夏枯草提取物在制备改善妊娠结局的药物中的应用的制作方法

1.本发明属于生物医药技术领域，涉及夏枯草提取物在制备改善妊娠结局的药物中的应用。


背景技术：

2.自身免疫性甲状腺炎(ait)是一种常见的器官特异性自体免疫性疾病，约占总人口的1％，女性的发病率是男性的10倍。常见于育龄妇女，与不孕、流产和早产(ptb)等妊娠障碍密切相关。目前，该疾病的发病机制和有效的治疗策略尚不明确。由于对甲状腺激素需求的增加，atas阳性的甲状腺功能正常妇女可能会在怀孕期间发生甲状腺功能减退。一般来说，甲状腺功能减退可以通过每日固定剂量的左甲状腺素(lt4)得到充分治疗，这可以降低甲状腺功能减退妇女的不育率。然而，长期的lt4替代治疗会对患者的认知功能造成持久的损害，此外，也有研究表示不推荐lt4用于缓解妊娠甲状腺正常妇女的甲状腺炎。因此，对于患有ait的孕妇来说，有效的治疗方法仍然受限。
3.因此如何开发一种药物或方法以改善ait和其他常见甲状腺疾病，改善妊娠结局，成为了本领域技术人员亟待解决的问题。


技术实现要素：

4.针对现有技术的不足，本发明的目的在于提供夏枯草提取物在制备改善妊娠结局的药物中的应用。
5.为达到此发明目的，本发明采用以下技术方案：
6.第一方面，本发明提供夏枯草提取物在制备改善妊娠结局的药物中的应用。
7.夏枯草是唇形科一种药食同源植物，其作为一种传统草药被经验性地用于治疗高血压、肝炎、结核病和糖尿病等疾病。药理研究表明，夏枯草可以促进淋巴细胞增殖。此外，其中的生物活性成分具有抗炎、抗菌、抗病毒和抗肿瘤活性的功效。
8.本发明首次发现适当剂量的夏枯草提取物可显著促进胎儿发育，改善妊娠结局。所述夏枯草提取物可通过抑制th1/th17免疫应答、促进激活treg细胞功能、重新平衡细胞因子谱等途径来进行妊娠期免疫系统的调节，在制备改善妊娠结局的药物中具有重要的应用价值。
9.优选地，所述夏枯草提取物是由包括如下步骤的提取方法提取得到的：将夏枯草果穗与溶剂混合，进行提取，过滤，收集滤液，即得。
10.优选地，所述溶剂包括无水丙酮、无水乙醇或水中的任意一种或至少两种的组合，所述至少两种的组合例如无水丙酮和无水乙醇的组合、无水乙醇和水的组合、无水丙酮和水的组合等，其他任意的组合方式均可，优选为无水丙酮、无水乙醇与水的组合。
11.制备夏枯草提取物时所用的溶剂等提取条件会影响提取物的组成，进而影响其药效。与其他选择相比，当使用无水丙酮、无水乙醇与水的组合作为提取溶剂时，得到的夏枯草提取物缓解自身免疫性甲状腺炎以及改善妊娠结局的功效最佳。
12.优选地，所述溶剂中无水丙酮、无水乙醇与水的体积比为(1.5-2.5):(4.5-5.5):(2.5-3.5)。
13.上述(1.5-2.5)中的具体数值例如1.5、1.6、1.7、1.8、1.9、2.0、2.1、2.2、2.3、2.4、2.5等。
14.上述(4.5-5.5)中的具体数值例如4.5、4.6、4.7、4.8、4.9、5.0、5.1、5.2、5.3、5.4、5.5等。
15.上述(2.5-3.5)中的具体数值例如2.5、2.6、2.7、2.8、2.9、3.0、3.1、3.2、3.3、3.4、3.5等。
16.优选地，所述夏枯草果穗与溶剂的料液比为1:(5-10)g/ml，所述(5-10)中的具体数值例如5、5.5、6、6.5、7、7.5、8、8.5、9、9.5、10等。
17.优选地，所述提取包括回流提取或浸渍提取。
18.优选地，所述回流的温度为60-90℃，例如60℃、65℃、70℃、75℃、80℃、85℃、90℃等。
19.优选地，所述回流提取的次数为1-5次(例如1次、2次、3次、4次、5次)，每次回流1-6h，例如1h、1.5h、2h、2.5h、3h、3.5h、4h、4.5h、5h、5.5h、6h等。
20.优选地，所述浸渍提取在60-110℃下进行，例如60℃、65℃、70℃、75℃、80℃、85℃、90℃、92℃、95℃、98℃、100℃、102℃、105℃、108℃、110℃等。
21.优选地，所述浸渍提取的次数为1-5次(例如1次、2次、3次、4次、5次)，每次浸渍提取1-3h，例如1h、1.2h、1.5h、1.8h、2h、2.2h、2.5h、2.8h、3h等。
22.所述收集滤液后还包括浓缩滤液。
23.优选地，所述浓缩滤液后还包括萃取。
24.优选地，所述萃取时使用的萃取剂包括乙酸乙酯、石油醚或正丁醇中的任意一种或至少两种的组合，所述至少两种的组合例如乙酸乙酯和石油醚的组合、石油醚和正丁醇的组合、乙酸乙酯和正丁醇的组合等，其他任意的组合方式均可。
25.第二方面，本发明提供夏枯草提取物在制备预防和/或治疗自身免疫性甲状腺炎的药物中的应用。
26.优选地，所述夏枯草提取物是由包括如下步骤的提取方法提取得到的：将夏枯草果穗与溶剂混合，进行提取，过滤，收集滤液，即得。
27.优选地，所述溶剂包括无水丙酮、无水乙醇或水中的任意一种或至少两种的组合，优选为无水丙酮、无水乙醇与水的组合。
28.优选地，所述溶剂中无水丙酮、无水乙醇与水的体积比为(1.5-2.5):(4.5-5.5):(2.5-3.5)。
29.优选地，所述夏枯草果穗与溶剂的料液比为1:(5-10)g/ml；
30.优选地，所述提取包括回流提取或浸渍提取。
31.优选地，所述回流的温度为60-90℃；
32.优选地，所述回流提取的次数为1-5次，每次回流1-6h。
33.优选地，所述浸渍提取在60-110℃下进行；
34.优选地，所述浸渍提取的次数为1-5次，每次浸渍提取1-3h。
35.优选地，所述收集滤液后还包括浓缩滤液；
36.优选地，所述浓缩滤液后还包括萃取；
37.优选地，所述萃取时使用的萃取剂包括乙酸乙酯、石油醚或正丁醇中的任意一种或至少两种的组合。
38.第三方面，本发明提供夏枯草提取物在制备保胎药物中的应用。
39.优选地，所述夏枯草提取物是由包括如下步骤的提取方法提取得到的：将夏枯草果穗与溶剂混合，进行提取，过滤，收集滤液，即得。
40.优选地，所述溶剂包括无水丙酮、无水乙醇或水中的任意一种或至少两种的组合，优选为无水丙酮、无水乙醇与水的组合。
41.优选地，所述溶剂中无水丙酮、无水乙醇与水的体积比为(1.5-2.5):(4.5-5.5):(2.5-3.5)。
42.优选地，所述夏枯草果穗与溶剂的料液比为1:(5-10)g/ml；
43.优选地，所述提取包括回流提取或浸渍提取。
44.优选地，所述回流的温度为60-90℃；
45.优选地，所述回流提取的次数为1-5次，每次回流1-6h。
46.优选地，所述浸渍提取在60-110℃下进行；
47.优选地，所述浸渍提取的次数为1-5次，每次浸渍提取1-3h。
48.优选地，所述收集滤液后还包括浓缩滤液；
49.优选地，所述浓缩滤液后还包括萃取；
50.优选地，所述萃取时使用的萃取剂包括乙酸乙酯、石油醚或正丁醇中的任意一种或至少两种的组合。
51.在本发明中，所述药物的剂型包括溶液剂、散剂、片剂、胶囊剂、气雾剂、软膏剂或膜剂中的任意一种。
52.优选地，所述药物还包括药学上可接受的辅料。
53.优选地，所述辅料包括稀释剂、调味剂、粘合剂或填充剂中的任意一种或至少两种的组合，所述至少两种的组合例如稀释剂和调味剂的组合、粘合剂和填充剂的组合、稀释剂和填充剂的组合等，其他任意的组合方式均可。
54.本发明所述的数值范围不仅包括上述列举的点值，还包括没有列举出的上述数值范围之间的任意的点值，限于篇幅及出于简明的考虑，本发明不再穷尽列举所述范围包括的具体点值。
55.相对于现有技术，本发明具有以下有益效果：
56.本发明首次发现适当剂量的夏枯草提取物可显著促进胎儿发育，改善妊娠结局。所述夏枯草提取物可通过抑制th1/th17免疫应答、促进激活treg细胞功能、重新平衡细胞因子谱等途径来进行妊娠期免疫系统的调节，在制备改善妊娠结局的药物中具有重要的应用价值。
57.另外，制备夏枯草提取物时所用的溶剂等提取条件会影响提取物的组成，进而影响其药效。与其他选择相比，当使用乙无水丙酮、无水乙醇与水的组合作为提取溶剂时，得到的夏枯草提取物缓解自身免疫性甲状腺炎以及改善妊娠结局的功效最佳。
具体实施方式
58.下面通过具体实施方式来进一步说明本发明的技术方案。本领域技术人员应该明了，所述实施例仅仅是帮助理解本发明，不应视为对本发明的具体限制。
59.实施例1
60.本实施例提供一种夏枯草提取物，其提取方法如下：
61.使用空气干燥机将新鲜的夏枯草果穗在38℃空气干燥10天，然后用40目筛网过筛。用70℃的蒸馏水(料液比为1:5g/ml)回流2小时，共回流提取3次，得提取液。提取液经whatman 1号滤纸组合过滤3次。滤液浓缩，冻干，即得。
62.实施例2
63.本实施例提供一种夏枯草提取物，其提取方法如下：
64.(1)按照料液比为1:7g/ml向夏枯草果穗中加入溶剂(丙酮、乙醇与水的体积比为2:5:3)进行超声(160w，70℃)浸提1h，重复上述超声浸提步骤3次，过滤后合并提取液，得到夏枯草粗提物；
65.(2)将所述夏枯草粗提物经减压浓缩至无醇味，向浓缩液内加入0.1m的稀盐酸调节ph至3，并按照单次体积比1:1加入萃取剂(乙酸乙酯)进行萃取3次，取出乙酸乙酯层后用饱和氯化钠溶液进行洗涤，回收萃取剂，得夏枯草提取物。
66.实施例3
67.本实施例提供一种夏枯草提取物，其提取方法与实施例2的区别仅在于将“溶剂(丙酮、乙醇与水的体积比为2:5:3)”替换为等体积的“70vol％的乙醇水溶液”，其他条件参照实施例2。
68.实施例4
69.本实施例提供一种夏枯草提取物，其提取方法与实施例2的区别仅在于将“溶剂(丙酮、乙醇与水的体积比为2:5:3)”替换为等体积的“70vol％的丙酮水溶液”，其他条件参照实施例2。
70.实施例5
71.本实施例提供一种夏枯草提取物，其提取方法与实施例2的区别仅在于将“溶剂(丙酮、乙醇与水的体积比为2:5:3)”替换为等体积的“溶剂(丙酮、乙醇与水的体积比为3:3:4)”，其他条件参照实施例2。
72.测试例
73.一、实验方法
74.(1)动物模型的建立
75.雌性sd大鼠，体重均在180-200g，在给予光照和湿度控制的房间中饲养，喂食食物和水，并让其适应1周。实验性自身免疫性甲状腺炎(eat)大鼠模型的建立方法：200μg猪甲状腺球蛋白(ptg；sigma，美国)与完全弗氏佐剂(cfa；sigma，美国)或不完全弗氏佐剂(ifa；sigma,美国)乳化。在第0天和第7天，将ptg乳剂(cfa中2mg/ml)皮下注射至各雌性sd大鼠腹股沟区，作为一级免疫以诱导eat。第二次免疫于第14天使用ptg乳剂(ifa中2mg/ml)进行，并每周加强一次，直到第6周。另设空白组大鼠给予生理盐水乳化的弗氏佐剂，不作诱导eat处理。
76.(2)给药方式
77.利用实验性自身免疫性甲状腺炎(eat)大鼠模型，根据中药给药给药剂量标准将eat大鼠随机分为对照组和夏枯草提取物低、中、高剂量给药组。
78.夏枯草提取物的低、中、高剂量给药组的给药剂量分别为：分别灌胃给予2.88g/kg、5.76g/kg和11.52g/kg，每天1次，连续4周。对照组和空白组给予1ml/100g体重的去离子水，每日1次，连续4周。
79.下述实验如未经说明，给药组均为给予实施例1提供的夏枯草提取物。
80.(3)样品收集
81.将各组处理后的大鼠与雄性sd大鼠(体重180-200g，购自同济医学院动物中心。)交配，在胚胎14.5天(e14.5)用戊巴比妥钠麻醉处死。
82.经锁骨下静脉采血，离心分离血清。甲状腺叶和胎盘分离、固定并包埋在石蜡中。脾脏迅速切除并分成两部分。其中一部分立即分离成单核细胞悬液用于流式细胞术(fcm)，另一部分保存在-80℃用于mrna检测，此外，记录胎儿及胎盘发育图像，并称量胎儿及胎盘的重量。
83.二、夏枯草提取物缓解大鼠eat的效果测试
84.组织病理学分析
85.方法：将处理后小鼠的甲状腺切成3μm厚的石蜡切片，使用苏木精-伊红染色。将甲状腺炎的严重程度进行分级。然后，对4μm厚的胎盘石蜡切片进行染色，观察其形态变化。采用image-pro plus软件进行组织学评估。
86.甲状腺炎的炎症评分如下：
87.0：正常；
88.1+：一个或多个滤泡内至少有125个浸润细胞；
89.2+：滤泡浸润10-20个，甲状腺浸润面积小于25％；
90.3+：25％-50％甲状腺被浸润细胞破坏；
91.4+：50％以上腺体浸润。
92.各处理组的炎症评分结果(平均值)见表1。
93.表1
94.组别炎症评分空白组0.2对照组2.6低剂量给药组1.5中剂量给药组1.6高剂量给药组1.8
95.结果显示：与空白组大鼠相比，对照组大鼠甲状腺滤泡明显被破坏、单核细胞浸润，证实tg诱导eat成功。各剂量给药组的大鼠甲状腺炎症评分均低于对照组，证明：夏枯草提取物对tg诱导的eat大鼠甲状腺炎有明显的缓解作用。
96.三、夏枯草提取物对妊娠期eat大鼠的免疫系统的调节途径探究
97.利用流式细胞术(fcm)及实时定量pcr分析(qrt-pcr)以探究夏枯草提取物对妊娠期eat大鼠的免疫系统的调节途径，从而探索夏枯草提取物在eat大鼠怀孕期间缓解疾病的潜在机制。
98.(1)通过探究cd4
+
ifn-γ
+
th1、cd4
+
il-4
+
th2、cd4
+
il-17a
+
th17和cd4
+
foxp3
+
treg子集在脾淋巴细胞的变化比例，来评估夏枯草提取物对妊娠期eat大鼠的免疫系统的调节途径。实验方法：脾单个核细胞与细胞刺激混合物孵育6小时。约1
×
107个细胞/ml与抗大鼠cd4-fitc在4℃孵育30分钟。th1/th2染色时，用0.01％皂苷渗透细胞，并与抗大鼠ifn-γ-alexa647和抗大鼠il-4-pe孵育细胞。th17/treg染色时，用固定/渗透稀释剂固定和渗透细胞，并按照说明书操作将细胞与抗大鼠foxp3-apc和抗大鼠il-17-pe孵育。在becton dickinson流式细胞仪上进行fcm，使用flowjo软件进行数据分析。
99.各处理组的细胞比例结果(平均值)见表2。
100.表2
[0101][0102]
结果发现：与空白组相比，对照组大鼠具有高比例的th1和th17细胞和低比例的treg细胞。而与对照组相比，低、中剂量给药组的th1和th17细胞比例降低，而且各剂量给药组的treg细胞比例升高，说明低、中剂量的夏枯草提取物可抑制th1/th17免疫应答并促进激活treg细胞功能。
[0103]
(2)用trizol试剂从脾脏中提取和纯化总rna。将等量的总rna(1μg)反转录为cdna。采用hieffuniversal blue qpcr sybr green master mix，对cdna(2μl)进行qrt-pcr分析。所用引物序列信息(5
’‑
》3’)如下：
[0104]
seq id no.1：ifng正向引物：cgtcttggttttgcagctct。
[0105]
seq id no.2：ifng反向引物：cgtccttttgccagttcctc。
[0106]
seq id no.3：gata3正向引物：cccttatcaagcccaagcga。
[0107]
seq id no.4：gata3反向引物：tcaggggtctgttaatattgtgga。
[0108]
seq id no.5：foxp3正向引物：ctgcgtatgtccttccctcc。
[0109]
seq id no.6：foxp3反向引物：aaccttagtgcctgatgtgcc。
[0110]
各处理组的mrna的相对表达水平结果(平均值)见表3。
[0111]
表3
[0112][0113]
结果显示：与空白组大鼠相比，对照组大鼠的ifng mrna水平升高，gata3和foxp3mrna水平降低。与对照组相比，低、中剂量给药组的ifng mrna水平下降，gata3和foxp3mrna表达水平升高，较接近空白组水平；除此之外，与对照组相比，各剂量给药组的tgfb1mrna表达水平显著提高。说明夏枯草提取物可重新平衡细胞因子谱，从而恢复妊娠期eat大鼠的免疫平衡。
[0114]
上述结果表明：夏枯草提取物可通过抑制th1/th17免疫应答、促进激活treg细胞功能、重新平衡细胞因子谱等途径来调节妊娠期eat大鼠的免疫系统。
[0115]
四、夏枯草提取物对eat大鼠妊娠结局的影响效果测试
[0116]
为评估夏枯草提取物对tg诱导的eat大鼠妊娠结局的影响，记录各处理组大鼠的胎儿及胎盘发育图像，称量胎儿及胎盘的重量，并计算胚胎吸收率(吸收率计算方法为：胚胎吸收率＝吸收胚胎数/(吸收胚胎数+存活胚胎数)
×
100％)，结果(平均值)列于表4。
[0117]
表4
[0118][0119]
结果表明：与空白组大鼠相比，对照组大鼠胎盘和胎儿体重均降低，但胚胎吸收率增加。说明tg诱导的eat可导致不良妊娠结局(包括胎儿丢失和后代发育受限)。与对照组相比，低、中剂量给药组大鼠胎盘和胎儿体重显著增加，胚胎吸收减少。说明低、中剂量的夏枯草提取物可促进胎儿发育，显著改善eat大鼠妊娠结局。与低、中剂量给药组相比，高剂量给药组大鼠的胚胎吸收率较高，胎儿体重较低。说明高剂量的夏枯草提取物可导致胎儿丢失，阻碍后代发育。
[0120]
五、不同提取方法对夏枯草提取物药效的影响效果测试
[0121]
(1)不同提取方法对于夏枯草提取物缓解自身免疫性甲状腺炎效果的影响
[0122]
测试实施例1-5得到的夏枯草提取物的缓解自身免疫性甲状腺炎的效果，各组给药量均为低剂量，即2.88g/kg，对切除的甲状腺进行组织学评估，对甲状腺炎症进行评分，实验及评分方法同上，结果列于表5。
[0123]
表5
[0124]
组别炎症评分空白组0.2对照组2.6实施例11.5实施例21.2实施例32.1实施例41.8实施例51.7
[0125]
(2)不同提取方法对夏枯草提取物改善妊娠结局效果的影响
[0126]
测试实施例1-5得到的夏枯草提取物对eat大鼠妊娠结局的影响，各组给药量均为
低剂量，即2.88g/kg，称量胎儿及胎盘的重量，并计算胚胎吸收率，计算方法同上，结果列于表6。
[0127]
表6
[0128]
组别胚胎吸收率(％)胎儿重量(g)胎盘重量(g)空白组0.070.360.21对照组0.560.180.04实施例10.120.250.12实施例20.100.280.16实施例30.140.260.09实施例40.190.200.14实施例50.170.270.10
[0129]
结果表明：不同提取方法得到的夏枯草提取物均具有缓解自身免疫性甲状腺炎以及改善eat大鼠妊娠结局的效果，但其药效有所不同。其中，实施例2得到的夏枯草提取物的缓解自身免疫性甲状腺炎以及改善eat大鼠妊娠结局效果最好，说明制备夏枯草提取物时所用的溶剂等条件会影响提取物的组成，进而对其药效产生影响。
[0130]
申请人声明，本发明通过上述实施例来说明本发明的夏枯草提取物在制备改善妊娠结局的药物中的应用。但本发明并不局限于上述实施例，即不意味着本发明必须依赖上述实施例才能实施。所属技术领域的技术人员应该明了，对本发明的任何改进，对本发明产品各原料的等效替换及辅助成分的添加、具体方式的选择等，均落在本发明的保护范围和公开范围之内。
[0131]
以上详细描述了本发明的优选实施方式，但是，本发明并不限于上述实施方式中的具体细节，在本发明的技术构思范围内，可以对本发明的技术方案进行多种简单变型，这些简单变型均属于本发明的保护范围。
[0132]
另外需要说明的是，在上述具体实施方式中所描述的各个具体技术特征，在不矛盾的情况下，可以通过任何合适的方式进行组合，为了避免不必要的重复，本发明对各种可能的组合方式不再另行说明。