一种用鱼鳔制备的生物角膜及其制备方法和应用

1.本发明涉及医学和生物工程中的医用材料领域，具体涉及一种用鱼鳔制备的生物角膜及其制备方法和应用。


背景技术：

2.角膜病是全球主要眼病之一，也是重要的致盲性疾病。许多国家发病率逐年增加，近年在一些发展中国家中已成为第二大致盲性眼病。角膜基质层发生病变往往是基质胶原板层排列次序遭到破坏。角膜基质愈合时间需要数月甚至数年，愈合伤口还会产生瘢痕影响角膜清晰度，故基质病变通常都会造成视力影响。基质层的角膜疾病有角膜中央变薄，向前突出呈锥形的圆锥角膜；有大多数表现为常染色体显性遗传，一般是双眼对称发病，与原角膜炎症和全身疾病无关的基质营养不良；有细菌、真菌、病毒、支原体等导致的感染性角膜病。严重的角膜病患需要通过移植健康角膜，替代损伤角膜而获得视力。高发病率和致盲率使得对角膜供体数量的需求逐年增加，有效的眼库系统和足量的角膜外科医生是角膜移植术成功的保障。但是在中国，眼库基础设施不发达，无眼库标准或不完善，角膜供体极其短缺，造成大量患者不能得到及时医治。
3.随着细胞生物学、分子生物学、材料学的不断发展，组织工程技术发展迅速，应用组织工程技术在体外重建人工角膜成为近年来的研究热点。目前用于组织工程人工角膜构建的载体支架材料主要有同种异体角膜（人）、异种脱细胞角膜（猪）、天然生物材料、人工合成材料，但均存在一定的缺点和不足：异种脱细胞角膜基质如猪角膜在制备脱细胞过程中会破坏基质原有结构和成分，影响其透明度和力学强度，移植后也可能引起炎症反应及透明度下降；天然生物材料如胶原、壳聚糖、纤维蛋白等制成的支架其降解速率过快、机械强度欠佳；人工合成材料有时面临生物相容性差的问题，其降解产物可能会对生物体产生一定的毒害作用。因此，制备物理化学性质稳定、高度透明、力学性能良好，同时与种子细胞生物相容性好的支架材料仍然是组织工程角膜领域需要攻克的难点。


技术实现要素：

4.本发明的目的在于克服现有技术的缺点，提供一种成分、结构与天然角膜相似，具有优异的光学特性和力学性能，生物相容性良好，用鱼鳔制备的生物角膜；本发明的第二目的在于提供用鱼鳔制备生物角膜的方法；本发明的第三目的在于提供用鱼鳔制备的生物角膜在组织工程角膜领域中的应用。
5.本发明的目的通过以下技术方案来实现：一种用鱼鳔制备生物角膜的方法，将新鲜鱼鳔除杂后进行脱脂、脱糖和冻融处理，再加入脱细胞液得到鱼鳔的脱细胞基质，将所述脱细胞基质用含有透光性调节剂的醇水混合液进行胶原纤维重建处理得到人工生物角膜。
6.进一步地，所述透光性调节剂为甲醛、戊二醛、1,4-丁二醇二缩水甘油醚、丙二醇二缩水甘油醚、乙二醇二缩水甘油醚、丙三醇三缩水甘油醚、3-(全氟正辛基)-1,2-环氧丙
烷、乙醛酸、己异二氰酸酯、叠氮二苯基磷、姜黄素、原花青素、茶多酚和表没食子儿茶素没食子酸酯中的至少一种。
7.进一步地，所述含有透光性调节剂的醇水混合液中透光性调节剂的质量百分含量为0.5～10%，醇水混合液中醇的含量为5～95%，所述醇为甲醇、乙醇、乙二醇和丙三醇中的至少一种。
8.进一步地，所述鱼鳔选自鲤鱼、草鱼、鲫鱼、鲢鱼、青鱼、鳙鱼、鳊鱼、黄花鱼、鲟鱼或鲅鱼中的任意一种。
9.进一步地，所述脱脂处理的方法为：除杂后的新鲜鱼鳔中加入脱脂液，控制摇床的速度为50～150 r/min，脱脂处理0.5～2h，其中，所述脱脂液为a液和b液的混合溶液，所述a液为二氯甲烷、三氯甲烷、四氯化碳、三氯乙烯、四氯乙烯中的至少一种，所述b液为甲醇、乙醇或丙三醇中至少一种，a液与b液的体积比为0.1～10:1。
10.进一步地，所述脱糖处理的方法为：脱脂处理后的鱼鳔中加入质量百分含量为1～10%的氯化钠溶液，控制摇床速度为50～150 r/min，脱糖处理0.5～2h。
11.进一步地，鱼鳔冻融后先加入脱细胞液ⅰ置于摇床处理2～72h，再加入脱细胞液ⅱ摇床处理2～72h，控制摇床的速度为100～200 r/min；其中，所述脱细胞液ⅰ的溶质为十二烷基硫酸钠、脱氧胆酸钠、曲拉通x-100、曲拉通x-200、3-［(3-胆固醇氨丙基)二甲基氨基］-1-丙磺酸、盐酸、过氧乙酸、乙二胺四乙酸、乙二醇四乙酸、氢氧化钠和甘油中的至少一种，所述脱细胞液ⅱ的溶质为核酸酶、胰蛋白酶、中性蛋白酶、磷脂酶a2、嗜热菌蛋白酶、α-半乳糖苷酶和脂肪酶中的至少一种。
12.进一步地，所述脱细胞液ⅰ的质量百分比含量为0.5～10%，所述脱细胞液ⅱ的浓度为0.5～100 μg/ml。
13.上述的方法制备的人工生物角膜。
14.上述的人工生物角膜在角膜移植、角膜板层修复中作为医用材料的应用。
15.鱼鳔是存在于大多数硬骨鱼中的膜性器官，通过不断收缩和膨胀以调节空气含量，进而不断变换在水中的位置。鱼鳔的主要组成为ⅰ型胶原蛋白，其中提取的胶原蛋白具有良好的组织相容性、低抗原性、可降解性，以及促进细胞黏附并生长增殖等良好的理化性质。鱼鳔源生物膜材料也已经被研究拥有优良的抗钙化能力与力学性能，可应用于硬脑膜、血管、皮肤等的修复领域。根据已有天然生物材料鱼鳔的成分研究，本发明针对组织工程角膜以往的研究难点，选用鱼鳔作为原材料。鱼鳔主要成分为ⅰ型胶原蛋白但是其透光性不好，未处理的鱼鳔完全达不到组织工程角膜的透光要求，本发明创新性地用含有透光性调节剂的醇水混合液重建处理鱼鳔增加其透光率，而非已有采用刻蚀的方法提高生物材料的透光性，并改善了鱼鳔其它的物理化学性能。本发明选择合适的透光性调节剂，再通过透光性调节剂溶剂的选择，极大地提高了材料的透光性，经检验处理后的材料力学性能增强，生物相容性良好，稳定性强，有希望成功应用于组织工程角膜临床修复领域。
16.本发明具有以下优点：（1）本发明中用鱼鳔作为制备生物角膜的材料，所获得的生物角膜在成分上与天然角膜非常接近，具有优异的光学特性和极佳的机械性能，经检测，本发明方法制备的鱼鳔生物角膜在可见光波长范围内的透光率为80％～95％，有效改善了采用鱼鳔制备的生物角膜的透光性，与隐形眼镜的透光性十分接近，可以实现提高或恢复视力的目的，且生物相容
性良好，满足组织工程角膜对支架材料的要求。
17.（2）本发明的制备方法避免了基质层内纤维出现溶胀，纤维排列紊乱，进而影响材料透光性和力学强度的现象。通过体外培养细胞，表现优良的生物相容性，无细胞毒性，角膜细胞能够在材料表面正常粘附和生长，形成致密的细胞层。
18.（3）本发明采用鱼鳔制备的生物角膜是一种潜在优良的角膜替代物，将可用于角膜炎、角膜营养不良、角膜变性等各类角膜板层移植适应症，将可直接应用于各类角膜病的临床移植和治疗；且原料来源广泛、生产成本低，方便保存，便于使用，可满足组织工程角膜大量载体支架的需要。
附图说明
19.图1为鱼鳔材料层状结构的扫描电镜截面照片。
20.图2为鱼鳔经本发明方法处理前后的对比图。
21.图3为鱼鳔经本发明方法处理前后在可见光波长范围内的透光率曲线图。
22.图4为本发明方法制备的生物角膜上培养l929细胞的细胞存活率图。
23.图5为本发明方法制备的生物角膜上培养兔角膜基质细胞光学显微镜照片。
具体实施方式
24.下面结合附图及实施例对本发明做进一步的描述，本发明的保护范围不局限于以下所述：实施例1：一种用鱼鳔制备生物角膜的方法，将新鲜鲅鱼的鱼鳔除杂后进行脱脂、脱糖和冻融处理，再加入脱细胞液得到鱼鳔的脱细胞基质，将所述脱细胞基质用含有透光性调节剂的醇水混合液重建处理得到人工生物角膜。
25.具体的制备方法为：新鲜鲅鱼鱼鳔除杂后加入二氯甲烷和乙醇的混合溶液，二氯甲烷和乙醇的体积比为0.1:1，控制摇床的速度为50 r/min，脱脂处理0.5h；脱脂处理后的鱼鳔中加入质量百分含量为1%的氯化钠溶液，控制摇床速度为50 r/min，脱糖处理0.5h；脱糖处理后将鱼鳔冻融后先加入质量百分比含量为0.5%的十二烷基硫酸钠溶液置于摇床处理2h，再加入浓度为0.5 μg/ml胰蛋白酶溶液摇床处理2h，控制摇床的速度为100 r/min，得到鱼鳔的脱细胞基质；脱细胞基质中加入含有透光性调节剂戊二醛的醇水混合液进行胶原纤维重建处理，所述含有透光性调节剂的甲醇水混合液中透光性调节剂的质量百分含量为0.5%，醇水混合液中醇为甲醇，含量为5%；将处理后的鱼鳔置于开盖细胞培养孔板中，双面紫外灭菌各30min，紫外辐照能量100 mj/cm2，得到人工生物角膜。
26.实施例2：一种用鱼鳔制备生物角膜的方法，将新鲜鲢鱼的鱼鳔除杂后进行脱脂、脱糖和冻融处理，再加入脱细胞液得到鱼鳔的脱细胞基质，将所述脱细胞基质用含有透光性调节剂
的醇水混合液重建处理得到人工生物角膜。
27.具体的制备方法为：新鲜鲢鱼鱼鳔除杂后加入脱脂液，所述脱脂液为a液和b液的混合溶液，所述a液为四氯化碳和三氯乙烯的混合液，所述b液为甲醇和乙醇的混合液，a液与b液的体积比为10:1，控制摇床的速度为150 r/min，脱脂处理2h；脱脂处理后的鱼鳔中加入质量百分含量为10%的氯化钠溶液，控制摇床速度为150 r/min，脱糖处理2h；脱糖处理后将鱼鳔冻融后先加入脱细胞液ⅰ置于摇床处理72h，再加入脱细胞液ⅱ摇床处理72h，控制摇床的速度为200 r/min；其中，所述脱细胞液ⅰ为脱氧胆酸钠、曲拉通x-100、和3-［(3-胆固醇氨丙基)二甲基氨基］-1-丙磺酸的混合液，所述脱细胞液ⅰ的质量百分比含量为10%，所述脱细胞液ⅱ为中性蛋白酶、磷脂酶a2和嗜热菌蛋白酶的混合液，所述脱细胞液ⅱ的浓度为100 μg/ml，得到鱼鳔的脱细胞基质；脱细胞基质中加入含有透光性调节剂的醇水混合液进行胶原纤维重建处理，所述透光性调节剂为乙二醇二缩水甘油醚、丙三醇三缩水甘油醚、3-(全氟正辛基)-1,2-环氧丙烷和茶多酚，所述含有透光性调节剂的醇水混合液中透光性调节剂的质量百分含量为10%，醇水混合液中醇的含量为95%，所述醇为乙醇、乙二醇和丙三醇的混合液；将处理后的鱼鳔置于开盖细胞培养孔板中，双面紫外灭菌各60min，紫外辐照能量300 mj/cm2，得到人工生物角膜。
28.实施例3：一种用鱼鳔制备生物角膜的方法，将新鲜鲤鱼的鱼鳔除杂后进行脱脂、脱糖和冻融处理，再加入脱细胞液得到鱼鳔的脱细胞基质，将所述脱细胞基质用含有透光性调节剂的醇水混合液重建处理得到人工生物角膜。
29.具体的制备方法为：新鲜鲤鱼鱼鳔除杂后加入脱脂液，所述为a液和b液的混合溶液，所述a液为二氯甲烷、三氯乙烯和四氯乙烯的混合液，所述b液为甲醇、乙醇和丙三醇的混合液，a液与b液的体积比为3:1，控制摇床的速度为80 r/min，脱脂处理1h；脱脂处理后的鱼鳔中加入质量百分含量为3%的氯化钠溶液，控制摇床速度为85 r/min，脱糖处理1h；脱糖处理后将鱼鳔冻融后先加入脱细胞液ⅰ置于摇床处理22h，再加入脱细胞液ⅱ摇床处理30h，控制摇床的速度为180 r/min；其中，所述脱细胞液ⅰ为曲拉通x-200、3-［(3-胆固醇氨丙基)二甲基氨基］-1-丙磺酸、盐酸和过氧乙酸的混合液，所述脱细胞液ⅰ的质量百分比含量为3.5%，所述脱细胞液ⅱ为核酸酶、胰蛋白酶、中性蛋白酶、磷脂酶a2、嗜热菌蛋白酶、α-半乳糖苷酶和脂肪酶的混合液，所述脱细胞液ⅱ的浓度为28 μg/ml，得到鱼鳔的脱细胞基质；脱细胞基质中加入含有透光性调节剂的醇水混合液进行胶原纤维重建处理，所述透光性调节剂为丙二醇二缩水甘油醚、乙二醇二缩水甘油醚、丙三醇三缩水甘油醚和叠氮二苯基磷，所述含有透光性调节剂的醇水混合液中透光性调节剂的质量百分含量为3%，醇水混合液中醇为丙三醇，含量为28%；将处理后的鱼鳔置于开盖细胞培养孔板中，双面紫外灭菌各40min，紫外辐照能量
180 mj/cm2，得到人工生物角膜。
30.实施例4：一种用鱼鳔制备生物角膜的方法，将新鲜鳙鱼的鱼鳔除杂后进行脱脂、脱糖和冻融处理，再加入脱细胞液得到鱼鳔的脱细胞基质，将所述脱细胞基质用含有透光性调节剂的醇水混合液重建处理得到人工生物角膜。
31.具体的制备方法为：新鲜鳙鱼鱼鳔除杂后加入脱脂液，脱脂液为a液和b液的混合溶液，所述a液为二氯甲烷、三氯甲烷、四氯化碳和三氯乙烯的混合液，所述b液为甲醇，a液与b液的体积比为8:1，控制摇床的速度为120 r/min，脱脂处理1.5h；脱脂处理后的鱼鳔中加入质量百分含量为7%的氯化钠溶液，控制摇床速度为125 r/min，脱糖处理1.5h；脱糖处理后将鱼鳔冻融后先加入脱细胞液ⅰ置于摇床处理50h，再加入脱细胞液ⅱ摇床处理60h，控制摇床的速度为180 r/min；其中，所述脱细胞液ⅰ为十二烷基硫酸钠、脱氧胆酸钠、曲拉通x-100、曲拉通x-200、3-［(3-胆固醇氨丙基)二甲基氨基］-1-丙磺酸、盐酸、过氧乙酸、乙二胺四乙酸、乙二醇四乙酸、氢氧化钠和甘油的混合液，所述脱细胞液ⅰ的质量百分比含量为8%，所述脱细胞液ⅱ为核酸酶、胰蛋白酶、中性蛋白酶和嗜热菌蛋白酶的混合液，所述脱细胞液ⅱ的浓度为80 μg/ml，得到鱼鳔的脱细胞基质；脱细胞基质中加入含有透光性调节剂的醇水混合液进行胶原纤维重建处理，所述透光性调节剂为甲醛、戊二醛、1,4-丁二醇二缩水甘油醚、丙二醇二缩水甘油醚、乙二醇二缩水甘油醚、丙三醇三缩水甘油醚、3-(全氟正辛基)-1,2-环氧丙烷、乙醛酸、己异二氰酸酯、叠氮二苯基磷、姜黄素、原花青素、茶多酚和表没食子儿茶素没食子酸酯，所述含有透光性调节剂的醇水混合液中透光性调节剂的质量百分含量为7.8%，醇水混合液中醇的含量为82%，所述醇为甲醇、乙醇和乙二醇的混合物；将处理后的鱼鳔置于开盖细胞培养孔板中，双面紫外灭菌各48min，紫外辐照能量260 mj/cm2，得到人工生物角膜。
32.本发明中鱼鳔可以为鲤鱼、草鱼、鲫鱼、鲢鱼、青鱼、鳙鱼、鳊鱼、黄花鱼、鲟鱼或鲅鱼的鱼鳔，透光性调节剂为甲醛、戊二醛、1,4-丁二醇二缩水甘油醚、丙二醇二缩水甘油醚、乙二醇二缩水甘油醚、丙三醇三缩水甘油醚、3-(全氟正辛基)-1,2-环氧丙烷、乙醛酸、己异二氰酸酯、叠氮二苯基磷、姜黄素、原花青素、茶多酚和表没食子儿茶素没食子酸酯中的一种或多种的组合；脱脂液中a液为二氯甲烷、三氯甲烷、四氯化碳、三氯乙烯、四氯乙烯中的至少一种，b液为甲醇、乙醇或丙三醇中至少一种；脱细胞液ⅰ的溶质为十二烷基硫酸钠、脱氧胆酸钠、曲拉通x-100、曲拉通x-200、3-［(3-胆固醇氨丙基)二甲基氨基］-1-丙磺酸、盐酸、过氧乙酸、乙二胺四乙酸、乙二醇四乙酸、氢氧化钠和甘油中的至少一种，脱细胞液ⅱ的溶质为核酸酶、胰蛋白酶、中性蛋白酶、磷脂酶a2、嗜热菌蛋白酶、α-半乳糖苷酶和脂肪酶中的至少一种。本发明具体实施方式中只是列举了最佳的实施组合，未列举的其他组合和内容只需进行等同替换或改变即可，因此不再一一列出。
33.以下通过实验说明本发明的有益效果：实验例1：取新鲜鲤鱼鱼鳔，对鱼鳔横截面结构进行表征，将鱼鳔进行冻干处理之后，修剪成
合适大小置于样品桩，放入真空喷镀仪进行喷金处理，再进行扫描电子显微镜观察，得到本实验例的鱼鳔材料层状结构在扫描电镜截面图，如图1所示。
34.实验例2：利用紫外可见分光光度计在可见光波长范围（400-800nm）内测定处理前后的新鲜鲤鱼鱼鳔样品以及海昌隐形眼镜的透光率，绘制透光率曲线，观察鱼鳔经本发明方法处理前后透明度变化以及与隐形眼镜透光性作对比，鱼鳔处理前后拍照观察如图2所示，处理后的采用鲤鱼鱼鳔制备的生物角膜在可见光波长范围内的透光率为80％～95％，如图3所示。
35.处理方法具体如下：水中清洗新鲜的鲤鱼鱼鳔，去掉表面杂质后进行剪裁；进行脱脂、糖脱除处理：新鲜鲤鱼鱼鳔除杂后加入四氯化碳和乙醇的混合溶液，四氯化碳和乙醇的体积比3:1，控制摇床的速度为80 r/min，脱脂处理1h；脱脂处理后的鱼鳔中加入质量百分含量为3%的氯化钠溶液，控制摇床速度为85 r/min，脱糖处理1h；脱脂脱糖后进行多次冻融，再将冻融后的鱼鳔放置于1%乙二胺四乙酸溶液中常温处理24h，控制摇床速度为120 r/min；放置于25
µ
g/ml α-半乳糖苷酶溶液中摇晃处理6h，控制摇床速度为120 r/min；之后用无菌pbs溶液中漂洗12h；将所述脱细胞基质置于0.5%乙二醇二缩水甘油醚的甲醇溶液中处理12h，得到鱼鳔的透光性改善的脱细胞基质；将上述得到透光性改善的脱细胞基质浸泡于纯水中，控温超声清洗1-2h；然后紫外灭菌，所述紫外灭菌为将鱼鳔置于开盖细胞培养孔板中，双面紫外灭菌各40min，紫外辐照能量220 mj/cm2，再用75%乙醇浸泡过夜，清洗保存。
36.实验例3：将本发明实验例2处理后的鲤鱼鱼鳔灭菌处理之后进行cck-8检测细胞毒性实验，在96孔板内接种适宜浓度的l929细胞，经完全培养基与浸提液培养之后，1/3/5day，定点，在孔板内加入适量cck-8试剂检测吸光度值进行对比，如图4所示，得出材料生物相容性良好；在光镜下，本发明方法处理后的材料上的兔角膜基质细胞良好附着，如图5。
37.以上所述，仅为本发明较佳的具体实施方式，但本发明的保护范围并不局限于此，任何熟悉本技术领域的技术人员在本发明揭露的技术范围内，根据本发明的技术方案及其发明构思加以等同替换或改变，都涵盖在本发明的保护范围之内。