用于改善免疫应答的母乳低聚糖组合物及其应用的制作方法

1.本发明是关于一种用于改善免疫应答的母乳低聚糖组合物及其应用，具体地说，是关于一种包括2
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岩藻糖基乳糖、乳糖-n-四糖与3
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唾液酸基乳糖的母乳低聚糖组合物在制备用于改善免疫应答的组合物中的应用。


背景技术：

2.人体的免疫机能分为先天免疫和适应性免疫。单核-巨噬细胞系统(mononuclear phagocyte system，mps)是天然免疫系统的主要组成部分，在机体抵御外源微生物入侵和清除病原体等方面起着重要作用。单核-巨噬细胞系统包括血液中的单核细胞和组织中固定或游走的巨噬细胞，其中单核细胞作为免疫效应细胞，在机体受外源入侵时从血液迁移至组织中并产生大量的炎症因子；同时其本身具有吞噬功能，能吞噬细胞和有害分子；此外，单核细胞还可分化成树状细胞或巨噬细胞进一步发挥免疫功能。巨噬细胞具有多方面的生物功能，其在天然免疫和适应性免疫的功能主要包括以下几个方面：非特异性免疫防疫，即在机体受到外来病原体入侵激发免疫应答前吞噬清除病原体；清除外来细胞；非特异性免疫监视；递呈抗原；分泌介质il-1、干扰素及补体(c1，c4，c3，c2，b3因子)等细胞因子。此外巨噬细胞在组织发育、修护和维持机体稳定等方面也有重要功能。
3.由于单核巨噬细胞系统在机体功能的重要性，使得单核细胞分化成巨噬细胞这一过程尤为重要。巨噬细胞分化的紊乱会导致多种疾病的发生，比如炎症反应，自身免疫性疾病和白血病等。
4.人体肠道中存在大量的巨噬细胞，这些巨噬细胞主要由单核细胞分化而成，且迭代速度很快，它们能产生肿瘤坏死因子-α(tnf-α)和许多其他的促炎症因子，对于维持肠道健康可能有重要的作用。tnf-α是一种涉及到系统性炎症的细胞因子，同时也是属于引起急相反应的众多细胞因子中的一员，主要由巨噬细胞分泌。tnf-α生产的失调被认为与许多人类疾病有关，包括阿兹海默氏症、癌症、重性抑郁障碍和肠炎等。
5.小肠上皮细胞形成了对致病菌的第一道抵御防线。致病菌吸附在小肠上皮细胞，或随之侵入，都会给上皮细胞提供信号，并进一步激发其产生细胞因子或趋化因子。这些是可溶性调节物质，能吸引免疫系统的细胞，或激活单核巨噬细胞系统并启动免疫应答。适宜的免疫应答可保护机体免受感染。
6.因此，需要有维持单核细胞向巨噬细胞分化后正常免疫应答机能以促进肠道健康的解决方案。


技术实现要素：

7.本发明发现一些母乳低聚糖组合物具有可改善免疫应答以促进肠道健康的作用。
8.具体而言，一方面，本发明提供了一种母乳低聚糖组合物在制备用于改善免疫应答的组合物中的应用，其中，所述母乳低聚糖组合物包括2
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岩藻糖基乳糖、乳糖-n-四糖与3
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唾液酸基乳糖。
[0009]2’‑
岩藻糖基乳糖(2
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fucosyllactose，2
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fl或2-fl或2fl)，为岩藻糖与乳糖形成的三糖结构，是岩藻糖基类低聚糖的代表性物质。市售该物质通常为经微生物发酵法制备，与人乳中发现的2
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岩藻糖基乳糖具有相同结构。
[0010]
乳糖-n-四糖，为乳糖与四糖形成的六糖结构，是以核心糖链为基础结构，且不含岩藻糖基或唾液酸基的低聚糖的代表性物质。现有技术中的乳糖-n-四糖商品，多是经微生物发酵法制备，与人乳中发现的乳糖-n-四糖寡糖具有相同结构。
[0011]3’‑
唾液酸基乳糖(3
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sialyllactose，3
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sl或3-sl或3sl)，为唾液酸与乳糖形成的三糖结构，是唾液酸基类低聚糖的代表性物质。现有技术中的3
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唾液酸基乳糖商品，多是经微生物发酵法制备，与人乳中发现的3
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唾液酸基乳糖具有相同结构。
[0012]
根据本发明的具体实施方案，本发明的母乳低聚糖组合物的应用中，所述用于改善免疫应答的组合物为食品组合物或药品组合物，其是用于改善单核细胞分化为巨噬细胞的免疫应答活性。在本发明的一些具体实施方案中，所述改善单核细胞分化为巨噬细胞的免疫应答活性，是指提升单核细胞分化为巨噬细胞后应对刺激时的免疫应答活性，或是预防单核细胞受训分化为巨噬细胞后免疫应答活性的下降。特别是在人体肠道中，菌群代谢紊乱会产生异常浓度的脂多糖等毒素，本发明的母乳低聚糖组合物可提升巨噬细胞应对这些毒素刺激的免疫应答活性。此外，单核细胞如果经过一些肠道毒素的刺激(即受训条件)，再分化为巨噬细胞后其免疫应答活性会降低，而本发明的母乳低聚糖组合物可预防免疫应答活性的降低，甚至进一步提升免疫应答活性。
[0013]
根据本发明的一些具体实施方案，本发明中通过检测单核细胞分化成巨噬细胞后分泌tnf-α的量来表征免疫应答活性。实验证明，本发明的母乳低聚糖组合物，可提升单核细胞分化为巨噬细胞后应对刺激(例如脂多糖刺激)时分泌tnf-α的量。
[0014]
根据本发明的具体实施方案，本发明的母乳低聚糖组合物的应用，所述母乳低聚糖组合物中，2
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岩藻糖基乳糖、乳糖-n-四糖与3
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唾液酸基乳糖的质量比为3～5：1.5～2.5：1。
[0015]
根据本发明的优选具体实施方案，本发明的母乳低聚糖组合物的应用，所述母乳低聚糖组合物中，2
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岩藻糖基乳糖、乳糖-n-四糖与3
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唾液酸基乳糖的质量比为4：2：1。
[0016]
另一方面，本发明还提供了一种母乳低聚糖组合物，其包括质量比3～5：1.5～2.5：1优选4：2：1的2
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岩藻糖基乳糖、乳糖-n-四糖与3
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唾液酸基乳糖。所述的母乳低聚糖组合物可用于改善免疫应答。
[0017]
在本发明一些具体实施方案中，本发明还提供了一种食品或药品，其中包括母乳低聚糖2
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岩藻糖基乳糖、乳糖-n-四糖与3
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唾液酸基乳糖，所述2
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岩藻糖基乳糖、乳糖-n-四糖与3
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唾液酸基乳糖的质量比为3～5：1.5～2.5：1。
[0018]
根据本发明的具体实施方案，本发明中，所述食品包括营养补充剂、乳粉、液态奶、辅食中的一种或多种。其中所述乳粉可以是婴幼儿配方粉(婴幼儿配方食品)，也可以是非婴幼儿乳粉例如儿童用乳粉或是成年人(包括中老年人)用乳粉。
[0019]
在本发明的一些具体实施方案中，所述的食品为婴幼儿配方粉或婴幼儿液态奶。
[0020]
根据本发明的一些具体实施方案，本发明中，所述食品为婴儿配方粉。
[0021]
根据本发明的一些具体实施方案，本发明中，2
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岩藻糖基乳糖在食品中的应用量为：在乳粉中的应用量为14.2-3182.2mg/100g粉，或以换算成奶液计为0.02-4.2g/l。另，乳
糖-n-四糖与3
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唾液酸基乳糖的量参照前述比例应用。
[0022]
根据本发明的一些具体实施方案，本发明中，2
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岩藻糖基乳糖在食品中的应用量为：在乳粉中的应用量为70.9-1818.4mg/100g粉，或以换算成奶液为0.1-2.4g/l。
[0023]
根据本发明的一些具体实施方案，本发明中，2
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岩藻糖基乳糖在食品中的应用量为：在乳粉中的应用量为70.9-1515.3mg/100g粉，或以换算成奶液计为0.1-2.0g/l。
[0024]
各母乳低聚糖在其他食品中的应用量可根据具体需要进行适当调整。
[0025]
根据本发明的具体实施方案，本发明中所述食品或药品还可包括所属领域中的常规用料组分。例如，对于药品，可包括适量的辅料，所述辅料可以为赋型剂、稀释剂、填充剂和/或吸收促进剂等。所述食品或药品可根据受施予者的需要，而采用不同形态。例如粉剂、锭剂、造粒、微胶囊和/或液体制剂等。
[0026]
另一方面，本发明还提供了一种改善免疫应答的方法，该方法包括：使本发明的母乳低聚糖组合物与单核细胞接触，从而使得单核细胞分化为巨噬细胞后其免疫应答活性提升。在本发明的一些实施方案中，所述母乳低聚糖组合物与单核细胞接触时间为至少12小时，优选至少24小时。在本发明的一些实施方案中，给予个体有效量的所述母乳低聚糖组合物，使得所述母乳低聚糖组合物在个体体内(例如肠道内)与单核细胞接触时浓度至少为0.02mg/ml，优选至少为0.05mg/ml，更优选至少为0.1mg/ml。
[0027]
综上所述，本发明发现2
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岩藻糖基乳糖、乳糖-n-四糖与3
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唾液酸基乳糖的组合物可用于改善单核细胞分化为巨噬细胞的免疫应答活性，能提升单核细胞分化为巨噬细胞后的免疫应答活性，预防单核细胞受训分化为巨噬细胞后免疫应答活性的下降，可用于添加在食品中，有利于改善个体免疫应答。
附图说明
[0028]
图1显示本发明的母乳低聚糖对单核细胞分化巨噬细胞的免疫应答的效果。
具体实施方式
[0029]
为了对本发明的技术特征、目的和有益效果有更加清楚的理解，现结合具体实施例及对本发明的技术方案进行以下详细说明，应理解这些实例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。实施例中，各原始试剂材料均可商购获得，未注明具体条件的实验方法为所属领域熟知的常规方法和常规条件，或按照仪器制造商所建议的条件。
[0030]
实施例1、hmo对单核细胞分化为巨噬细胞免疫应答活性的影响
[0031]
本实施例通过驯化与激活单核细胞考察了hmo对单核细胞分化为巨噬细胞免疫应答活性的影响。
[0032]
单核细胞的采集与培养
[0033]
具体血样采集与培养的实验条件如下所述：
[0034]
使用生产商推荐的操作方法，采用quadromacs系统和cd14 microbeads磁珠分选试剂盒(miltenyi biotec，莱顿，荷兰)，从多名健康的成年捐献者血样中分离获得单核细胞。采集血样前，获得了捐献者的书面同意。
[0035]
单核细胞的培养：在添加了10％胎牛血清(fbs，hyclone，埃因霍温，荷兰)，1％mem非必需氨基酸(gibco布雷斯维克，荷兰)，1％丙酮酸钠(lonza，布雷达，荷兰)，1％青霉素/
链霉素(sigma，圣路易斯，密苏里州，美国)的rpmi 1640
–
glutamax培养基(gibco，布雷斯维克，荷兰)中，以1
×
106细胞/2ml/孔的浓度在24孔板培养。
[0036]
免疫应答活性考察实验包括了预处理单核细胞以及6天后进行的免疫应答挑战测试。具体操作如下：
[0037]
单核细胞从液氮中恢复，在恢复1天后，分别进行以下组别的实验，且本实验中所有hmo原料均来自于jennewein：
[0038]
hmo组：将不同hmo受试样品(不同hmo单体或不同比例的hmo组合物，其中hmo组合物中各单体比例以质量比计)添加到单核细胞培养基中，添加终浓度为0.1mg/ml，与单核细胞共同培养24小时，之后更换新鲜的培养基(冲洗掉受试hmo)继续培养6天，以使单核细胞分化为巨噬细胞。然后，添加脂多糖(脂多糖在培养基中的终浓度10ng/ml)刺激24小时，再从上清液中测定分泌的tnf-α情况。
[0039]
对照组1(脂多糖组)：采用脂多糖对单核细胞进行预处理，即，将脂多糖添加到单核细胞培养基中，添加终浓度为0.1mg/ml，与单核细胞共同培养24小时，之后更换新鲜的培养基(冲洗掉lps)继续培养6天，以使单核细胞分化为巨噬细胞。然后，添加脂多糖(脂多糖在培养基中的终浓度10ng/ml)刺激24小时，再从上清液中测定分泌的tnf-α情况。该对照组前期脂多糖预处理的目的是使单核细胞对后续的再度刺激做出响应的能力下降，预期脂多糖可降低单核细胞对于第二次脂多糖刺激的响应情况。
[0040]
对照组2(培养基组)：单核细胞在未添加任何受试物质的培养基中培养7天，以使单核细胞分化为巨噬细胞。然后，添加脂多糖(脂多糖在培养基中的终浓度10ng/ml)刺激24小时，再从上清液中测定分泌的tnf-α情况。实验方法参考了bekkering等人(2016，clinical and vaccine immunology)报道的方法，使用elisa(酶联免疫吸附测定)和tnf-α专用试剂盒测定tnf-α，且elisa测定的波长为450nm，使用plate reader spark装置进行吸收值测定，spark的序列号为2009003477，sparkcontrol应用的序列号为v3.1。
[0041]
数据分析
[0042]
用one way anova对巨噬细胞免疫应答数据进行统计分析。两个组若有显著性差异，且p《0.05，则用星号*表示。两个星号**表示p《0.01。三个星号***表示p《0.001。
[0043]
实验结果
[0044]
实验结果请参见图1。质量比为4：2：1的2
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fl：lnt：3
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sl母乳低聚糖组合物的组别，在单核细胞受训模型中，显示出了对于tnf-α分泌量的显著提升作用(p《0.05)。
[0045]
此外，如实验预期，脂多糖组别的测试结果显示，脂多糖降低了免疫响应，可见相比不含任何受试物质的培养基组，脂多糖组降低效果很显著。
[0046]
本实施例证明，本发明的包括特定比例的2
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岩藻糖基乳糖、乳糖-n-四糖与3
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唾液酸基乳糖的母乳低聚糖组合物对于改善单核细胞分化为巨噬细胞的免疫应答活性有显著效果，体现了该组合物的协同效应。
[0047]
实施例2、添加的母乳低聚糖组合的婴儿配方粉
[0048]
本实施例提供一种0～6月龄的婴儿配方奶粉，该配方奶粉中总蛋白质含量为11.1g/100g粉，脂肪含量为28.3g/100g粉，碳水化合物含量为52.9g/100g粉，母乳低聚糖含量1.8g/100g粉，其中，母乳低聚糖为2
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岩藻糖基乳糖(2
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fl)、乳糖-n-四糖(lnt)与3
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唾液酸基乳糖(3
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sl)的组合，其中2
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岩藻糖基乳糖(2
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fl)、乳糖-n-四糖(lnt)与3
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唾液
酸基乳糖(3
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sl)的质量比为4：2：1。