1.本发明涉及鼻咽癌治疗技术领域，具体为一种鼻咽癌治疗药物的制备方法。
背景技术：
2.鼻咽癌是东南亚地区常见的恶性肿瘤之一，发病率高达(10～30)/10万，具体发病机制尚不明确，目前普遍认为与遗传环境因素eb病毒感染等密切相关由于鼻咽部解剖位置特殊，结构复杂，手术难以完整切除，病理分型常以低分化鳞癌最为多见，放射治疗一直是鼻咽癌的首选治疗方法。因其恶性程度高，呈浸润性生长，可直接侵犯周围及邻近组织和器官，且淋巴结转移发生早，转移率极高由于早期症状不典型，确诊时70％～80％患者发现颈淋巴结转移，40％～50％发生双侧颈部淋巴结转移鼻咽癌通常对放化疗敏感，早期患者5年生存率高达95％，而iii、iv期仅为62％和40％，疗效很不理想，导致中晚期鼻咽癌放疗失败的原因主要是局部肿瘤残留，放射抵抗以及远处转移。
3.长期以来，晚期鼻咽癌都是以化疗为主，不仅治疗效果不理想，治疗给患者带来的痛苦也特别大。出现高效、低毒的靶向药物以及新的治疗手段，是鼻咽癌治疗的迫切需求。
4.对于鼻咽癌患者来讲，由于鼻咽位置深在，鼻咽上方为颅底、后方是脑干和颈椎、前方是鼻后孔，癌肿多向颅底、颈动脉鞘区及咽旁间隙不同程度浸润，上颈部淋巴结转移率高，手术无法彻底切除原发灶及颈转移灶。另外鼻咽癌多为低分化鳞癌，对放疗敏感，原发灶及颈部淋巴引流区又容易包括在照射靶区内，因此放射治疗是其首选的治疗手段。
5.放疗剂量包括根治性剂量和姑息性剂量。在鼻咽癌患者治疗初始，多抱有根治的目的，因此多以根治性剂量为主。如果是普通放疗或调强适形治疗，在医院的时间大概1个半月左右。价格比较昂贵，普通家庭无法承受。
6.基于此，本发明设计了一种鼻咽癌治疗药物的制备方法，以解决上述问题。
技术实现要素：
7.本发明的目的在于提供一种鼻咽癌治疗药物的制备方法，以解决上述背景技术中提出的问题。
8.为实现上述目的，本发明提供如下技术方案：
9.一种鼻咽癌治疗药物的制备方法，包括步骤一、蛇毒氧化酶分离纯化；步骤二、中药联合制剂；步骤三、合成制剂；
10.具体的，
11.所述步骤一中，包括1.1、磷酸缓冲液熔解蛇毒；1.2、去除热原；1.3、超滤纯化；1.4、透析；1.5、去除高丰蛋白；1.6、离心换液；1.7、脱盐； 1.8二次透；1.9、浓缩；1.10、搜集浓缩后蛇毒液体，冷藏备用；
12.所述步骤二中，中药制剂包括：夏枯草10克,蒲公英30克，巴豆10克，独活10克，没药10g，白花蛇舌草12克，益母草10克，人参8克；首先，取所述药材按此比例进行煎熬，头煎从沸后小火煎煮30-40分钟左右，第二煎药沸后煎20-30分钟；再收集中药汤剂，依次进行澄
清，过滤；超滤提纯；脱盐；浓缩；
13.所述步骤三中，取所述步骤一和步骤二中的蛇毒氧化酶浓缩液与中药合成制剂浓缩后，添加乳蛋白与青蒿淀粉，青蒿淀粉与乳蛋白比例约为80％；以青蒿淀粉为壁材，壁材粉碎到90目以上，混合均匀；搅拌过程中，加入10ml 抑制剂液体；合成制剂充分水化后，经过匀质20-40mpa下匀质4-6次，得到稳定乳液；乳液采取高温处理与酶法交流方法，合成制剂呈固态或半固态。固态或半固态合成制剂采用喷雾干燥变成固态粉末。
14.作为本发明的进一步方案，所述步骤一中，
15.具体的，
16.1.1、磷酸缓冲液熔解蛇毒：取尖吻蝮蛇蛇毒20g，加入160ml 10.01mph7.6 的磷酸缓冲液溶解；
17.1.2、去除热原：超滤法去除热原与细菌；
18.1.3、超滤纯化：上样池，支持管和50ml离心管(交换组合)进行超滤纯化。交套组0.5超滤管，采用≤1000μl树脂(沉降体积)，依照结合
→
漂洗
→
换液的操作步骤进行超滤纯化；
19.1.4、透析：将超滤纯化后的蛇毒溶液倒入透析袋内，在4℃用体积3倍的磷酸缓冲透析约12个小时，换液6-8次
20.1.5、去除高丰蛋白：交换套组由上样池，支持管和50ml离心管，采用≤200μl树脂按照结合
→
漂洗
→
换液的操作步骤进行去除高丰度蛋白。
21.作为本发明的进一步方案，所述步骤一中1.6、离心换液；具体的，包括：
22.1)在上样池中加入200μl亲和纯化树脂(根据融合标签选择，50％悬浊液)和1.5ml漂洗缓冲液，1,000
×
g离心1min；
23.2)加入0.5ml样品并与树脂吸打混匀，孵育1h，其间可温和搅动促进结合；
24.3)1,000
×
g离心1min以去除未结合杂质；
25.4)加入1.5ml漂洗缓冲液，1,000
×
g离心1min；
26.5)上样池下端接上0.5ml超滤管；
27.6)加入1ml洗脱缓冲液与树脂混匀。孵育5min；
28.7)4,000
×
g离心15min；
29.8)加上蛋白样品最终需要的缓冲液1.5ml。4,000
×
g离心15min，置换缓冲液的同时进行浓缩；
30.9)倒转0.5ml超滤管，1,000
×
g离心回收纯化和浓缩好的蛋白。
31.作为本发明的进一步方案，所述步骤一中1.7、脱盐；具体的，包括：
32.1)在上样池中加入0.5ml tbs-t预湿，1,000
×
g离心1min；
33.2)优化选做：加入1.5ml用于置换的缓冲液，1,000
×
g离心1min；
34.3)上样池下端接上0.5ml超滤管；
35.4)加入1.5ml样品，4,000
×
g离心15min进行浓缩。
36.5)加入1.5ml需要置换的缓冲液，4,000
×
g离心15min，换液的同时进行浓缩。
37.6)倒转0.5ml超滤管，1,000
×
g离心回收处理好的蛋白。
38.作为本发明的进一步方案，所述步骤一中1.8二次透；具体的，包括：
39.1)用真空抽滤对样品进行澄清；
40.2)0.22μm millipore express plus(pes)膜用pbs平衡超滤管，4000g 离心x10min；
41.3)从超滤管内管及收集管吸走pbs；
42.4)向超滤管加入15ml样品；
43.5)4000g离心30min浓缩；
44.6)倒空收集管；
45.7)加入14ml pbs进行缓冲液置换，温柔吸打样品数次；
46.8)1000g离心10min；
47.9)从浓缩管吸回处理好的样品。
48.作为本发明的进一步方案，所述步骤一中1.9、浓缩；具体的，用于15-70ml 生物溶液的快速浓缩等操作；70ml的样品在25分钟内浓缩至350μl。
49.与现有技术相比，本发明的有益效果为：
50.1.蛇毒氧化酶具有显著的抗鼻咽癌癌细胞活性。
51.2.蛇毒氧化酶能够强烈抑制癌细胞转移，抑制癌细胞扩散。
52.3.蛇毒氧化酶联合伊维莫司应用于治疗，提高治疗指数6倍。
具体实施方式
53.下面将结合本发明实施例，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有作出创造性劳动前提下所获得的所有其它实施例，都属于本发明保护的范围。
54.在实际应用中，一种鼻咽癌治疗药物的制备方法，包括步骤一、蛇毒氧化酶分离纯化；步骤二、中药联合制剂；步骤三、合成制剂；
55.具体的，
56.所述步骤一中，包括1.1、磷酸缓冲液熔解蛇毒；1.2、去除热原；1.3、超滤纯化；1.4、透析；1.5、去除高丰蛋白；1.6、离心换液；1.7、脱盐； 1.8二次透；1.9、浓缩；1.10、搜集浓缩后蛇毒液体，冷藏备用；
57.所述步骤二中，中药制剂包括：夏枯草10克,蒲公英30克，巴豆10克，独活10克，没药10g，白花蛇舌草12克，益母草10克，人参8克；首先，取所述药材按此比例进行煎熬，头煎从沸后小火煎煮30-40分钟左右，第二煎药沸后煎20-30分钟；再收集中药汤剂，依次进行澄清，过滤；超滤提纯；脱盐；浓缩；
58.所述步骤三中，取所述步骤一和步骤二中的蛇毒氧化酶浓缩液与中药合成制剂浓缩后，添加乳蛋白与青蒿淀粉，青蒿淀粉与乳蛋白比例约为80％；以青蒿淀粉为壁材，壁材粉碎到90目以上，混合均匀；搅拌过程中，加入10ml 抑制剂液体；合成制剂充分水化后，经过匀质20-40mpa下匀质4-6次，得到稳定乳液；乳液采取高温处理与酶法交流方法，合成制剂呈固态或半固态。固态或半固态合成制剂采用喷雾干燥变成固态粉末。
59.所述步骤一中，
60.具体的，
61.1.1、磷酸缓冲液熔解蛇毒：取尖吻蝮蛇蛇毒20g，加入160ml 10.01mph7.6 的磷酸
缓冲液溶解；
62.1.2、去除热原：超滤法去除热原与细菌；
63.1.3、超滤纯化：上样池，支持管和50ml离心管(交换组合)进行超滤纯化。交套组0.5超滤管，采用≤1000μl树脂(沉降体积)，依照结合
→
漂洗
→
换液的操作步骤进行超滤纯化；
64.1.4、透析：将超滤纯化后的蛇毒溶液倒入透析袋内，在4℃用体积3倍的磷酸缓冲透析约12个小时，换液6-8次；
65.1.5、去除高丰蛋白：交换套组由上样池，支持管和50ml离心管，采用≤200μl树脂按照结合
→
漂洗
→
换液的操作步骤进行去除高丰度蛋白。
66.所述步骤一中1.6、离心换液；具体的，包括：
67.1)在上样池中加入200μl亲和纯化树脂(根据融合标签选择，50％悬浊液)和1.5ml漂洗缓冲液，1,000
×
g离心1min；
68.2)加入0.5ml样品并与树脂吸打混匀，孵育1h，其间可温和搅动促进结合；
69.3)1,000
×
g离心1min以去除未结合杂质；
70.4)加入1.5ml漂洗缓冲液，1,000
×
g离心1min；
71.5)上样池下端接上0.5ml超滤管(有5种截留分子量规格可选)；
72.6)加入1ml洗脱缓冲液与树脂混匀。孵育5min；
73.7)4,000
×
g离心15min；
74.8)加上蛋白样品最终需要的缓冲液1.5ml。4,000
×
g离心15min，置换缓冲液的同时进行浓缩；
75.9)倒转0.5ml超滤管，1,000
×
g离心回收纯化和浓缩好的蛋白。
76.所述步骤一中1.7、脱盐；具体的，包括：
77.1)在上样池中加入0.5ml tbs-t预湿，1,000
×
g离心1min；
78.2)优化选做：加入1.5ml用于置换的缓冲液，1,000
×
g离心1min；
79.3)上样池下端接上0.5ml超滤管(有5种截留分子量规格可选)；
80.4)加入1.5ml样品，4,000
×
g离心15min进行浓缩；
81.5)加入1.5ml需要置换的缓冲液，4,000
×
g离心15min，换液的同时进行浓缩；
82.6)倒转0.5ml超滤管，1,000
×
g离心回收处理好的蛋白。
83.所述步骤一中1.8二次透；具体的，包括：
84.1)用真空抽滤对样品进行澄清；
85.2)0.22μm millipore express plus(pes)膜用pbs平衡超滤管，4000g 离心x10min；
86.3)从超滤管内管及收集管吸走pbs；
87.4)向超滤管加入15ml样品；
88.5)4000g离心30min浓缩；
89.6)倒空收集管；
90.7)加入14ml pbs进行缓冲液置换，温柔吸打样品数次；
91.8)1000g离心10min；
92.9)从浓缩管吸回处理好的样品。
93.所述步骤一中1.9、浓缩；具体的，用于15-70ml生物溶液的快速浓缩等操作；70ml的样品在25分钟内浓缩至350μl。
94.最大离心力3,500xg；聚丙烯离心管，直径60mm,长度121mm，有效膜面积19cm2；截留分子量100kda，牛lgg片段ii,1mg/ml,目的蛋白回收率91％。
95.步骤二、中药联合制剂。中药制剂包括：夏枯草10克,蒲公英30克，巴豆10克，独活10克，没药10g，白花蛇舌草12克，益母草10克，人参8克。
96.中药按此比例进行煎熬，头煎从沸后小火煎煮30-40分钟左右，第二煎药沸后煎20-30分钟。
97.1.收集中药汤剂，进行澄清，过滤；
98.微滤膜由规则、连续的网状多聚物构成，具有精确的孔径，用来截留细菌、胶体及微小颗粒，将大小在0.025μm到10.0μm之间的颗粒物或生物体从溶液中除去。
99.2.超滤提纯；
100.1)超滤膜(右)通常有两个明显的分层：致密的表层，厚0.1-1.5μm，孔径下层是多孔支撑物。
101.2)0.1μm膜孔
102.3)采用高回收率的亲水(pvdf)膜和亲水ptfe膜
103.3)配合1.5ml离心管固定转子(mc)或15ml离心管转子使用
104.3.脱盐；
105.采用ultra-0.5超滤管，除盐100％，3次离心。蛋白得率92.2％。操作时间约60分钟，蛋白活性3.9。
106.4.浓缩；
107.除盐后，加入10克抑制剂后，采用截留分子量100kda的离心浓缩装置内，上样体积约为70ml，采取做大离心力3500xg，再生纤维膜，直径60mm，长度121mm，有效膜面积19cm2，目的蛋白回收率约为91％。
108.浓缩最小体积为550μl。
109.步骤三、合成制剂：
110.蛇毒氧化酶浓缩液与中药合成制剂浓缩后，添加乳蛋白与青蒿淀粉，青蒿淀粉与乳蛋白比例约为80％。以青蒿淀粉为壁材，壁材粉碎到90目以上，混合均匀。搅拌过程中，加入10ml抑制剂液体。合成制剂充分水化后，经过匀质20-40mpa下匀质4-6次，得到稳定乳液。乳液采取高温处理与酶法交流方法，合成制剂呈固态或半固态。固态或半固态合成制剂采用喷雾干燥变成固态粉末。
111.固态粉末与储藏极为方便，保质期可在两年以上。固态粉末既可以作为针剂使用，也可以做成丸剂口服。
112.蛇毒氧化酶浓缩液与中药合成制剂浓缩后，添加乳蛋白与青蒿淀粉，青蒿淀粉与乳蛋白比例约为80％。以青蒿淀粉为壁材，壁材粉碎到90目以上，混合均匀。搅拌过程中，加入10ml抑制剂液体。合成制剂充分水化后，经过匀质20-40mpa下匀质4-6次，得到稳定乳液。乳液采取高温处理与酶法交流方法，合成制剂呈固态或半固态。固态或半固态合成制剂采用喷雾干燥变成固态粉末。
113.在鼻咽癌治疗过程中，需与伊维莫司配合使用，治疗效果预期能杀死75％左右的鼻咽癌细胞。本发明可以有效治疗鼻咽癌，缓解患者病痛。长期治疗，可以使鼻咽癌患者完全康复。
114.此外，文中所述巴豆，主要作用催吐；兴奋肠肌；增加胆汁和胰腺分泌；抗病原微生物；抗肿瘤；
115.煎剂对金黄色葡萄球菌、流感杆菌等在体外均有一定抑制作用，对小鼠艾氏腹水癌等有明显抑制作用。
116.本发明同样适用于放/化疗后的其他癌症的治疗，如胃癌、肝癌、肺癌、食管癌、直结肠肛门癌、白血癌、宫颈癌、鼻咽癌、乳腺癌和膀胱癌等。
117.以上公开的本发明优选实施例只是用于帮助阐述本发明。优选实施例并没有详尽叙述所有的细节，也不限制该发明仅为所述的具体实施方式。显然，根据本说明书的内容，可作很多的修改和变化。本说明书选取并具体描述这些实施例，是为了更好地解释本发明的原理和实际应用，从而使所属技术领域技术人员能很好地理解和利用本发明。本发明仅受权利要求书及其全部范围和等效物的限制。