一种Mn基可降解MOF纳米反应器及其制备方法和应用

一种mn基可降解mof纳米反应器及其制备方法和应用
技术领域
1.本发明涉生物医药技术领域，特别涉及一种mn基可降解mof纳米反应器及其制备方法和应用。


背景技术：

2.肿瘤恶性增殖严重危害人类健康，而免疫治疗能恢复机体的抗肿瘤免疫应答，高效杀伤肿瘤，具有潜在的临床应用前景。如以抑制免疫检查点(如吲哚胺2,3-双加氧酶，ido)为代表的免疫治疗，能显著抑制机体免疫耐受并恢复多种效应t细胞活性，前期临床效果显著。然而，不充分的免疫响应和低生物利用度是影响了它的临床应用。再比如葡萄糖氧化酶(gox)介导的肿瘤饥饿治疗不仅能竞争性的消耗其生长必需的葡萄糖，还能产生活性氧(ros)。饥饿/氧化协同诱导肿瘤免疫原性死亡，能有效启动及增强免疫应答，但该策略同样受限于生物利用度低。因此，如何安全高效的将此类小分子递送至肿瘤病灶，调控肿瘤饥饿/氧化/ido免疫联合治疗，实现高效的免疫应答和提高肿瘤治疗效果，具有重要的科学意义和潜在的应用前景。
3.考虑到gox和1-mt存在稳定性差和易失活等缺点，具有高保真酶活性的金属有机框架聚合物(mof)纳米反应器的开发为保持上述分子的生物活性提供了保障。但是，gox和1-mt的理化性质和作用机理差异较大，想要既安全高效地克服复杂的体内递送屏障(如血液屏障、肿瘤组织屏障、细胞摄取屏障等)，提高药物生物利用度，又要在肿瘤病灶处响应性地释放负载药物，激活肿瘤饥饿/氧化/ido免疫联合治疗，就需要对mof纳米反应器进行必要的功能化修饰，使其具有肿瘤渗透、可控释放及体内可降解的特性，从而实现高效的肿瘤杀伤。基于此，本发明构建了具有增强肿瘤渗透和自放大药物释放特性的ph/ros双响应的可降解mn基mof纳米反应器，共负载gox及1-mt，联合饥饿/氧化及免疫治疗策略，有效杀伤肿瘤并抑制肿瘤生长及转移，为功能性mof控释系统的构建及饥饿/氧化/ido免疫联合治疗提供科学依据及实践参考。


技术实现要素：

4.本发明所要解决的技术问题是提供一种mn基可降解mof纳米反应器及其制备方法和应用，该体系能高保真性负载生物酶及免疫治疗药物，并且程序性的克服体内诸多生理屏障，提高药物递送效率和生物利用度，有助于递送系统联合饥饿/氧化治疗及肿瘤免疫治疗，高效杀伤肿瘤并抑制肿瘤生长及转移。
5.本发明所要解决的技术问题是通过以下技术方案来实现的：
6.一种mn基可降解mof纳米反应器，包括内核mn基mof纳米颗粒，所述mn基mof纳米颗粒表面功能化接枝ph响应性外壳共聚物peg-cdm-pei，所述mn基mof纳米颗粒内装载有生物酶gox和ido免疫抑制剂。
7.优选地，所述mn基mof纳米颗粒为mn-dta，所述ido免疫抑制剂为1-mt。
8.优选地，所述纳米反应器为球形，且粒径为100nm。
9.一种mn基可降解mof纳米反应器的制备方法，包括以下步骤：
10.(1)制备内核mn基mof纳米颗粒mn-dta：
11.(2)合成ph响应性的外壳peg-cdm-pei；
12.(3)peg-cdm-pei-mn-dta颗粒的制备；
13.(4)pcp-mn-dta@gox@1-mt控释系统的制备。
14.优选地，步骤(1)包括：
15.11)合成ros响应性有机配体5，5-二甲基-4，6-二硫代壬二酸(dta)：将3-巯基丙酸(mpa)溶解于丙酮溶液中，室温连续搅拌；将上述混合体系放置在冰浴中过夜结晶；过滤，收集结晶；将滤液晶体用正己烷和冷水反复洗涤，真空干燥后，制得dta；
16.12)通过水热反应合成ros敏感的内核mn基mof纳米颗粒mn-dta：将氯化锰(mncl2)和dta分别溶解在n，n-二甲基甲酰胺(dmf)中；在离心管中加入上述溶液，并向其中加入聚乙烯吡咯烷酮k 30(pvp-k30)和三乙胺；将配置好的dmf/乙醇溶剂加入管中，其中dmf/乙醇的体积比为5/3，定容至一定体积；将混合物超声分散，转移至水热合成反应器中，高温反应；待自然冷却至室温后，通过离心收集产物，然后分散在乙醇中待用；将获得的mof纳米颗粒命名为mn-dta。
17.优选地，步骤(2)包括：
18.21)合成peg-cdm：先将顺乌头酸酐(cdm)与草酰氯反应，真空干燥得酰氯化cdm；接下来把产物加入到溶解有聚乙二醇单甲醚(mpeg-oh)和吡啶的二氯甲烷(dcm)溶液中，室温反应；随后，利用饱和的氯化铵溶液终止反应。通过有机相萃取、分离、干燥，冰浴沉淀2-3次，得到peg-cdm；
19.22)合成peg-cdm-pei：将peg-cdm和支链聚乙烯亚胺(pei)溶解在dmso中，逐滴加入4-二甲氨基吡啶(dmap)，0℃下搅拌0.5h，随后将该体系置于室温，避光继续反应；将该混合物用双蒸水透析，冷冻干燥，得到终产物peg-cdm-pei。
20.优选地，步骤(3)具体为：
21.将步骤(2)得到的mn-dta，1-乙基-3-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺盐酸盐edc
·
hcl(6mm)和nhs(6mm)溶解在pbs(ph 7.4)中，室温搅拌；随后将分散在pbs(ph7.4)中的peg-cdm-pei(0.06mmol)加入上述溶液，继续反应36h；通过离心收集产物(peg-cdm-pei-mn-dta，记为pcp-mn-dta)。
22.优选地，步骤(4)具体为：
23.将mn-dta，gox和1-mt溶于pbs(ph 7.4)中，室温搅拌反应24h；离心去除未装载的药物；然后将混合体系重悬于由edc
·
hcl(15mm)和nhs(15mm)组成的ph 7.4的pbs(ph 7.4)溶液中；参考pcp-mn-dta纳米颗粒的合成方法，离心收集负载药物的纳米反应控释系统，冷冻干燥得到终产物，记为pcp-mn-dta@gox@1-mt。
24.一种mn基可降解mof纳米反应器在制备功能给药体系用于肿瘤饥饿、氧化或免疫联合治疗中的应用。
25.本技术的原理在于：
26.本发明利用水热合成法，将n,n-二甲基甲酰胺，乙醇等还原性溶剂、有机配体5，5-二甲基-4，6-二硫代壬二酸以及mncl2混合加入聚四氟乙烯的反应釜中，合成mof纳米颗粒内核。随后，合成ph响应性可脱落的外壳共聚物peg-cdm-pei，化学接枝于mof内核颗粒表面
并负载药物分子，制备mn基mof纳米反应器控释系统。本发明制备得到的mn基mof控释体系集成高药物装载量、易表面修饰、ph响应性尺寸减小及电荷反转、以及ros响应性可降解等优点，易于制备与保存，并在生物酶和药物递送及肿瘤治疗方面有潜在的应用。
27.该体系能安全高效负载葡萄糖氧化酶gox和免疫佐剂1-mt，借助epr效应靶向肿瘤病灶。随后，响应肿瘤微环境低ph刺激，断裂ph敏感键桥连的cdm分子，快速脱落外壳peg聚合物，暴露表面残留有pei修饰的mof内核载体，实现载体尺寸减小和电荷反转，小尺寸载体(mn基mof内核尺寸约50nm)更容易渗透到肿瘤深处，正电荷特性材料选择性被肿瘤细胞高效摄取，进而克服体内生理屏障，提高体内药物递送效率。更为重要的是，该体系被肿瘤细胞摄取后，能进一步响应肿瘤胞内高水平的ros，原位降解mof并释放负载药物。一方面，释放的gox能竞争性消耗肿瘤内的葡萄糖，造成肿瘤饥饿，不仅能杀伤肿瘤细胞，提高肿瘤免疫原性，招募大量免疫细胞侵袭到肿瘤病灶，还能同步产生ros，级联放大mof的降解和促进药物释放。另一方面，释放的1-mt抑制免疫检查点ido活性，恢复t细胞活性，从而解除免疫耐受。mof控释系统通过联合gox调控的肿瘤饥饿/氧化治疗和1-mt调控的免疫治疗，不仅有效解除体内免疫耐受，还高效增强机体抗肿瘤免疫应答，协同提高肿瘤治疗效果，具有良好的生物安全性和临床潜在医用前景。
28.本发明上述技术方案，具有如下有益效果：
29.(1)本发明通过ros敏感键和mn
2+
共价交联合成了一类mn基可降解mof纳米反应器，它可以响应肿瘤细胞内过表达的ros，快速降解并原位释放负载药物，具有良好的生物安全性；(2)本发明制备的纳米反应器表面功能化有peg-cdm-pei外壳，会避免非特异性吸附并延长血液循环时间，克服血液循环屏障；该控释系统还具有ph响应性尺寸减小及电荷反转特性，能克服肿瘤渗透和细胞摄取屏障，提高递送效率；此外，该体系还具有ros响应性可降解性能，能响应肿瘤胞内高浓度的ros，原位降解并释放负载药物，进一步提高药物生物利用度；(3)本发明制备的pcp-mn-dta@gox@1-mt纳米控释系统可通过饥饿/氧化/免疫联合治疗增强体内免疫应答。一方面，gox介导的饥饿/氧化疗法促进效应t细胞募集和免疫响应；另一方面，1-mt介导的ido阻断免疫疗法解除免疫耐受，二者联合级联放大机体抗肿瘤免疫应答，从而高效杀伤肿瘤；(4)本发明制备的pcp-mn-dta@gox@1-mt纳米控释系统成功激活了机体免疫记忆，抑制肿瘤转移复发，具有长效的免疫记忆功能。
附图说明
30.图1是本发明中mn-dta的xrd表征图：其中，a是mn-dta-mof的xrd图谱(mns，jcpds no.89-4089)；b是通过ccdc数据库(icsd条目：44765)计算的mns的晶胞结构；c和d是晶体结构(3
×
3)；e是mn-dta-mof的组合和晶体形态示意图，紫色和黄色的球分别代表mn和s原子。
31.图2是本发明中的产物的透射电镜和粒径分布图：其中，a和b分别是mn-dta的tem图像和eds图：黄色代表mn元素，蓝色代表s元素，绿色代表o元素；c是pcp-mn-dta@gox@1-mt的tem图像；d是mn-dta和pcp-mn-dta@gox@1-mt的dls图，a和b标尺：50nm，c标尺：100nm。
32.图3是本发明中mn-dta的n2吸收-解吸图：其中，a是等温线图，b是相应的bjh孔径分布图。
33.图4是本发明中的产物的核磁、凝胶渗透色谱和红外光谱图：其中，a、b、c分别是dta、peg-cdm、peg-cdm-pei的核磁谱图；d是peg-cdm-pei的凝胶渗透色谱图，e中a和b分别
是peg-cdm和peg-cdm-pei的红外光谱图。
34.图5是本发明中的产物在不同条件下的dls图&zeta图&tem图&uv图：其中，a是pcp-mn-dta@gox@1-mt在ph 7.4、ph 6.8、ph 7.4+h2o2和ph 6.8+h2o2处理4h后和mn-dta的dls图；b是mn-dta和pcp-mn-dta纳米颗粒分别在ph 7.4和ph 6.8时的zeta电位值；c和d分别是用h2o2处理4h的mn-dta和pcp-mn-dta@gox@1-mt的tem图像，e是gox、1-mt和pcp-mn-dta@gox@1-mt在含不同浓度的h2o2或葡萄糖中孵育12h的吸收光谱，f是用不同浓度的h2o2或葡萄糖处理后，pcp-mn-dta@gox@1-mt体系的gox累积释放水平；c标尺：50nm，d标尺：100nm。
35.图6是细胞活性及胞内ros检测图：其中，a是本发明的pcp-mn-dta@gox@1-mt控释系统的细胞活性图；b是胞内ros检测的clsm图；c是荧光定量统计图；b的比例尺为100μm。
36.图7是本发明的pcp-mn-dta@gox@1-mt控释系统的体外肿瘤渗透图：其中，a是肿瘤多细胞球与该体系在ph 7.4和ph 6.8的条件下分别孵育4h和12h的clsm图，b是荧光量化统计；a比例尺：100μm。
37.图8是本发明的mof控释体系在不同ph条件下的肿瘤细胞摄取效率m分析图：其中，a是b16f10细胞与pcp-mn-dta@gox@1-mt控释系统分别在ph 7.4和ph 6.8条件下孵育4h和12h后的clsm图像，细胞核和细胞骨架分别用dapi(蓝色)和actinred
tm
555(红色)染色；b是在上述处理条件下，fcm对应的量化统计分析；a的比例尺：50μm。
38.图9是本发明用不同纳米颗粒处理诱导的b16f10细胞凋亡相关蛋白的蛋白印迹图：其中，a为蛋白印迹图，b和c为蛋白水平的量化统计分析图，c和d是不同纳米颗粒处理b16f10细胞后利用annexin v-fitc/pi染色进行细胞凋亡的流式细胞术分析图和定量析图。
39.图10为本发明的mof控释体系体外抑制ido表达及促进t细胞增殖分析图：其中，a是用不同纳米颗粒处理诱导的b16f10细胞的ido蛋白印迹图；b为ido蛋白的定量分析图；c是不同纳米颗粒与b16f10细胞共培养处理后，用fcm分析edu
+ t细胞的比例图(未经b16f10细胞处理的t细胞作为阳性对照)；d为edu
+ t细胞的定量分析图，e是pcp-mn-dta@gox@1-mt控释系统在肿瘤细胞中对ido1的抑制机制的示意图。
40.图11为本发明的mof控释体系体外抑制肿瘤细胞增殖、转移及侵袭分析图：其中，a是不同药物孵育后，b16f10细胞划痕愈合的显微镜图像；b是划痕愈合的定量分析图，c和d是迁移和侵袭试验的定量分析图；a的比例尺：100μm。
41.图12为本发明的mof控释体系体内治疗及病理分析图：其中，a是荷瘤小鼠经生理盐水、pcp-mn-dta、1-mt、pcp-mn-dta@1-mt、pcp-mn-dta@gox@1-mt处理不同时间后的肿瘤大小；b是给药处理期间的相对肿瘤体积变化图；c和d是小鼠存活率曲线及体重变化图；e是肿瘤组织h&e，tunel及ki-67免疫荧光染色；e的比例尺：100μm。
42.图13是本发明的mof控释体系调控体内t细胞免疫响应流式检测图：其中，a和b是cd8
+
毒性t细胞和cd4
+
辅助性t细胞流式检测和相应的量化统计；c和d是肿瘤浸润tregs细胞的流式检测及量化统计。
43.图14是本发明的mof控释体系调控体内dc细胞及b、nk细胞免疫响应流式检测图：其中，a和b是肿瘤浸润dc细胞的流式检测和量化统计图；c和d是肿瘤浸润b细胞的流式检测及量化统计图；e和f是肿瘤浸润nk细胞的流式检测及量化统计图。
44.图15为本发明的mof控释体系体内抑制ido活性及其表达相关通路蛋白表达分析
图：其中，a是给药4天后，携带b16f10肿瘤的c57bl/6小鼠的kyn/trp比；b是分别用抗ido1，抗mtor和抗stat3染色的肿瘤切片的免疫荧光染色图像；b的比例尺：100μm。
45.图16是本发明的mof控释体系生物安全性及药代动力学：其中，a是治疗1h前后小鼠血糖水平的变化；b和c是治疗10d后评估肝功能的ast和alt浓度；d是荷瘤小鼠各个脏器的h&e染色；e和f是荷瘤小鼠静脉注射1-mt和pcp-mn-dta@gox@1-mt纳米颗粒24h后的药代曲线及1-mt在各脏器及肿瘤中的分布。
46.图17是本发明的mof控释体系体内抗肿瘤转移图：其中，a和b是各个给药处理组的b16f10恶性肿瘤肺转移模型小鼠肺部肿瘤转移结节及量化统计图。
47.图18是本发明的mof控释体系体内抗肿瘤复发及长效免疫记忆分析图：其中，a是通过以上治疗组的给药途径来评价肿瘤的复发程度的示意图，b是各种给药后小鼠的肿瘤复发率统计，c、d和e是小鼠二次注射肿瘤细胞后，体内效应记忆t细胞和中枢记忆t细胞水平流式检测和及量化统计。
48.图19是本发明pcp-mn-dta@gox@1-mt控释系统的制备及在体内联合饥饿/氧化/ido免疫治疗的示意图。
具体实施方式
49.下面对本发明的具体实施例进行详细描述，以便于进一步理解本发明。
50.以下实施例中所有使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。以下实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可通过商业途径获得。
51.实施例1反应器及其制备方法
52.一种mn基可降解mof纳米反应器控释系统pcp-mn-dta@gox@1-mt，是以mn基ros响应性可降解mof纳米颗粒mn-dta作为内核，在其表面功能化接枝ph响应性peg-cdm-pei外壳，共装载gox和1-mt，制备出来的控释系统。
53.mn基可降解mof纳米反应器控释系统pcp-mn-dta@gox@1-mt的制备过程包括以下步骤：
54.(1)制备内核mn基mof纳米颗粒mn-dta：
55.11)ros响应性有机配体5，5-二甲基-4，6-二硫代壬二酸(dta)的合成：
56.称取4.9mmol 3-巯基丙酸(mpa)溶解于9.82mmol的丙酮溶液中，室温连续搅拌8h。然后，将上述混合体系放置在冰浴(冰水混合物)中过夜，使其结晶。过滤，收集结晶。随后，将滤液晶体用正己烷和冷水反复洗涤，真空干燥后，收集所得产物，即为dta，结构如下：
[0057][0058]
12)mn-dta的制备：
[0059]
首先，称取50mg氯化锰(mncl2)和15mg dta分别溶解于1ml n，n-二甲基甲酰胺(dmf)中；其次，在15ml离心管中加入107μl的mncl2溶液和347μl的dta溶液；然后，再向其中加入300mg的聚乙烯吡咯烷酮k 30(pvp-k30)和200μl的三乙胺；之后，将配置好的dmf/乙醇(v/v＝5/3)溶剂加入管中，直到体积为13ml。接下来，将混合物超声分散，转移至水热合成反应器中，随后在150℃下高温反应24h。待自然冷却至室温后，通过离心收集产物，然后分
散在乙醇中待用。将获得的mof纳米颗粒命名为mn-dta。
[0060][0061]
(2)对上述内核进行表面功能化接枝：
[0062]
21)peg-cdm的合成：
[0063]
首先，将6mmol顺乌头酸酐(cdm)均匀分散在5ml的无水二氯甲烷(dcm)溶液中，搅拌15min；将该体系置于0℃的冰水混合物中，加入12mmol草酰氯，搅拌均匀；然后将160μl dmf逐滴地加入到混合溶液中，在0℃条件下继续反应15min；之后将该反应体系转移至室温，继续搅拌反应2h。混合溶液经真空干燥后，收集得酰氯化cdm。接下来把产物加入到10ml溶解有0.8mmol聚乙二醇单甲醚(mpeg-oh)和120μl吡啶的dcm溶液中，室温继续搅拌反应2h；随后，加入10ml饱和的氯化铵溶液终止反应。最后，将有机相萃取、分离、干燥，冰浴沉淀2-3次，得到终产物，即为peg-cdm，结构如下：
[0064][0065]
22)peg-cdm-pei的合成：
[0066]
在0℃条件下，将peg-cdm(0.6mmol)和支链聚乙烯亚胺(pei)(0.9mmol)溶解于10ml dmso，然后逐滴地加入1.2mmol的4-二甲氨基吡啶(dmap)，并在0℃下搅拌0.5h，随后将该反应体系置于室温，避光反应2h。将该混合物用双蒸水透析(mwco 3.5kda)4天，并在相应的时间进行换水操作，将产物冷冻干燥，收集得到终产物peg-cdm-pei，结构如下：
[0067][0068]
(3)peg-cdm-pei-mn-dta颗粒的制备
[0069]
将mn-dta(10mg)，1-乙基-3-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺盐酸盐edc
·
hcl(6mm)和nhs(6mm)溶解在pbs(ph 7.4，10ml)中，室温下搅拌1.5h。随后，将分散在pbs(ph 7.4，5ml)中的peg-cdm-pei(0.06mmol)加入上述溶液，继续反应36h。通过离心收集产物(peg-cdm-pei-mn-dta，记为pcp-mn-dta)，真空干燥保存。
[0070]
(4)pcp-mn-dta@gox@1-mt控释系统的制备
[0071]
将mn-dta(10mg)，gox(1.33mg)和1-mt(2mg)溶于pbs(ph 7.4，10ml)中，室温搅拌反应24h；离心去除未装载的药物。然后，将混合体系重悬于由edc
·
hcl(15mm)和nhs(15mm)组成的pbs(ph 7.4，10ml)溶液中。参考上述pcp-mn-dta纳米颗粒的合成方法，离心收集负载药物的纳米反应控释系统，冷冻干燥得到终产物，简记为pcp-mn-dta@gox@1-mt。
[0072]
实验例1
[0073]
将实施例1各步骤得到的产物经xrd、tem、bet、1h nmr、dls和zeta电位分析仪、gpc、ftir等现代纳米测试分析技术对其形貌、成分和化学键进行系统的研究，结果如下：
[0074]
本发明通过x射线衍射分析了实施例得到的mn-dta的晶体结构，结果如图1a所示，mn-dta的xrd图谱在100
°
，002
°
，101
°
，102
°
，110
°
，103
°
和112
°
呈现强衍射峰，该特征峰与mns化合物的晶体结构一致。其中，mn-dta还表现出相对尖锐的衍射峰，表明mn-dta单晶具有良好的结晶度。此外，ccdc数据库计算结果表明，mn
2+
实际上与3个dta配体配位，形成正六棱柱结构(如图1的b-d图所示)，底面六边形的三个顶点被3个mn
2+
占据着，每个棱柱侧面四边形的两个顶点被2个mn
2+
占据着，它们与来自dta中的mn
2+
和-cooh之间的连接构成了六棱柱的侧面。同时，每个mn
2+
被两个相邻的四边形和一个六边形所共有(如图1的e图所示)。以上结果共同表明，mn-dta是具有三维多孔网络结构的mof颗粒。
[0075]
本发明通过透射电镜及动态光散射对实施例中得到的mn-dta和pcp-mn-dta进行表征。如图2的a图所示，mn-dta呈球形结构，其尺寸约为50nm。mn、s和o的eds元素图谱进一步证实了mn-dta的结构及其元素组成(如图2的b图所示)。上述结果证实，已成功合成合适尺寸的mn-dta纳米颗粒。peg-cdm-pei功能化修饰后，pcp-mn-dta纳米颗粒显示出与mn-dta内核相似的球形形貌(如图2的c图所示)，并且在pcp-mn-dta周围观察到明显的外层。而且pcp-mn-dta整体结构变得模糊，颗粒直径直接从49.5
±
7.3增加到97.0
±
4.5nm(n＝300)，这是由于成功接枝了peg-cdm-pei外壳。该结果与dls统计分析相一致(如图2的d图所示)。上述结果确认了pcp-mn-dta的成功制备。
[0076]
本发明通过n2吸收-解吸技术测定实施得到的mn-dta的比表面积孔径，如图3的a图所示，mn-dta显示出典型的iv型等温吸附曲线，表明mn-dta有明显的介孔结构，同时mn-dta呈现高的比表面积和较大的孔径，分别为107.8m2g-1
和8.61nm(如图3的b图所示)，进一步证实mn-dta的成功合成。
[0077]
本发明采用核磁光谱、gpc和ftir分析了实施例中各步骤得到的dta、peg-cdm和peg-cdm-pei的化学结构。如图4的a图所示，在dta的核磁图谱中，各个基团的特征信号峰的位置及积分面积均准确无误，表明dta的成功合成；如图4的b图所示，peg-cdm的核磁谱图在3.45ppm和3.71ppm出现明显的信号峰，分别归因于peg中-och3甲氧基峰和-och2ch2o-亚甲基质子峰，而在2.93ppm和7.95ppm处的信号峰分别归属于cdm中的-ooch2c-亚甲基和-chcoo-次甲基的特征峰，并且各个特征峰积分面积准确，表明peg-cdm已合成成功；pei和peg-cdm偶联后，在peg-cdm-pei核磁图谱中出现pei的特征峰(c+d，如图4的c图所示)，且其积分面积准确无误，表明peg-cdm-pei已成功合成。如图4的d图所示，peg-cdm-pei的gpc谱图里只有单一的洗脱峰，且经计算平均分子量为7200g/mol，与核磁的计算结果及下表中的理论分子量相符，该结果再次表明peg-cdm-pei的成功合成。
[0078][0079]
本发明采用ftir分析了实施例1中各步骤得到的peg-cdm和peg-cdm-pei的化学结构。如图4的e图所示，peg-cdm和peg-cdm-pei的红外光谱图在1115cm-1
和2885cm-1
处具有强
的吸收峰，分别归因于peg中c-o和-ch2的伸缩振动。另外，在1633cm-1
和1569cm-1
处的吸收峰归属于酰胺i和酰胺ⅱ的伸缩振动(如图4的e图中a所示)，该结果表明peg-cdm的成功合成；接枝pei后，peg-cdm-pei的红外光谱图(如图4的e图中b所示)在1739cm-1
处出现羰基(c＝o)的特征峰，这是因为pei接枝peg-cdm的过程中形成了酰胺键，且1645cm-1
和1562cm-1
出现的典型酰胺i和酰胺ⅱ的特征峰，进一步证实了peg-cdm-pei的成功合成。
[0080]
实验例2
[0081]
mn基可降解mof纳米反应器控释系统ph/ros响应性尺寸减小/电荷反转及药物释放特性。
[0082]
本发明利用h2o2来模拟肿瘤微环境ros，检测该体系ph响应性尺寸减小&电荷反转、ros响应性药物释放的特性。具体结果如下：
[0083]
1)pcp-mn-dta@gox@1-mt控释系统ph响应性尺寸减小&电荷反转特性
[0084]
利用dls和zeta考察pcp-mn-dta@gox@1-mt控释系统ph响应的尺寸减小&电荷反转特性。如图5的a图所示，pcp-mn-dta@gox@1-mt在ph 7.4(模拟正常生理条件)条件下的尺寸为97
±
4.5nm，而在ph 6.8(模拟肿瘤微环境低酸刺激)条件下孵育4h后，颗粒尺寸减小到55nm，与mn-dta的大小相近，该结果与dls相符，证实该体系具有ph响应的尺寸减小特性；此外，zeta电位结果表明，在ph 6.8刺激下，pcp-mn-dta@gox@1-mt的表面电荷从-13.7mv反转为+34.2mv(如图5的b图)，证实了该体系具有ph响应的电荷反转特性。
[0085]
2)pcp-mn-dta@gox@1-mt控释系统ros响应性自增强降解&药物控释特性
[0086]
首先，用tem和dls分别检测pcp-mn-dta@gox@1-mt控释系统在ros响应条件下的可降解特性。如图5的a图和c图所示，在无h2o2(对照组)存在的条件下，mn-dta和pcp-mn-dta@gox@1-mt呈现出典型的球形结构；而在有h2o2的刺激条件下，纳米颗粒的球形结构崩塌，发生完全解体(如图5的c图和d图)。dls(如图5的a图所示)结果也呈现相类似的变化，这表明pcp-mn-dta@gox@1-mt控释系统具有ros响应的可降解的特性。
[0087]
其次，用uv-vis考察pcp-mn-dta@gox@1-mt控释系统ros响应性的药物释放特性。如图5的e图所示，将pcp-mn-dta@gox@1-mt控释系统与不同浓度的h2o2孵育后，gox和1-mt的特征峰强度呈现明显的增强，且它们各自的特征峰强度和h2o2浓度呈正相关(如图5的e图)，即h2o2浓度越高，控释系统的降解及gox和1-mt的释放速率也就越快。值得注意的是，当pcp-mn-dta@gox@1-mt控释系统用葡萄糖处理后，pcp-mn-dta@gox@1-mt系统中gox和1-mt的吸收峰强度也急剧提高，这是由于gox催化葡萄糖产生大量ros，进而加速颗粒降解和药物释放所致。该结果表明，pcp-mn-dta@gox@1-mt控释系统具有ros响应的自增强降解和药物释放特征。
[0088]
最后，量化统计了不同ros刺激条件下的药物累积释放水平。如图5的f图所示，在生理条件(ph 7.4)下孵育24h后，对照组的gox释放量可忽略不计(低于16％)，表明pcp-mn-dta@gox@1-mt控释系统具有良好的稳定性。与对照组相比，当纳米颗粒分别与0.1mm和1mm的h2o2孵育后，58％和79％的gox从pcp-mn-dta@gox@1-mt控释系统中释放，再次证实了pcp-mn-dta@gox@1-mt体系具有ros敏感的药物释放特性。另外，在额外添加葡萄糖刺激后，pcp-mn-dta@gox@1-mt呈现出近乎完全的gox释放(约81％和90％)，该结果进一步证实，pcp-mn-dta@gox@1-mt控释系统具有ros响应的自增强药物释放特性。
[0089]
实验例3
[0090]
mn基可降解mof纳米反应器控释系统pcp-mn-dta@gox@1-mt的体外生物学评价。
[0091]
(1)细胞活性及胞内ros检测
[0092]
细胞培养：本发明选用的中国科学院细胞研究所提供小鼠黑色素瘤高转移细胞(b16f10)。b16f10细胞在含有10％fbs和1％双抗(100μg/ml青霉素和100μg/ml链霉素)的dmem高糖培养基中培养，培养环境为37℃、5％co2的细胞孵箱中。
[0093]
为了评估pcp-mn-dta@gox@1-mt控释系统的体外肿瘤细胞毒性，本发明采用cck-8法分别检测了pcp-mn-dta、1-mt、pcp-mn-dta@1-mt以及pcp-mn-dta@gox@1-mt辅以葡萄糖/无葡萄糖处理对b16f10细胞活性的影响。将b16f10细胞以2
×
104cells/cm2的密度接种至24孔板，当细胞融合度达到约60-70％，将b16f10细胞分别与上述药物共培养24h和48h，用pbs清洗细胞，随后加入200μl新鲜培养基和20μl cck8的混合溶液。在37℃条件下继续反应1.5-2h，随后将孔板内反应溶液转移至96孔板中，用酶标仪检测450nm波长下的溶液吸光度，由此计算细胞活性。结果如图6的a图所示，无论孵育时间长短，对照组和pcp-mn-dta组均表现出较高的细胞活性；游离的1-mt产生轻微的细胞损伤；与pcp-mn-dta@1-mt组相比，pcp-mn-dta@gox@1-mt引起了更严重的细胞毒性；而在所有处理组中，pcp-mn-dta@gox@1-mt加葡萄糖组处理展现了最低水平的细胞活性。该结果进一步证实，pcp-mn-dta@gox@1-mt控释系统具有良好的体外肿瘤杀伤效果。
[0094]
为了考察pcp-mn-dta@gox@1-mt控释系统的ros产生特性，本发明利用ros检测探针dcf-da和clsm考察各个实验组诱导肿瘤细胞的ros产生水平。主要步骤为：将b16f10细胞以1
×
105cells/cm2的初始密度接种在共聚焦显微镜皿上，当细胞融合度达到60-70％后，分别与gox、pcp-mn-dta、pcp-mn-dta@gox、pcp-mn-dta@gox@1-mt和pcp-mn-dta@gox@1-mt+低糖培养基共培养12h，随后加入含有10μm的dcfh-da的无血清培养基溶液(1ml)，37℃共孵育20min，细胞经pbs洗涤后，通过clsm观察ros荧光的产生并量化统计荧光强度。结果如图6的b图所示，与对照组相比，pcp-mn-dta组和游离1-mt组均没有产生可见的绿色荧光；而pcp-mn-dta@gox组和pcp-mn-dta@gox@1-mt组均在细胞内激发了明亮的绿色荧光。另外在缺乏葡萄糖的情况下，用低糖培养基孵育的pcp-mn-dta@gox@1-mt组的胞内ros生成量显著降低。量化统计分析结果进一步证实上述现象(如图6的c图所示)。该结果证实，pcp-mn-dta@gox@1-mt组可以有效地催化和代谢葡萄糖，自产生ros，具有ros响应性自增强药物释放特性。
[0095]
(2)体外肿瘤渗透和细胞摄取
[0096]
首先构建基于b16f10细胞的3d多细胞球体(mcs)，即肿瘤球模型。将80μl的1.5％的热琼脂糖溶液加入到96孔板中，待其冷却凝固成凝胶后，紫外照射灭菌过夜。随后将b16f10细胞以2
×
103cells/well的初始密度接种在上述孔板中，共培养6d后，形成肿瘤球。随后将fitc标记的pcp-mn-dta@gox@1-mt控释系统与肿瘤球共孵育，clsm监测控释系统在ph 7.4(生理条件)和ph 6.8(模拟弱酸性肿瘤微环境)条件下的mcss渗透，考察控释系统ph增强的肿瘤渗透行为。如图7的a图所示，在ph 7.4的条件下，孵育4h后。绿色荧光标记的pcp-mn-dta@gox@1-mt多数分散在mcss外边界周围；即使孵育时间延长到12h，仍是上述情况，且仅有少量绿色荧光进入mcs的内部。在ph6.8条件下，孵育4h后，绿色荧光标记的pcp-mn-dta@gox@1-mt广泛分布在mcss核心区域；孵育12h时，整个mcs球体均分散了较强的绿色荧光。定量分析进一步证实了pcp-mn-dta@gox@1-mt控释系统具有ph增强的肿瘤渗透特性
(如图7的b图所示)。
[0097]
为了进一步考察细胞摄取效率，用clsm和fcm实时监测b16f10细胞对pcp-mn-dta@gox@1-mt控释系统的胞吞水平。将1
×
105cells/cm2的b16f10细胞接种在共聚焦培养皿中，当细胞融合度达到60-70％，用pbs、fitc标记的gox(缩写为gox-fitc，10mu/ml)，pcp-mn-dta@gox-fitc@1-mt处理细胞，在ph 7.4和6.8的条件下分别孵育4h和12h。随后分别对细胞的核和骨架进行染色分析以及用流式细胞仪定量检测胞吞效率。如图8的a图和b图所示，与对照相比，在ph 7.4或ph 6.8条件下，b16f10胞吞的pcp-mn-dta@gox@1-mt浓度和强度均显著高于游离gox；在ph 6.8时，b16f10细胞对pcp-mn-dta@gox@1-mt的胞吞量明显高于ph 7.4，这与fcm量化分析结果一致。
[0098]
(3)体外肿瘤细胞凋亡
[0099]
为了研究pcp-mn-dta@gox@1-mt控释系统的体外肿瘤杀伤效果，分别用western blotting蛋白免疫印迹法与annexin v-fitc/pi凋亡试剂盒流式检测法对pcp-mn-dta@gox@1-mt诱导的b16f10细胞凋亡水平进行分析。具体如下：
[0100]
1)western blotting
[0101]
bcl-2家族相关基因的表达在肿瘤细胞凋亡信号转导途径中发挥着重要作用，其中抑凋亡蛋白bcl-2和促凋亡蛋白bax的表达被用于表征肿瘤细胞的凋亡状态。另外，细胞色素c(cyt-c)也是细胞凋亡通路中不可或缺的重要蛋白指标。将接种在6孔板上的b16f10细胞分别用pbs、1-mt、pcp-mn-dta、pcp-mn-dta@1-mt、pcp-mn-dta@gox@1-mt和pcp-mn-dta@gox@1-mt+葡萄糖处理24h后，裂解细胞，并通过离心收集蛋白样品。使用western blotting和imagej软件来检测和分析bax，bcl-2和cyt-c的表达。结果如图9a所示：与对照组相比，游离1-mt组的bax/bcl-2蛋白比率和cyt-c呈现微弱上调；相比于1-mt组，负载1-mt的pcp-mn-dta@1-mt组诱导更为明显的凋亡蛋白表达；而提供额外葡萄糖的pcp-mn-dta@gox@1-mt组诱导了最高比例的bax/bcl-2和cyt-c表达上调，呈现了最高的细胞凋亡水平。图9的b图和c图为不同处理组的细胞凋亡相关蛋白的量化统计分析，结论与图9的a图相同。
[0102]
2)annexin v-fitc/pi流式细胞仪检测
[0103]
为进一步考察肿瘤细胞凋亡水平，用annexin v-fitc/pi染色试剂盒和fcm量化检测不同实验组诱导b16f10细胞的凋亡比例。具体实验过程为：对接种在6孔板上的b16f10细胞用pbs、1-mt、pcp-mn-dta、pcp-mn-dta@1-mt、pcp-mn-dta@gox@1-mt和pcp-mn-dta@gox@1-mt+葡萄糖孵育24h，pbs洗涤后，加入不含edta的胰酶消化细胞，后通过离心收集细胞，参考annexin v-fitc/pi试剂盒的步骤，先用fitc避光染色10min；用结合缓冲液洗涤一次，再用pi染色，上机检测，用流式细胞术fcm分析细胞凋亡水平。结果如图9的d图和e图所示，与对照组相比，空白载体pcp-mn-dta诱导可忽略的凋亡比率；游离的1-mt引起了微弱的细胞凋亡，且明显低于pcp-mn-dta@1-mt组(12.91％vs 21.7％)；此外，pcp-mn-dta@gox@1-mt组诱导了最严重的细胞凋亡(47.4％)，这是由于gox产生的氧化损伤和细胞饥饿引起的。值得注意的是，pcp-mn-dta@gox@1-mt加葡萄糖组引起了最严重的肿瘤细胞凋亡(54.1％)，这再次证实pcp-mn-dta@gox@1-mt控释系统诱导高效的肿瘤杀伤是由gox诱导的饥饿/氧化损伤以及1-mt引起的细胞毒性的联合作用导致。
[0104]
(4)体外ido的抑制作用及t细胞增殖的影响
[0105]
为了研究pcp-mn-dta控释系统对ido1活性的体外抑制作用，利用蛋白免疫印迹考
察pcp-mn-dta@gox@1-mt控释系统诱导b16f10细胞ido1的表达水平。将接种在6孔板上的b16f10细胞分别用pbs、1-mt、pcp-mn-dta、pcp-mn-dta@1-mt和pcp-mn-dta@gox@1-mt处理24h后，裂解细胞，并通过离心收集蛋白样品。使用western blotting和imagej软件来检测和分析ido1的表达。结果如图10a所示，与对照组和pcp-mn-dta组相比，游离的1-mt组对ido1的表达有明显的抑制作用；与游离的1-mt组相比，pcp-mn-dta@1-mt组和pcp-mn-dta@gox@1-mt组均呈现出更高水平的ido1表达下调。图10b为不同处理组的细胞凋亡相关蛋白的量化统计分析，结论与图10a相同。这表明pcp-mn-dta@gox@1-mt控释系统可以较高效地抑制ido活性是因为pcp-mn-dta@gox@1-mt控释系统优良的药物递送效率。
[0106]
建立包含b16f10细胞和淋巴细胞的共培养系统，以确定ido1介导的t细胞增殖作用。将b16f10细胞用ifn-γ50ng/ml刺激过夜以诱导ido1的表达。从c57小鼠中收集脾细胞悬液后，通过密度梯度离心获得淋巴细胞并通过尼龙纤维柱纯化。然后将纯化的t细胞用抗cd3/cd28磁珠和il-2(20ng/ml)激活。接下来，将ifn-γ刺激的b16f10细胞(1
×
105cells/cm2)与上述t细胞(5
×
105cells/cm2)在24孔板中混合均匀，之后用pcp-mn-dta、1-mt、pcp-mn-dta@1-mt和pcp-mn-dta@gox@1-mt处理共培养12h后，收集上清液中的淋巴细胞，并与edu(10μm)孵育2h。随后通过离心收集细胞，用4％多聚甲醛固定，之后用0.5％triton x-100使细胞膜通透，然后用488染色10min(cell-light
tm edu488试剂盒)，最后使用流式细胞仪进行定量分析。结果如图10c所示，与对照组相比，1-mt和负载1-mt的药物(pcp-mn-dta@1-mt&pcp-mn-dta@gox@1-mt)处理组内edu
+ t细胞的比例显著增加；pcp-mn-dta@gox@1-mt组的t细胞增殖数量显然高于游离1-mt组，而与pcp-mn-dta@1-mt无明显差异(如图10的d图所示)。解释如图10的e图所示：首先，游离1-mt的吸收效率和随后的生物利用度受到其较差的溶解度的限制；其次，具有高载药量的pcp-mn-dta载体可以有效解决1-mt弱溶解性问题，提高药物生物利用度；第三，pcp-mn-dta@gox@1-mt和pcp-mn-dta@1-mt可以被b16f10细胞内吞，响应胞内ros，释放gox和1-mt，累积在胞内的高剂量1-mt能有效抑制ido1的活性并恢复t细胞的活性，促进t细胞增殖。这些结果证实，pcp-mn-dta控释系统具有增强体内抗肿瘤免疫力的巨大潜力。
[0107]
(5)体外抗肿瘤迁移性
[0108]
考虑到gox和1-mt调控的能量代谢作用与肿瘤迁移侵袭密切相关，因此，本发明采用划痕愈合、迁移和侵袭实验评估pcp-mn-dta@gox@1-mt控释系统对b16f10细胞的抗迁移作用。
[0109]
将接种在6孔板中的b16f10细胞用pbs、pcp-mn-dta、1-mt、pcp-mn-dta@1-mt、pcp-mn-dta@gox@1-mt处理24h后，用黄枪头轻轻的在单层的培养细胞间划痕(枪头与六孔板的底部垂直不倾斜，使划痕在同一方向成一直线)，然后洗涤细胞以除去纳米颗粒和脱落的细胞，再过24h后，pbs清洗，多聚甲醛固定，1％的结晶紫染色，最后用显微镜拍摄划痕愈合的图像。结果如图11的a图所示，对照组和pcp-mn-dta处理组的b16f10细胞划痕消失，显示肿瘤细胞固有较强的愈合能力。而1-mt组和pcp-mn-dta@1-mt组细胞愈合率分别为75％和58％(如图11的b图所示)，表现出一定水平的抗肿瘤迁移作用。此外，pcp-mn-dta@gox@1-mt组诱导的细胞愈合率最低，为39％，这表明pcp-mn-dta@gox@1-mt可以达到最有效的抑制细胞迁移作用。
[0110]
与划痕愈合实验一致，将b16f10细胞与上述药物一起孵育24h，消化细胞并离心收
集。对于细胞迁移实验：将细胞重悬于无血清的培养基中，随后把1
×
105cells/cm2细胞转移至transwell上室。对于侵袭实验：将2
×
105cells/cm2的b16f10细胞接种在transwell预包被的基质凝胶上。在该测试中，将含有10％血清的培养基作为化学引诱剂添加至下腔室。将细胞孵育24h后，用棉签除去transwell上表面的细胞，并用结晶紫将下表面的细胞染色。染色后，计数细胞，然后在显微镜下成像。我们规定未经处理的对照组的细胞迁移/侵袭率为100％。结果如图11a&11c&11d所示，迁移和侵袭实验也显示出与上述划痕愈合实验相似的趋势，其中，pcp-mn-dta@gox@1-mt组对b16f10细胞迁移和侵袭的抑制作用最强，该处理组肿瘤细胞迁移和侵袭相应的比率分别为30.1％和24.9％。结果表明pcp-mn-dta@gox@1-mt控释系统可以有效抑制体外肿瘤转移。
[0111]
实验例4
[0112]
mn基可降解mof纳米反应器控释系统pcp-mn-dta@gox@1-mt的体内抗肿瘤评价。
[0113]
(1)荷瘤小鼠模型的构建：
[0114]
本发明所有动物实验均按照实验动物管理与使用委员会工作手册相关规定进行。5-6周龄的20g左右的雌性c57bl/6小鼠购自中国北京药品检验所。本发明采用指数生长期的b16f10细胞制备了100μl的细胞悬液，将悬液皮下接种在每只小鼠的右侧腹股沟皮下，建立荷瘤小鼠模型每天观察小鼠的健康状况和行为，每2天记录荷瘤小鼠的体重以及肿瘤体积，根据以下的公式计算肿瘤体积(v)：v＝l
×
s2/2(l，肿瘤的长径；s，肿瘤的短径)。
[0115]
(2)药物干预和组织病理学分析：
[0116]
将成功构建的荷瘤小鼠荷瘤小鼠依据重量随机的原则分为五组，静脉注射生理盐水、1-mt、pcp-mn-dta、pcp-mn-dta@1-mt和pcp-mn-dta@gox@1-mt，每周给药2次，持续20天。给药结束后，安乐死小鼠。收集小鼠的心、肝、脾、肺、肾和肿瘤，进行h&e、tunel及ki-67染色进行组织病理学分析。
[0117]
处死小鼠后，收集主要器官和肿瘤组织，结果如图12的a图所示，pcp-mn-dta组和生理盐水组的肿瘤大小相似，肿瘤在给药期间呈现出快速的生长趋势，表明空白载体没有明显的抗肿瘤作用，生物安全性较好；游离1-mt组和pcp-mn-dta@1-mt组分别显示出对肿瘤生长轻微和中等程度的抑制作用，在所有处理组中，pcp-mn-dta@gox@1-mt组诱导了最显著的肿瘤生长抑制作用，且b16f10恶性肿瘤在给药处理18天后几乎消失，这表明pcp-mn-dta@gox@1-mt介导的肿瘤饥饿/氧化/ido免疫联合治疗能高效杀伤肿瘤。图12b的肿瘤体积统计结果证实了相同的肿瘤生长抑制趋势。此外，与其他处理组相比，pcp-mn-dta@gox@1-mt组不仅显著延长了荷瘤小鼠的存活时间(30天存活率为67％，图12的c图，明显高于其他治疗组)，而且给药期间荷瘤小鼠体重没有减轻(如图12的d图所示)，这表明pcp-mn-dta@gox@1-mt控释系统具有良好的生物安全性及优异的抗肿瘤作用。
[0118]
组织病理学分析的结果如图12的e图所示，与对照组和pcp-mn-dta组相比，1-mt组和pcp-mn-dta@1-mt组均诱导了一定程度的肿瘤组织凋亡；pcp-mn-dta@gox@1-mt组诱导了最为严重的肿瘤组织凋亡，表现为肿瘤切片h&e图中明显的细胞塌陷、变形和染色质浓缩以及tunel图中标记dna损伤的大量品红色荧光点。此外，ki-67免疫荧光染色结果表明，pcp-mn-dta@1-mt组和pcp-mn-dta@gox@1-mt组均有效下调了肿瘤细胞ki-67的表达，其中，pcp-mn-dta@gox@1-mt组呈现出ki-67的最弱表达，这再次佐证了pcp-mn-dta@gox@1-mt控释系统具有良好的抗肿瘤作用。
[0119]
(3)体内免疫响应检测：
[0120]
本发明采用fcm量化分析肿瘤部位浸润性的各类免疫细胞比例来验证pcp-mn-dta@gox@1-mt控释系统介导的饥饿/氧化/免疫疗法的体内抗肿瘤免疫应答效果，具体实验过程如下：在给药处理后，安乐死小鼠，收集肿瘤组织，在37℃的摇床使用由0.2％胶原酶iv、0.1％透明质酸酶v、0.002％dna酶i和dmem培养基组成的裂解液裂解1h。随后将裂解后的溶液通过75μm的滤膜以此分离单分散的淋巴细胞，离心收集，并用清洗液进行清洗，把细胞重悬于pbs溶液中。接着，将细胞用live/dead染料染色20min。
[0121]
1)对于肿瘤浸润cd4
+
及cd8
+ t细胞的检测：将上述收集的细胞与anti-cd3-apc/cy7、
[0122]
anti-cd4-fitc和anti-cd8-percp-cy5.5在4℃条件下共孵育30min，随后用fcm检测肿瘤浸润cd4
+
及cd8
+ t细胞水平；
[0123]
2)对于tregs细胞的检测：将上述收集细胞与anti-cd3-apc/cy7和anti-cd4-fitc共孵育染色30min后，再参照foxp3试剂盒上的步骤进行固定、透化，随后将细胞与anti-foxp3-alexa 647在4℃孵育30min，并用fcm检测肿瘤浸润treg细胞(cd3
+
cd4
+
foxp3
+
)的水平；
[0124]
3)对于肿瘤浸润成熟的dc细胞的检测：将上述收集细胞与anti-cd11b-fitc、anti-cd80-apc和anti-cd86-pe共染色30min，并用fcm分析dc细胞(cd11b
+
cd80
+
cd86
+
)的水平；
[0125]
4)对于肿瘤浸润nk细胞的检测：将上述收集细胞与anti-cd3-apc/cy7和anti-cd49b-pe/cy7共染色30min，并用fcm分析nk细胞(cd3-cd49b
+
)的水平；
[0126]
5)对于肿瘤浸润b细胞的检测：将上述收集细胞与anti-cd3-apc/cy7和anti-cd45r/b220-pe共染色30min，并用fcm分析b细胞(cd3-cd45r/b220
+
)的水平；
[0127]
结果如下：
[0128]
1)t细胞的免疫响应
[0129]
由于ido介导的免疫逃逸会直接抑制肿瘤浸润cd8
+
毒性t细胞和cd4
+
辅助性t细胞的活性，因而肿瘤浸润cd8+毒性t细胞和cd4+辅助性t细胞的水平最能直接体现抗肿瘤免疫反应。因此，本发明首先用fcm定量表征了不同处理组肿瘤病灶中cd8
+
毒性t细胞、cd4
+
辅助性t细胞以及tregs的水平。如图13a-d所示，对照组中肿瘤浸润性cd8
+
细胞毒性t细胞(ctl)的比例低，tregs细胞水平高；游离1-mt组的ctl数量适度增加，tregs表现出一定程度的下降；而负载1-mt的pcp-mn-dta@1-mt组的趋势明显高于游离1-mt，得益于pcp-mn-dta@1-mt优良的药物递送效率，且通过1-mt介导的ido阻断激活了抗肿瘤免疫反应，招募了大量的肿瘤浸润cd8
+
，有助于恢复效应t细胞的活性，并抑制tregs增殖。另外，在所有处理组中，pcp-mn-dta@gox@1-mt呈现出最高的ctl浸润比例，且最低的tregs比例，表明pcp-mn-dta@gox@1-mt控释系统能有效激活免疫响应，增强抗肿瘤免疫应答以及抑制免疫耐受。
[0130]
2)dc细胞及b、nk细胞的免疫响应
[0131]
本发明通过考察dc细胞的成熟程度，进一步揭示pcp-mn-dta@gox@1-mt控释系统增强的抗肿瘤免疫应答机制。如图14a&14b所示，1-mt和负载1-mt的实验组(pcp-mn-dta@1-mt和pcp-mn-dta@gox@1-mt)都促进了dc细胞不同程度的成熟，其成熟度的顺序为：1-mt《pcp-mn-dta@1-mt《pcp-mn-dta@gox@1-mt，结果表明pcp-mn-dta@gox@1-mt控释系统成功促
进了dc细胞的成熟。另外，pcp-mn-dta@gox@1-mt控释系统还成功招募肿瘤浸润性b细胞和nk细胞(如图14的c-f图所示)。这是因为pcp-mn-dta@gox@1-mt可以通过gox介导的氧化/饥饿疗法有效诱导肿瘤损伤，增强肿瘤免疫原性，促进肿瘤相关抗原taa的暴露并增强细胞毒性cd8
+ t细胞和辅助cd4
+ t细胞的瘤内募集；此外，pcp-mn-dta@gox@1-mt控释系统通过抑制ido活性，解除ido介导的免疫耐受，进一步增强了机体的抗肿瘤免疫应答。
[0132]
3)相关蛋白的免疫荧光分析
[0133]
ido1作为诱导免疫逃逸的关键机制，是恢复抗肿瘤免疫力的重要治疗靶标，它可以不仅能催化trp代谢为kyn，还能通过ahr-il-6-stat3途径直接抑制mtor并激活stat3的活性，调控免疫耐受。基于以上考虑，kyn与trp的比例、瘤内ido1、mtor和stat3的表达变化可以作为揭示ido1介导的免疫逃逸抑制的指标。本发明分别测量了瘤内kyn和trp的比例，并对瘤内ido1、mtor以及stat3的表达进行了免疫荧光分析来阐明pcp-mn-dta@gox@1-mt控释系统调控机体免疫应答的分子机制。结果如图15a&b所示，免疫治疗组(pcp-mn-dta@1-mt和pcp-mn-dta@gox@1-mt)的kyn/trp比例及ido1蛋白的表达最低，这表明该体系有效抑制了ido1活性。此外，ifc结果还表明，免疫治疗组可明显诱导mtor的上调和stat3的下调，该结果进一步证实pcp-mn-dta@gox@1-mt控释系统能有效地阻断ido1介导的免疫耐受并增强持久的抗肿瘤免疫应答。
[0134]
(4)生物安全性及药代动力学：
[0135]
首先，检测静脉注射pcp-mn-dta@gox@1-mt控释系统前后小鼠的血糖水平。结果如图16a所示，与对照组相比，所有治疗组均未诱导外周血糖持续下降，表明该控释系统具有良好的血液安全性。其次，我们根据试剂盒检测了注射不同药物后血液中肝功能指标谷草转氨酶ast和谷丙转氨酶alt的水平来评估肝脏功能或肝损伤，结果如图16b&c所示，两种酶的浓度没有明显的变化，与对照组无明显差异，这表明pcp-mn-dta@gox@1-mt控释系统对肝组织具有良好生物安全性。此外，主要脏器器官h&e分析结果表明，以pcp-mn-dta为载体的所有处理组均未对机体器官造成损伤(如图16的d图所示)，这再次证实了pcp-mn-dta@gox@1-mt控释系统在体内具有良好的生物安全性。
[0136]
随后在荷瘤小鼠尾静脉注射1-mt和pcp-mn-dta@gox@1-mt来监测pcp-mn-dta@gox@1-mt在体内的药代动力学。对于药代动力学分析，在给药后的特定时间段进行小鼠眼眶取血，肝素化后离心收集血浆，加入乙腈使蛋白沉降；随后离心收集上清液；最后，将收集的样品干燥，重新溶解并通过hplc检测血液中1-mt的浓度，绘制药代动力学曲线。对于小鼠体内药物的分布研究，上述给药处理24h后，安乐处死小鼠，收集心脏，肝脏，肺，脾，肾脏和肿瘤组织，在0.5ml的dmso中匀浆，15000rpm离心15min，最后用hplc检测1-mt在各个组织中的分布，计算单位定义为：mg(控释系统的质量)/g(组织的重量)。结果如图16的e图和f图所示，与游离1-mt组相比，pcp-mn-dta@gox@1-mt组不仅显著延长了载药的血液循环时间，而且还以更高的剂量向肿瘤部位递送并再肿瘤病灶高效积累(其含量是游离的1-mt的近5倍)；另外，该组在肿瘤中积累的药物含量也显著大于其他组织，这归因于peg外层的遮蔽效应、pcp-mn-dta@gox@1-mt控释系统ph响应性的尺寸减小和电荷反转的特性以及epr肿瘤靶向特性。
[0137]
(5)抗肿瘤转移、复发效率及免疫效应的持续性：
[0138]
本发明构建肺转移模型来进一步考察pcp-mn-dta@gox@1-mt控释系统的抗肿瘤转
移作用。在小鼠的尾静脉注射100μl含有1
×
106b16f10肿瘤细胞的pbs溶液，7d后，将小鼠随机分为5组，分别进行不同的给药处理，第10d后，结束给药，安乐死小鼠。收集小鼠的肺组织，用pbs清洗并用相机拍照，计算肺转移结节的数量以此来评估控释系统的抗肿瘤转移效率。之后将小鼠的肺组织保存在10％的福尔马林溶液中，进行h&e染色分析。结果如图17a所示，可以观察到在所有处理组中，pcp-mn-dta@gox@1-mt组的肺组织中仅有极少量的肿瘤转移性结节，且量化统计具有统计学差异(如图17的b图所示)。这表明pcp-mn-dta@gox@1-mt控释系统显著性高效的抑制肿瘤转移。相反，在其他给药处理组中，小鼠肺组织中均有不同程度的肿瘤转移性结节。该结果表明，pcp-mn-dta@gox@1-mt体系具有显著性的抗肿瘤转移作用。
[0139]
为了评价pcp-mn-dta@gox@1-mt控释系统抗肿瘤复发效率及诱导机体免疫效应的持续性，首先，将给药处理后的荷瘤小鼠肿瘤切除，随后，皮下二次注射肿瘤细胞，通过检测二次成瘤小鼠的数量以及机体免疫记忆t细胞水平来揭示机体二次免疫效果及抗肿瘤复发水平，示意图如18的a图所示。实验结果如图18的b图所示，对照组、pcp-mn-dta组及1-mt组处理的小鼠均呈现出较高的肿瘤复发率(100％)；pcp-mn-dta@1-mt组的肿瘤复发率降低至83.3％；而pcp-mn-dta@gox@1-mt处理组将机体的肿瘤复发率显著地降低至33.3％，远远低于其他处理组，表明该组有效地抑制了肿瘤复发。另外，pcp-mn-dta@gox@1-mt组小鼠体内效应记忆t细胞(即可立即提供保护的t
em
，cd3
+
cd8
+
cd62l-cd44
+
)水平显著性增多，同时中枢记忆t细胞(t
cm
，cd3
+
cd8
+
cd62l
+
cd44
+
，只有在抗原刺激的克隆扩增，分化和运输过程中提供保护)水平相应下降(如图18的c图所示)，且与其他处理组具有统计学差异(如图18的d图和e图所示)。结果表明，pcp-mn-dta@gox@1-mt控释系统成功激活了免疫记忆反应，对肿瘤复发具有长期有效的作用。
[0140]
图19是本发明pcp-mn-dta@gox@1-mt控释系统的制备及在体内联合饥饿/氧化/ido免疫治疗的示意图。
[0141]
综上所述，本发明利用mof纳米反应器高负载量、限制酶反应空间、ros响应性可降解等优势制备了一种共负载免疫检查点ido抑制剂1-mt和gox的ph/ros双响应性mof纳米反应控释系统，调控肿瘤饥饿/氧化/ido免疫联合治疗。该纳米体系可以响应弱酸性的肿瘤微环境，诱导尺寸减小/电荷反转，克服体内肿瘤渗透和细胞屏障并提高递送效率。此外，本发明具有自增强mof降解和药物释放性能：一方面，该体系释放的gox在消耗葡萄糖的同时，产生h2o2，通过mn
2+
介导的类fenton反应转化为具有更高毒性的羟基自由基(
·
oh)，介导饥饿/氧化疗法来增强免疫应答；另一方面，该体系释放的1-mt通过阻断ido活性，解除免疫耐受，二者联合高效增强机体抗肿瘤免疫应答，抑制肿瘤生长、转移及复发，达到更好的治疗效果。
[0142]
本技术解决了以下问题：
[0143]
(1)解决生物酶体内递送容易失活等生物利用度低问题：基于mof和纳米反应器各自的优势，拟合成mof纳米反应器，高效负载生物酶，给予酶限制性的反应空间，高保真酶活性的同时，提高其生物利用度。
[0144]
(2)广谱性解决治疗药物体内递送效率低、药物释放不完全等问题：基于100nm左右尺寸大小且表面负电荷载体具有血液长循环特性，以及50nm小尺寸及表面正电荷颗粒具有增强肿瘤渗透和细胞摄取的优势，拟构建ros响应性可降解mn基mof纳米反应器，并在mof
表面功能化引入ph响应性尺寸减小和电荷反转的外壳聚合物peg-cdm-pei，共负载gox及其他治疗药物，从而构建功能mof纳米反应器递送系统；一方面，该体系响应肿瘤微环境低ph信号刺激，断裂外壳共聚物中的桥连分子cdm，进而脱落外壳共聚物peg，并暴露pei(强正电荷特性)功能化接枝的mof载体，诱导载体尺寸减小并反转表面电荷，从而提高肿瘤渗透深度和细胞摄取效率。另一方面，摄取后的载体能响应肿瘤胞内ros刺激，原位降解mof载体并释放负载药物。最后，释放的gox通过竞争性消耗葡萄糖的方式，饥饿肿瘤并产生ros，级联放大mof降解和药物释放。综上，该体系克服了诸多生理屏障，广谱性的提高了药物递送效率。
[0145]
(3)解决由于机体免疫耐受造成的肿瘤免疫治疗效果不理想问题：免疫检查点吲哚胺2,3-双加氧酶(ido)在肿瘤中高表达，可通过催化色氨酸为犬尿氨酸，抑制效应t细胞增殖并诱导调控t细胞(treg)扩增，是一个潜在的肿瘤免疫治疗靶点。已有研究证实，ido竞争性抑制剂—1-甲基色氨酸(1-mt)，能通过抑制ido活性，有效抑制ido介导的免疫逃逸。然而，由于肿瘤免疫原性差及免疫应答不充分，ido阻断疗法临床治疗效果并不理想。
[0146]
基于gox介导的肿瘤饥饿治疗不仅能竞争性消耗肿瘤生长必须的葡萄糖，还能产生ros，饥饿/氧化杀伤肿瘤，从而造成肿瘤免疫原性死亡，提高肿瘤免疫原性并增强机体免疫应答。因此，本研究计划构建mof递送系统，安全高效共递送gox和1-mt到肿瘤病灶，联合1-mt介导的ido阻断免疫疗法和gox激活的饥饿/氧化治疗，抑制机体免疫耐受，并增强机体抗肿瘤免疫应答，从而提高肿瘤免疫治疗效果。
[0147]
虽然本发明已以实施例公开如上，然其并非用于限定本发明，任何本领域技术人员，在不脱离本发明的精神和范围内，均可作各种不同的选择和修改，因此本发明的保护范围由权利要求书及其等同形式所限定。