置培养。
20.步骤b中，所述骨髓间充质干细胞的传代方法如下：细胞长至瓶底的 80%进行传代，用无菌 pbs 冲洗细胞后加入 0.25%胰蛋白酶液，消化1min后终止消化，吹打悬浮细胞，收集悬液，1200rpm/min离心8min，弃上清；采用完全培养基重悬细胞于培养瓶中，2天传代一次。
21.实施例2一种骨髓间充质干细胞与人脱细胞真皮的复合方法：包括以下步骤：a.将脱细胞真皮放入细胞培养板上，加入完全培养基浸泡24h，置于37℃培养箱中孵育 2h；b.将处于对数生长期的第3代骨髓间充质干细胞用 0.25％胰蛋白酶液消化，消化5min后终止消化，吹打悬浮细胞，收集悬液，1500rpm/min离心5min，弃上清；采用完全培养基重悬细胞，在37℃孵育 60h，1500rpm/min离心5min，弃上清，再次重悬细胞；c按细胞密度105/孔将步骤b中获得的骨髓间充质干细胞接种于含有脱细胞真皮的细胞培养板中，置于 37℃，5％c0
2 ，95％湿度的无菌培养箱中培养，每隔3天换液一次，观察细胞成活及生长情况。
22.步骤a中，脱细胞真皮的制备方法如下：人源真皮清洗消毒后，用低渗溶液反复浸泡清洗皮肤；将清洗后的皮肤用3mg/ml dispaseⅱ溶液处理过夜；将处理后的皮肤去除表皮，用生理盐水清洗；将获得的真皮用1mol/l ca
2+
的高渗盐溶液处理36h；弃去高渗溶液用生理盐水清洗；将清洗后的真皮置于脱细胞液中，处理5h；最后将脱细胞真皮用生理盐水清洗。
23.所述脱细胞液包括以下成分：0.5％胰酶，0.5%sds。
24.步骤b中，所述骨髓间充质干细胞的分离培养方法如下：在无菌条件下用含有肝素抗凝剂的干细胞培养基反复冲洗骨髓腔，收集骨髓悬液并用d-hanks液稀释，在离心管加入ficoll分离液，将稀释后的骨髓悬液缓慢加在ficoll分离液上，2000 rpm/min离心10分钟，收集富含有核细胞的界面层细胞并用d-hanks液清洗，调整细胞浓度为 1
×
105/ml接种于的培养瓶，在37℃、5％co2、饱和湿度条件下静置培养。
25.步骤b中，所述骨髓间充质干细胞的传代方法如下：细胞长至瓶底的 90%进行传代，用无菌 pbs 冲洗细胞后加入 0.25%胰蛋白酶液，消化2min后终止消化，吹打悬浮细胞，收集悬液，1500rpm/min离心5min，弃上清；采用完全培养基重悬细胞于培养瓶中，3 天传代一次。
26.实施例3一种骨髓间充质干细胞与人脱细胞真皮的复合方法：包括以下步骤：a.将脱细胞真皮放入细胞培养板上，加入完全培养基浸泡20h，置于37℃培养箱中孵育1.5h；b.将处于对数生长期的第3代骨髓间充质干细胞用 0.25％胰蛋白酶液消化，消化4min后终止消化，吹打悬浮细胞，收集悬液，1300rpm/min离心6min，弃上清；采用完全培养基重悬细胞，在37℃孵育 48h，1300rpm/min离心6min，弃上清，再次重悬细胞；c按细胞密度104/孔将步骤b中获得的骨髓间充质干细胞接种于含有脱细胞真皮的细胞培养板中，置于 37℃，5％c0
2 ，95％湿度的无菌培养箱中培养，每隔2天换液一次，观察细胞成活及生长情况。
27.步骤a中，脱细胞真皮的制备方法如下：人源真皮清洗消毒后，用低渗溶液反复浸泡清洗皮肤；将清洗后的皮肤用2.5mg/ml dispaseⅱ溶液处理过夜；将处理后的皮肤去除表皮，用生理盐水清洗；将获得的真皮用0.5mol/l ca
2+
的高渗盐溶液处理24h；弃去高渗溶液用生理盐水清洗；将清洗后的真皮置于脱细胞液中，处理4h；最后将脱细胞真皮用生理盐水清洗。
28.所述脱细胞液包括以下成分：0.2％胰酶，0.8%sds。
29.步骤b中，所述骨髓间充质干细胞的分离培养方法如下：在无菌条件下用含有肝素抗凝剂的干细胞培养基反复冲洗骨髓腔，收集骨髓悬液并用d-hanks液稀释，在离心管加入ficoll分离液，将稀释后的骨髓悬液缓慢加在ficoll分离液上，1800 rpm/min离心12分钟，收集富含有核细胞的界面层细胞并用d-hanks液清洗，调整细胞浓度为 1
×
104/ml接种于的培养瓶，在37℃、5％co2、饱和湿度条件下静置培养。
30.步骤b中，所述骨髓间充质干细胞的传代方法如下：细胞长至瓶底的 85%进行传代，用无菌 pbs 冲洗细胞后加入 0.25%胰蛋白酶液，消化1.5min后终止消化，吹打悬浮细胞，收集悬液，1300rpm/min离心6min，弃上清；采用完全培养基重悬细胞于培养瓶中，3 天传代一次。
31.创面愈合实验在实验动物 sd大鼠的背部制作直径2cm的圆形创面，在创面处移植本发明实施例1-3制备的组织工程皮肤，记录创面愈合情况，计算创面闭合指数。实验结果参见表1。
32.表1