1.本发明属于生物技术领域，具体涉及一种灭活病毒溶毒仿生酶及其制备方法。
背景技术：
2.艾滋病，即获得性免疫缺陷综合征(acquired immunodeficiency syndrome，aids)，是由人类免疫缺陷病毒(human immunodeficiency virus，hiv，亦称艾滋病病毒)引起的一种致死率很高的恶性传染病。
3.hiv病毒是造成人类免疫系统缺陷的一种逆转录病毒。这一病毒会攻击并逐渐破坏人类的免疫系统，致使宿主在被感染时得不到保护。感染人类免疫缺陷病毒并且去世的人，往往死于继发感染或者癌症。人类免疫缺陷病毒可以分为两型：hiv-1和hiv-2，其中hiv-1和黑猩猩的免疫缺陷病毒(sivcpz)在基因组成方面十分接近，而hiv-2和乌色白眉猴的免疫缺陷病毒(sivsm)十分接近。hiv病毒直径约80-140nm，呈圆形或卵圆形。病毒外膜是类脂包膜，来自宿主细胞，并嵌有病毒的蛋白gp120与gp41。其中gp41是跨膜蛋白，gp120位于表面，与gp41通过非共价作用结合。向内是由蛋白p17形成的球形基质(matrix)，以及蛋白p24形成的半锥形衣壳(capsid)，衣壳在电镜下呈高电子密度。衣壳内含有病毒的rna基因组、酶(逆转录酶、整合酶、蛋白酶)以及其他来自宿主细胞的成分(如trnalys3，作为逆转录的引物)。
4.hiv病毒的基因组是两条相同的正链rna，全长约9.7千碱基对(kb)，包裹在一个病毒蛋白壳内，核衣壳外周是来源于宿主细胞膜的磷酸脂质双层，也包括病毒编码的膜蛋白。其基因组两端长末端重复序列发挥着调节病毒基因整合、表达和病毒复制的作用。基因组含有3个结构基因gag、pol和env，2个调节基因(tat反式激活因子、rev毒粒蛋白表达调节因子)，4个辅助基因(nef负调控因子、vpr病毒蛋白r、vpu病毒蛋白和vif病毒感染因子)。其中gag基因序列编码核壳蛋白；env基因序列编码病毒感染细胞所必须的两种糖蛋白，即包膜糖蛋白gp120和gp41；pol基因序列编码病毒复制所必须的酶，即逆转录酶、结合酶和病毒蛋白酶。其中，hiv-2和hiv-1核苷酸序列差异较大，仅有40-50％相同。但是二者的基因结构基本相同，只是hiv-2没有vpu基因，而存在vpx基因。
5.艾滋病于1981年首次被发现，到现在为止，仍是一种无法治愈的严重的慢性传染性疾病。虽然现有技术还不能从根本上治愈艾滋病，但却找到了有效控制艾滋病病毒传播途径的药物-采用“高效联合抗病毒疗法”控制病毒的生长，但是患者往往需要终生同时服用多种药物，这便导致了全球范围内抗艾滋病病毒药物需求的增长。除此之外，哈特疗法的发明给艾滋病患者带来了希望和光明，但其毒副作用大，价格昂贵，长期疗效尚无定论。防治艾滋病疫苗的研究也取得了很大的进展，但由于hiv的易变异性，至今抗hiv疫苗还难以用于临床。如专利cn201410558649.5公开了一种复制型痘苗病毒载体艾滋病疫苗，所述病毒包含编码hsv-tk和hiv抗原的多核苷酸，用于艾滋病的预防和治疗。专利cn200810049824.2则公开了一种治疗艾滋病无症状hiv感染期的中药片，以解决不适合抗病毒治疗的艾滋病无症状hiv感染期的治疗问题，包括西洋参、黄芪、白术、防风、女贞子、山
茱萸、南沙参、紫草、连翘、白花蛇舌草、甘草等。
6.因此，开发一种有效杀灭hiv病毒的组合物，对于艾滋病的传播、预防及治疗具有重要的意义。
技术实现要素：
7.发明目的：为了克服现有技术中存在的不足，本发明提供了一种灭活艾滋病病毒溶毒仿生酶及其制备方法。本发明所述的溶毒仿生酶具有较好的杀灭艾滋病病毒的效果，且安全性较高，对于艾滋病的传播、预防及治疗具有重要的意义。
8.技术方案：为实现上述目的，本发明的技术方案如下：
9.一方面，本发明提供了一种灭活艾滋病病毒溶毒仿生酶，所述的溶毒仿生酶包含：紫草、黄芪、铁皮石斛、绿茶、黄蜀葵花、菟丝子、壳聚糖、d-甘露糖醇、n-乙酰神经氨酸。
10.具体地，所述的溶毒仿生酶按重量份计包含：紫草100-200份、黄芪100-200份、铁皮石斛100-200份、绿茶50-150份、黄蜀葵花50-150份、菟丝子50-150份、壳聚糖5-50份、d-甘露糖醇1-20份、n-乙酰神经氨酸1-20份。
11.进一步具体地，所述的溶毒仿生酶按重量份计包含：紫草140-160份、黄芪140-160份、铁皮石斛140-160份、绿茶75-125份、黄蜀葵花75-125份、菟丝子75-125份、壳聚糖20-30份、d-甘露糖醇5-15份、n-乙酰神经氨酸5-15份。
12.具体地，所述的紫草、黄芪、铁皮石斛、绿茶、黄蜀葵花、菟丝子的重量比为1.2-2:1.2-2:1.2-2:1:1:1，优选为1.5:1.5:1.5:1:1:1。
13.具体地，所述的壳聚糖、d-甘露糖醇、n-乙酰神经氨酸的重量比为1.5-5:1:1，优选为2.5:1:1。
14.进一步具体地，所述的溶毒仿生酶按重量份计包含：紫草150份、黄芪150份、铁皮石斛150份、绿茶100份、黄蜀葵花100份、菟丝子100份、壳聚糖25份、d-甘露糖醇10份、n-乙酰神经氨酸10份。
15.另一方面，本发明提供了上述溶毒仿生酶的制备方法，所述的制备方法包括以下步骤：
16.(1)按照重量分数取紫草、黄芪、铁皮石斛、绿茶、黄蜀葵花、菟丝子置于粉碎机中粉碎充分，过筛，分别得到紫草粉、黄芪粉、铁皮石斛粉、绿茶粉、黄蜀葵花粉、菟丝子粉；
17.(2)对上述步骤(1)制备得到的紫草粉、黄芪粉、铁皮石斛粉、绿茶粉、黄蜀葵花粉、菟丝子粉采用乙醇加热回流提取制备得到紫草醇提物、黄芪醇提物、铁皮石斛醇提物、绿茶醇提物、黄蜀葵花醇提物、菟丝子醇提物；
18.(3)将上述步骤(2)制备得到的醇提物与壳聚糖、d-甘露糖醇、n-乙酰神经氨酸按照重量份混合，搅拌均匀，得到灭活艾滋病病毒溶毒仿生酶。
19.具体地，步骤(2)中所述的醇提物的制备方法为：将粉末用85-90％乙醇加热回流提取1-3次，减压回收溶剂得浸膏，将浸膏分散于蒸馏水中，用乙酸乙酯萃取2-4次，即得醇提物。
20.进一步具体地，步骤(2)中所述的醇提物的制备方法为：将粉末用85％乙醇加热回流提取3次，减压回收溶剂得浸膏，将浸膏分散于蒸馏水中，用乙酸乙酯萃取3次，即得醇提物。
21.又一方面，本发明提供了上述溶毒仿生酶在制备灭活艾滋病病毒药物中的应用。
22.有益效果：与现有技术相比，本发明的积极和有益效果在于：
23.本发明提供了一种灭活艾滋病病毒溶毒仿生酶及其制备方法，该灭活艾滋病病毒溶毒仿生酶中各个组分之间相互配伍、优化组合，通过调整紫草、黄芪、铁皮石斛、绿茶、黄蜀葵花、菟丝子的配比，以及壳聚糖、d-甘露糖醇、n-乙酰神经氨酸的配比，能够发挥明显的协同增效作用，具有显著的抗艾滋病病毒功效，且该溶毒仿生酶具有天然、安全、药效温和的优点，无毒副作用，制备方法简单、成本低，有助于大规模生产。
具体实施方式
24.下面结合具体实施例，对本发明作进一步详细的阐述，下述实施例不用于限制本发明，仅用于说明本发明。以下实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，下述实施例中所使用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
25.实施例中未注明具体技术或条件者，均按照本领域内的文献所描述的技术或条件(如参考j.萨姆布鲁克等著，黄培堂等译的《分子克隆实验指南》，第三版，科学出版社)或者按照产品说明书进行。下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法，下述实施例中所用的菌种、药品、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
26.本发明采取独立重复实验，均重复3次。实验数据采用spss18.0统计分析软件分析，计量资料以均数
±
标准差表示，两样本均数之间的比较，经正态性检验和方差齐性检验后，采用t或t'检验，p《0.05提示差异有统计学意义。
27.本发明所述的壳聚糖购自solarbio，货号为c8320；所述的d-甘露糖醇购自成都万象宏润生物科技有限公司，货号为3468089；所述的n-乙酰神经氨酸购自solarbio，货号为a8871。
28.实施例1
29.一种灭活艾滋病病毒溶毒仿生酶，所述的溶毒仿生酶包含：
30.紫草150份、黄芪150份、铁皮石斛150份、绿茶100份、黄蜀葵花100份、菟丝子100份、壳聚糖25份、d-甘露糖醇10份、n-乙酰神经氨酸10份。
31.上述溶毒仿生酶的制备方法，包括以下步骤：
32.(1)按照重量分数取紫草、黄芪、铁皮石斛、绿茶、黄蜀葵花、菟丝子置于粉碎机中粉碎充分，过筛，分别得到紫草粉、黄芪粉、铁皮石斛粉、绿茶粉、黄蜀葵花粉、菟丝子粉；
33.(2)对上述步骤(1)制备得到的紫草粉、黄芪粉、铁皮石斛粉、绿茶粉、黄蜀葵花粉、菟丝子粉采用乙醇加热回流提取制备得到紫草醇提物、黄芪醇提物、铁皮石斛醇提物、绿茶醇提物、黄蜀葵花醇提物、菟丝子醇提物，具体乙醇加热回流提取步骤为：将粉末用85％乙醇加热回流提取3次，减压回收溶剂得浸膏，将浸膏分散于蒸馏水中，用乙酸乙酯萃取3次，即得醇提物；
34.(3)将上述步骤(2)制备得到的醇提物与壳聚糖、d-甘露糖醇、n-乙酰神经氨酸按照重量份混合，搅拌均匀，得到灭活艾滋病病毒溶毒仿生酶。
35.实施例2
36.一种灭活艾滋病病毒溶毒仿生酶，所述的溶毒仿生酶包含：
37.紫草160份、黄芪160份、铁皮石斛160份、绿茶80份、黄蜀葵花80份、菟丝子80份、壳聚糖30份、d-甘露糖醇6份、n-乙酰神经氨酸6份。
38.上述溶毒仿生酶的制备方法，包括以下步骤：
39.(1)按照重量分数取紫草、黄芪、铁皮石斛、绿茶、黄蜀葵花、菟丝子置于粉碎机中粉碎充分，过筛，分别得到紫草粉、黄芪粉、铁皮石斛粉、绿茶粉、黄蜀葵花粉、菟丝子粉；
40.(2)对上述步骤(1)制备得到的紫草粉、黄芪粉、铁皮石斛粉、绿茶粉、黄蜀葵花粉、菟丝子粉采用乙醇加热回流提取制备得到紫草醇提物、黄芪醇提物、铁皮石斛醇提物、绿茶醇提物、黄蜀葵花醇提物、菟丝子醇提物，具体乙醇加热回流提取步骤为：将粉末用85％乙醇加热回流提取3次，减压回收溶剂得浸膏，将浸膏分散于蒸馏水中，用乙酸乙酯萃取3次，即得醇提物；
41.(3)将上述步骤(2)制备得到的醇提物与壳聚糖、d-甘露糖醇、n-乙酰神经氨酸按照重量份混合，搅拌均匀，得到灭活艾滋病病毒溶毒仿生酶。
42.实施例3
43.一种灭活艾滋病病毒溶毒仿生酶，所述的溶毒仿生酶包含：
44.紫草140份、黄芪140份、铁皮石斛140份、绿茶115份、黄蜀葵花115份、菟丝子115份、壳聚糖20份、d-甘露糖醇12份、n-乙酰神经氨酸12份。
45.上述溶毒仿生酶的制备方法，包括以下步骤：
46.(1)按照重量分数取紫草、黄芪、铁皮石斛、绿茶、黄蜀葵花、菟丝子置于粉碎机中粉碎充分，过筛，分别得到紫草粉、黄芪粉、铁皮石斛粉、绿茶粉、黄蜀葵花粉、菟丝子粉；
47.(2)对上述步骤(1)制备得到的紫草粉、黄芪粉、铁皮石斛粉、绿茶粉、黄蜀葵花粉、菟丝子粉采用乙醇加热回流提取制备得到紫草醇提物、黄芪醇提物、铁皮石斛醇提物、绿茶醇提物、黄蜀葵花醇提物、菟丝子醇提物，具体乙醇加热回流提取步骤为：将粉末用85％乙醇加热回流提取3次，减压回收溶剂得浸膏，将浸膏分散于蒸馏水中，用乙酸乙酯萃取3次，即得醇提物；
48.(3)将上述步骤(2)制备得到的醇提物与壳聚糖、d-甘露糖醇、n-乙酰神经氨酸按照重量份混合，搅拌均匀，得到灭活艾滋病病毒溶毒仿生酶。
49.实施例4
50.一种灭活艾滋病病毒溶毒仿生酶，所述的溶毒仿生酶包含：
51.紫草130份、黄芪130份、铁皮石斛130份、绿茶140份、黄蜀葵花140份、菟丝子140份、壳聚糖10份、d-甘露糖醇20份、n-乙酰神经氨酸20份。
52.上述溶毒仿生酶的制备方法，包括以下步骤：
53.(1)按照重量分数取紫草、黄芪、铁皮石斛、绿茶、黄蜀葵花、菟丝子置于粉碎机中粉碎充分，过筛，分别得到紫草粉、黄芪粉、铁皮石斛粉、绿茶粉、黄蜀葵花粉、菟丝子粉；
54.(2)对上述步骤(1)制备得到的紫草粉、黄芪粉、铁皮石斛粉、绿茶粉、黄蜀葵花粉、菟丝子粉采用乙醇加热回流提取制备得到紫草醇提物、黄芪醇提物、铁皮石斛醇提物、绿茶醇提物、黄蜀葵花醇提物、菟丝子醇提物，具体乙醇加热回流提取步骤为：将粉末用85％乙醇加热回流提取3次，减压回收溶剂得浸膏，将浸膏分散于蒸馏水中，用乙酸乙酯萃取3次，即得醇提物；
55.(3)将上述步骤(2)制备得到的醇提物与壳聚糖、d-甘露糖醇、n-乙酰神经氨酸按
照重量份混合，搅拌均匀，得到灭活艾滋病病毒溶毒仿生酶。
56.实施例5
57.一种灭活艾滋病病毒溶毒仿生酶，所述的溶毒仿生酶包含：
58.紫草170份、黄芪170份、铁皮石斛170份、绿茶70份、黄蜀葵花70份、菟丝子70份、壳聚糖40份、d-甘露糖醇1份、n-乙酰神经氨酸1份。
59.上述溶毒仿生酶的制备方法，包括以下步骤：
60.(1)按照重量分数取紫草、黄芪、铁皮石斛、绿茶、黄蜀葵花、菟丝子置于粉碎机中粉碎充分，过筛，分别得到紫草粉、黄芪粉、铁皮石斛粉、绿茶粉、黄蜀葵花粉、菟丝子粉；
61.(2)对上述步骤(1)制备得到的紫草粉、黄芪粉、铁皮石斛粉、绿茶粉、黄蜀葵花粉、菟丝子粉采用乙醇加热回流提取制备得到紫草醇提物、黄芪醇提物、铁皮石斛醇提物、绿茶醇提物、黄蜀葵花醇提物、菟丝子醇提物，具体乙醇加热回流提取步骤为：将粉末用85％乙醇加热回流提取3次，减压回收溶剂得浸膏，将浸膏分散于蒸馏水中，用乙酸乙酯萃取3次，即得醇提物；
62.(3)将上述步骤(2)制备得到的醇提物与壳聚糖、d-甘露糖醇、n-乙酰神经氨酸按照重量份混合，搅拌均匀，得到灭活艾滋病病毒溶毒仿生酶。
63.实施例6
64.一种灭活艾滋病病毒溶毒仿生酶，所述的溶毒仿生酶包含：
65.紫草160份、黄芪160份、铁皮石斛160份、绿茶75份、黄蜀葵花75份、菟丝子75份、壳聚糖30份、d-甘露糖醇5份、n-乙酰神经氨酸5份。
66.上述溶毒仿生酶的制备方法，包括以下步骤：
67.(1)按照重量分数取紫草、黄芪、铁皮石斛、绿茶、黄蜀葵花、菟丝子置于粉碎机中粉碎充分，过筛，分别得到紫草粉、黄芪粉、铁皮石斛粉、绿茶粉、黄蜀葵花粉、菟丝子粉；
68.(2)对上述步骤(1)制备得到的紫草粉、黄芪粉、铁皮石斛粉、绿茶粉、黄蜀葵花粉、菟丝子粉采用乙醇加热回流提取制备得到紫草醇提物、黄芪醇提物、铁皮石斛醇提物、绿茶醇提物、黄蜀葵花醇提物、菟丝子醇提物，具体乙醇加热回流提取步骤为：将粉末用85％乙醇加热回流提取3次，减压回收溶剂得浸膏，将浸膏分散于蒸馏水中，用乙酸乙酯萃取3次，即得醇提物；
69.(3)将上述步骤(2)制备得到的醇提物与壳聚糖、d-甘露糖醇、n-乙酰神经氨酸按照重量份混合，搅拌均匀，得到灭活艾滋病病毒溶毒仿生酶。
70.实验例1.细胞毒性测试
71.1、实验方法
72.具体实验步骤如下：
73.(1)按1
×
105个/孔的浓度，将人胚胎肾细胞293(hek293细胞)接种到96孔板，加入100μl dmem培养基，37℃、5％co2培养至单层细胞形成；
74.(2)弃培养液，pbs清洗2次，将本发明实施例1-6制备得到的溶毒仿生酶用dmem进行梯度稀释，接种于细胞上，100μl/孔，每个浓度4个以上复孔，设相同浓度对照组，37℃、5％co2培养48h；
75.(3)每孔加入20μl mtt溶液(2.5mg/ml)，37℃、5％co2孵育4h；弃上清，加入120μl dmso/孔，振荡20min；
76.(4)在多功能读数仪上测定各孔490nm波长的吸光值(od)，并用reed-muench法计算50％毒性浓度为药物半数有毒浓度(tc
50
)。
77.2、实验结果
78.检测结果如下表1所示。
79.表1细胞毒性检测结果
80.组别tc
50
(μg/ml)实施例1150.22实施例2149.37实施例3148.98实施例4144.93实施例5143.25实施例6145.39
81.由表1可知，本发明制备得到的溶毒仿生酶无细胞毒性。
82.实验例2.抗病毒性能测试
83.1、实验方法
84.具体实验步骤如下：
85.(1)将hek293细胞按4.5
×
104个细胞/孔浓度加入96孔板，在含1％胎牛血清的dmem的条件下，37℃、5％co2培养24h；
86.(2)弃上清，每孔分别加入100tcid
50
艾滋病病毒液，37℃、5％co2吸附2h；
87.(3)弃上清并用pbs洗涤细胞，将本发明实施例1-6制备得到的溶毒仿生酶用dmem进行梯度稀释，分别加入孔板中，设置为实验组，空白对照组加入等量dmem，37℃、5％co2孵育72h，收集病毒上清；
88.(4)将hek293细胞按2
×
106个细胞/孔，接种到12孔板，37℃、5％co2培养24h；
89.(5)将步骤(3)收集的病毒上清进行10倍梯度稀释，接种至hek293细胞，37℃、5％co2吸附2h；
90.(6)弃上清并用pbs洗涤细胞，加入2ml 1％(w/v)甲基纤维素-dmem覆盖物，37℃、5％co2培养72h；
91.(7)除去甲基纤维素-dmem覆盖物，pbs洗涤细胞2次，10％甲醛室温固定细胞30min；
92.(8)弃上清，pbs洗涤细胞2次，加入0.5％结晶紫室温染色5min，用去离子水洗2次，干燥后空斑计数，并用reed-muench法计算50％病毒被抑制的药物浓度为药物的半数抑制浓度(ic50)。
93.2、实验结果
94.检测结果如下表2所示。
95.表2抗病毒性能检测结果
96.组别ic
50
(μg/ml)实施例18.36实施例28.45实施例38.41
实施例412.56实施例512.79实施例610.37
97.由表2可知，本发明制备得到的溶毒仿生酶具有较好的抗艾滋病病毒的活性。
98.以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出：对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。