一种可搭乘红细胞的肿瘤新生抗原DNA纳米疫苗及其制备方法与应用

一种可搭乘红细胞的肿瘤新生抗原dna纳米疫苗及其制备方法与应用
技术领域
1.本发明属于纳米医学技术领域，涉及一种可搭乘红细胞的肿瘤新生抗原dna纳米疫苗的制备方法及其在肿瘤免疫治疗中的应用。


背景技术：

2.肝癌(hepatocellular carcinoma)是世界上常见的癌症之一。传统的肝癌治疗包括手术、放化疗和靶向治疗，但传统治疗手段均存在着临床预后普遍较差、术后生存率低等难题。而癌症免疫治疗通过利用和增强患者自身的免疫系统来消除原发性和转移性肿瘤细胞，已成为最有前途的癌症治疗方法之一，目前免疫检查点抑制剂以及car-t细胞治疗被批准应用于临床。随着分子生物学、肿瘤免疫学以及肿瘤基因组学等技术的发展，肿瘤新生抗原 (neoantigen)逐渐被大家认知，由于肿瘤细胞的遗传不稳定常导致大量突变，非同义突变的表达可产生肿瘤特异性抗原，而这类新抗原只特异存在于肿瘤细胞中。2013年rosenberg 团队通过外显子技术在肿瘤细胞系发现新生抗原并验证了其能激起机体免疫反应。至今，基于新生抗原的个体化肿瘤疫苗为近几年来衍生并发展起来的新的研究领域。
3.目前在研的新生抗原疫苗主要包括dna疫苗、mrna疫苗、多肽疫苗与细胞疫苗。其中dna疫苗(dna vaccine)主要是通过将编码某种蛋白质抗原的重组真核表达载体直接注射到动物体内，使外源基因在活体内表达产生的抗原激活机体免疫，与mrna疫苗相比 dna疫苗更加稳定。但是如何让dna疫苗在体内维持有效的免疫应答仍然是一大挑战，传统的质粒dna通过肌肉注射或皮下注射后dna疫苗从注射部位快速扩散，也因此存在循环时间短以及易被清除等问题。因此，与传统的肌肉内和皮下注射dna疫苗相比，将 dna疫苗直接转染宿主树突状细胞是提高dna疫苗效果的更有利策略。
4.dna疫苗必须进入细胞核并进行转录、翻译后才能诱导相应的免疫反应，但多种细胞屏障限制了外源dna的细胞核递送，所以基因递送载体是基因治疗的关键。目前，广泛使用的基因递送载体可分为病毒与非病毒基因递送系统。病毒基因递送系统的转染以及表达效率高，但存在潜在的野生型感染以及致癌性等毒副作用，且受病毒自身体积的限制装载目的基因的容量十分有限。常见的非病毒载体有阳离子脂质体和阳离子高聚物，其中脂质体dna 复合物是非病毒载体中应用最广泛的载体，具有制备简单、高生物安全性以及装载基因的容量可调性等优势，因此非病毒载体在疫苗递送中提现较为明显的优势，可用来制备新生抗原 dna纳米疫苗；现有技术中通过制备可生物降解的plga纳米粒子(nps)，能够将基因包裹于纳米粒子内部，进而互相结合形成纳米粒子-基因复合物，可以有效的保护基因在体内不被破坏，并通过纳米粒子良好的细胞结合和摄取能力，将基因导入细胞中进行表达，从而达到治疗作用，然而，plga包载基因存在包载效率低和释放速度慢的问题。由于阳离子聚合物(polycation)带有正电荷，能与带有负电荷的dna相互作用，形成复合物(polyplex)并用于基因转染，聚乙烯亚胺(pei)是目前研究最广泛的阳离子基因载体，分子量大的pei具有较高的基因转染效率，但也具有较高的细胞毒性，而分子量小的pei虽然没
有细胞毒性，但几乎不能介导基因转染。因此，通过修饰分子量大的pei降低细胞毒性是一种有效策略，现有技术通过将带正电的修饰的pei络合基因形成复合物，可以在体外有效提高转染效率，但是存在体内释放基因不可控以及易被清除等问题，导致基因无法导入细胞中并表达。
5.为解决nps体内清除快及红细胞载体释药不可控的问题，现有技术中通常采用脂质体挤压法，将红细胞膜先超声，之后使用脂质体挤压器先后过400nm以及200nm膜，将制备后的红细胞膜与plga纳米粒均匀混合，再过200nm的膜，得到rbc-np，rbc-np同时呈壳-核结构，核心为plga，外包裹单层红细胞膜，但rbc-np不具有靶向性，在体内存在非特异性分布的问题。
6.而将dna纳米疫苗直接靶向到免疫器官如脾脏等可以有利提高基因的递送并发挥疫苗的作用激活机体免疫。
7.综上所述，有必要构建一种搭乘于红细胞的dna纳米疫苗，实现dna纳米疫苗靶向输送，并诱导机体产生免疫反应的同时减少副作用的发生，这在肿瘤免疫治疗领域具有重要意义。
8.目前，肿瘤分子生物学的迅速发展创新了肿瘤治疗的新模式，肿瘤靶向生物治疗逐渐成为肿瘤治疗的新趋势，并取得一些突破性进展。肿瘤靶向生物治疗是利用抗原-抗体、配体
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受体之间的特异性结合作用，将药物或其他杀伤肿瘤细胞的活性物质选择性地运送到肿瘤部位，或抗体本身作为治疗药物，使治疗作用或药物效应尽量局限在特定的靶细胞、组织或器官内，而不影响正常细胞、组织或器官的功能，从而提高疗效、减少毒副作用的一种方法。但这种方法需要筛选肿瘤细胞特异表达的某类分子或高表达与肿瘤增殖、侵袭相关的受体，找到这些受体的难度很高，影响了这类方案的实施。


技术实现要素：

9.本发明的目的是针对现有技术的不足，提供了一种可搭乘红细胞的肿瘤新生抗原dna 纳米疫苗及其制备方法和应用，所述dna纳米疫苗包含dna疫苗以及阳离子聚合物，阳离子聚合物可提高转染效率，将dna纳米疫苗递送给抗原提呈细胞，通过红细胞实现靶向输送至脾脏，激活脾脏免疫，诱导机体产生系统性抗肿瘤免疫反应，是一种安全高效具有临床转化价值的新型肿瘤疫苗。
10.为达此目的，本发明采用以下技术方案：
11.一种可搭乘红细胞的肿瘤新生抗原dna纳米疫苗，所述dna纳米疫苗粒径在20-200 nm，其为具有球形结构的纳米体系，所述纳米体系的内核为阳离子聚合物pc与dna疫苗形成的复合物，丙交酯-乙交酯共聚物plga裹于内核表面，所述dna疫苗为将表达肿瘤细胞抗原的核苷酸序列插入到空载质粒上后得到的质粒pdna，所述dna纳米疫苗可通过静电吸附搭乘在红细胞表面。
12.本发明优选的方案中，所述阳离子聚合物pc由聚乙烯亚胺(pei
25000
)和1,2-环氧十四烷反应得到，所述丙交酯-乙交酯共聚物plga为plga 50：50，更优选的，所述阳离子聚合物由聚乙烯亚胺(pei
25000
)和1,2-环氧十四烷以质量比1：(0.5-10)在90℃下反应48h 得到用1,2-环氧十四烷修饰的阳离子聚合物pc，反应介质为无水乙醇。
13.优选地，所述pei
25000
和1,2-环氧十四烷的质量比为1：(0.5-5)，最优选为1：0.5。
14.上述pc的合成路线如下所示：
[0015][0016]
本发明优选的方案中，所述肿瘤细胞包括hepa 1-6(小鼠肝癌细胞)、b16-f10(小鼠皮肤黑色素瘤细胞)、ct26(小鼠结肠癌细胞)、mc38(小鼠结肠癌细胞)、rh35(大鼠肝癌细胞)、4t1(小鼠乳腺癌细胞)、gl261(小鼠脑胶质瘤)或u87(人脑星形胶质母细胞瘤)中的一种或多种。
[0017]
本发明的另一个目的是提供一种全新的肿瘤生物治疗方案，将表达肿瘤细胞抗原的质粒 pdna输送到抗原呈递细胞，表达肿瘤细胞抗原，激活mhc i(mhc class i)将新生抗原提呈至t细胞，激活特异性t细胞，去特异性杀伤肿瘤。
[0018]
优选地，所述肿瘤细胞为hepa 1-6(小鼠肝癌细胞)，所述表达肿瘤细胞抗原的核苷酸序列如seq id.no.1所示，所述质粒pdna的核苷酸序列如seq id.no.2所示。
[0019]
本发明还提供了上述质粒pdna，所述质粒pdna表达肿瘤细胞抗原，肿瘤细胞抗原的氨基酸序列如seq id.no.3所示。
[0020]
进一步地，所述肿瘤细胞抗原包含7个免疫原性抗原肽，各抗原肽之间通过10个氨基酸长度的连接肽连接，7个抗原肽分别为seq id.no.3中位于第11～27位的mapk3、位于第38～54位的lmf1、位于第65～81位的samd9l、位于第92～108位的traf7、位于第119～135 位的dtnb、位于第146～162位的lbr以及位于第173～189位的ptpn2，连接肽的氨基酸序列位于seq id.no.3中的其他位置。
[0021]
本发明还提供了上述肿瘤细胞抗原的在制备用于治疗肿瘤药物中的用途。
[0022]
本发明还提供了上述重组质粒pdna在制备用于治疗肿瘤药物中的用途。
[0023]
本发明还提供了上述肿瘤新生抗原dna纳米疫苗的制备方法：在疏水性的赋形剂 plga以及基因载体阳离子聚合物pc存在环境下，通过双微乳液法将亲水性的pdna包载在plga内部，所述制备方法具体包括以下步骤：
[0024]
将plga和阳离子聚合物pc溶于有机溶剂中，向其中加入含dna疫苗的depc水溶液，在冰浴下，通过超声后形成初级水油乳液，再向其中加入depc水溶液，在冰浴下，通过超声后形成油水乳液，除去有机溶剂后得到dna纳米疫苗。
[0025]
优选地，所述有机溶剂为二氯甲烷。
[0026]
优选地，所述阳离子聚合物pc与dna疫苗的质量比为(5-150)：1，最优选为20：1；
[0027]
优选地，所述plga与dna疫苗的质量比为(1-200)：1，更优选为(1-100)：1，最优选为100：1；
[0028]
本发明制备的肿瘤新生抗原dna纳米疫苗的粒径分布均一稳定，具有良好的水溶性以及生物安全性，可用于抗肿瘤免疫。
[0029]
本发明中，与单纯的dna疫苗相比dna纳米疫苗可以有效递送给抗原提呈细胞，并且具有良好的转染效率，同时可以刺激树突状细胞成熟，调控免疫抑制微环境。
[0030]
本发明还提供了上述肿瘤新生抗原dna纳米疫苗在制备肿瘤免疫治疗药物中的应用。
[0031]
上述应用中，肿瘤新生抗原dna纳米疫苗与红细胞通过静音混合器混合均匀后，使得带正电的dna纳米疫苗搭乘到红细胞上，通过红细胞的靶向作用将dna纳米疫苗运输至脾脏。
[0032]
利用红细胞的先天免疫功能，将dna纳米疫苗搭乘到红细胞上再靶向运输到脾脏，运用红细胞这种固有和独特的能力在脾脏中呈递抗原，从而激起机体免疫，诱导系统性抗肿瘤反应，抑制肿瘤进展。
[0033]
本发明中，所述搭便车的红细胞可激活脾脏处的免疫反应，促进树突状细胞的mhci 的表达，以及增强全身性t细胞免疫反应。
[0034]
本发明中，所述dna纳米疫苗在接种后可以有效抑制hepa 1-6肿瘤生长，延长小鼠生存周期。
[0035]
本发明的dna纳米疫苗可以有效递送给抗原提呈细胞，并且具有良好的转染效率，同时可以刺激树突状细胞成熟，调控免疫抑制微环境。
[0036]
本发明中运用的是带酯基端的plga，其不带电荷，现有的研究表明单纯运用带电荷的 plga可以有效包载pdna以及释放pdna，但存在合成的纳米颗粒过大以及纳米颗粒分散性差等问题，若将不带电荷的plga直接包载pdna其包载效率很低且存在释放不可控的问题。如果只引入高分子pei，现有的研究表明高分子pei在具有高转染效率的同时也具有高毒性，所以我们进一步对高分子的pei进行修饰，使其具有高转染效率的同时具有良好的生物安全性，但是只使用高分子pei络合pdna尾静脉注射到小鼠体内，不存在靶向性，无法将质粒导入到目标器官同时无法高效将基因导入细胞并表达，于是基于以上研究我们设计了一种以带正电荷的pc为内核络合pdna，以plga为外壳，在提高基因包载率的同时，也能降低毒性以及保护基因在体内不被破坏，并通过纳米粒子良好的细胞结合和摄取能力，将基因导入细胞中进行表达。
[0037]
与现有技术相比，本发明的主要优势和有益效果体现在：
[0038]
(1)本发明提供的dna纳米疫苗包含的基因载体为阳离子聚合物，具有低毒性、可生物降解，使得dna纳米疫苗具有良好的安全性以及稳定性。同时，由于阳离子聚合物的加入可以提高转染效率，使得dna纳米疫苗可以有效递送给抗原提呈细胞，这提高了dna 疫苗的效果。
[0039]
(2)本发明创新性地利用红细胞的先天免疫功能，将dna纳米疫苗搭乘到红细胞上再靶向运输到脾脏，运用红细胞这种固有和独特的能力在脾脏中呈递抗原，从而激起机体免疫，诱导系统性抗肿瘤反应。在预防模型中，增强的免疫反应有效减缓了肿瘤的进展，这有望为肿瘤免疫治疗法提供一种纳米疫苗新剂型。
[0040]
(3)制备方法简单，所需设备为常规设备。
[0041]
(4)脾脏和淋巴结是外周淋巴器官。脾脏的主要功能是从血液循环中过滤病原体产生对血源性抗原的免疫反应、清除异常的红细胞或以非炎症途径吞噬衰老的红细胞。红细胞捕获并灭活血液中的微生物，然后将捕获的病原体呈递给脾脏中的抗原提呈细胞
(apcs)。红细胞的这种独特的功能已被用于携带治疗性有效载荷，如基于纳米颗粒的靶向转运治疗方法，其中包括将抗原传递到脾脏apcs。因此，红细胞是传递dna纳米疫苗的理想候选者。
[0042]
(5)本发明中使用的表达肿瘤细胞抗原的核苷酸序列如seq id.no.1表达的抗原包含 7个免疫原性抗原肽，各抗原肽之间通过10个氨基酸长度的连接肽连接，以上七个氨基酸为新生抗原中的突变氨基酸。短肽本身已不具备原有蛋白的功能，仅仅通过结合组织相容复合物mhc，在转运蛋白的作用下递呈到细胞表面。正常情况下肿瘤细胞内蛋白降解形成的多肽不具有免疫原性，无法被免疫系统作为靶点识别。但是肿瘤细胞在生存与选择压力下部分蛋白发生非同义突变，其中具有免疫原性的突变位点作为短肽(本文所鉴定的抗原肽即属于此类)被递呈于肿瘤细胞表面后，可作为免疫系统识别的靶点。因而，我们可以通过设计、表达和递送这些突变肽来激活免疫系统，通过dc细胞与t细胞的相互作用，使得被激活的 t细胞具有靶向识别并杀伤肿瘤细胞的功能。
附图说明
[0043]
图1为实施例2中制备的阳离子聚合物pc的1h nmr图谱(300mhz，cdcl3)。
[0044]
图2为本发明制备所述dna纳米疫苗的合成路线示意图。
[0045]
图3为实施例3中通过双微乳液法制备的dna纳米疫苗的表征组图。其中(图3a) 为dna纳米疫苗的扫描电镜图(sem)，(图3b)为dna纳米疫苗的透射电镜图，(图 3c)为dna纳米疫苗在depc水溶液中的水合直径分布图，(图3d)为yoyo-3标记的 dna纳米疫苗的凝胶电泳条带图，(图3e)为荧光定量法检测yoyo-3-pdna的标准曲线， (图3f)为plga/pdna以及ppc/pdna中pdna的包封率，(图3g)为ppc/pdna在不同环境下的体外释放曲线图。
[0046]
图4为实施例4和实施例5中dna纳米疫苗作用于树突状细胞后抗原递呈情况，其中 (图4a)为共聚焦荧光显微镜(clsm)显示树突状细胞孵育dna疫苗和dna纳米疫苗 48h后的转染情况，(图4b)为dna纳米疫苗转染效率的统计图，(图4c)是流式细胞术检测dna纳米疫苗对树突状细胞成熟的影响。
[0047]
图5为实施例7中dna纳米疫苗搭乘红细胞的实验结果。其中(图5a)为通过流式细胞术分析红细胞与用dio标记的dna纳米疫苗以不同比例组装后的阳性率；(图5b) 为红细胞以及dna纳米疫苗与红细胞组装后的clsm图，(图5c)为通过sem观察红细胞以及红细胞携带dna纳米疫苗后的情况。
[0048]
图6为实施例8中dna纳米疫苗搭乘红细胞后富集到各器官的实验结果。其中(图6a) 为注射不同纳米颗粒与红细胞比例孵育的红细胞24h后采集的器官荧光图像，(图6b)为对各个器官的荧光强度统计结果。
[0049]
图7为实施例9中小鼠在经过接种搭乘dna纳米疫苗的红细胞后对小鼠激起的免疫效应进行评估的结果。其中(图7a)为流式细胞图谱，显示脾脏中dc的mhci的表达情况， (图7b)为流式细胞的定量分析结果，(图7c)是流式细胞图谱，显示脾脏中cd3
+
t细胞中cd8
+
t细胞的表达。(图7d)是定量分析结果，(图7e)是流式细胞图谱，显示脾脏中cd8
+
t细胞中cd44的表达，(图7f)是定量分析结果。
[0050]
图8为实施例10中的dna纳米疫苗的生物安全性实验结果。其中(图8a)为各组肝脏切片的h&e染色结果，(图8b)为各组血清的生化指标。
seq id.no.3中位于第11～27位的mapk3、位于第38～54位的lmf1、位于第65～81位的 samd9l、位于第92～108位的traf7、位于第119～135位的dtnb、位于第146～162位的lbr 以及位于第173～189位的ptpn2，连接肽的氨基酸序列位于seq id.no.3中的其他位置。
[0079]
mapk3：丝裂原活化蛋白激酶3，mapk3是一种蛋白质编码基因。在信号级联中起作用，调节各种细胞过程，如增殖，分化和细胞周期进展，以响应各种细胞外信号。mapk介导的细胞黏附运动，细胞外基质的降解，新血管的生成及细胞凋亡与肿瘤的发生、发展、转移关系密切。
[0080]
lmf1：脂肪酶成熟因子1重组蛋白，参与内质网中特定蛋白质的成熟。需要通过分泌途径进行活性脂蛋白脂肪酶(lpl)的成熟和转运。
[0081]
samd9l：接头蛋白，参与内体融合。通过生长因子受体的内化介导生长因子信号的下调。
[0082]
traf7：肿瘤坏死因子受体相关因子，其相关途径包括泛素-蛋白酶体依赖性蛋白水解和 i类mhc介导的抗原处理和呈递。不少研究证实traf7与免疫、肿瘤发生等多种生命活动有关。
[0083]
dtnb：β-雌激素，是一种蛋白质编码基因。与dtnb相关的疾病包括肌肉萎缩症和 hermansky-pudlak综合征。其相关途径包括肌肉萎缩症和肌营养不良蛋白-糖蛋白复合物。
[0084]
lbr：层粘连蛋白b受体，参与胆固醇生物合成过程和中性粒细胞分化。与该基因相关的基因本体(go)包括rna结合和氧化还原酶活性，作用于ch-ch组的供体，nad或 nadp作为受体。恶性肿瘤细胞较非恶行细胞表面结合更多的lbr，层粘连蛋白受体在癌转移中可促进癌细胞粘着于细胞外基质，尤其是基膜，诱导蛋白水解酶特别是胶原酶的表达分泌，促进癌细胞的迁移、增殖，促进血管内皮细胞增殖，血管形成，以及促进癌细胞与血小板聚积形成癌栓。
[0085]
ptpn2：酪氨酸磷酸酶，是一种蛋白质编码基因。其相关途径包括干扰素γ信号传导和camp依赖性pka的激活。研究表明肿瘤细胞可能通过上调酪氨酸磷酸酶来平衡失调的蛋白激酶活性，特定的酪氨酸磷酸酶可能影响肿瘤的发生和转移。
[0086]
肿瘤抗原肽是肿瘤细胞内蛋白经蛋白酶体降解后形成的短肽，通常为9至25个氨基酸长度，短肽本身已不具备原有蛋白的功能，仅仅通过结合组织相容复合物mhc，在转运蛋白的作用下递呈到细胞表面。正常情况下肿瘤细胞内蛋白降解形成的多肽不具有免疫原性，无法被免疫系统作为靶点识别。但是肿瘤细胞在生存与选择压力下部分蛋白发生非同义突变，其中具有免疫原性的突变位点作为短肽(本文所鉴定的抗原肽即属于此类)被递呈于肿瘤细胞表面后，可作为免疫系统识别的靶点。因而，我们可以通过设计、表达和递送这些突变肽来激活免疫系统，通过dc细胞与t细胞的相互作用，使得被激活的t细胞具有靶向识别并杀伤肿瘤细胞的功能。
[0087]
由于新生抗原具有肿瘤细胞特异性，即不同环境下不同肿瘤细胞会产生不同的蛋白突变，因而新抗原不具有广谱性。但是，我们通过鉴定获得hepa 1-6(小鼠肝癌细胞)的肿瘤新抗原，通过新抗原激活免疫系统，进而对肿瘤进行精准免疫杀伤。
[0088]
mhc class i(mhc i)：位于一般细胞表面上，可以提供一般细胞内的一些状况，比如该细胞遭受病毒感染，则将病毒外膜碎片之氨基酸链(peptide)透过mhc提示在细胞外侧，可以供杀手cd8+t细胞等辨识，以进行扑杀。
[0089]
实施例2：阳离子聚合物pc的合成
[0090]
将0.5g 1,2-环氧十四烷溶于20ml无水乙醇后加入到50ml圆底烧瓶中，待温度升到 90℃后，在圆底烧瓶中缓慢滴加5ml含1g pei
25000
的乙醇溶液，然后在90℃回流条件下反应48小时，反应结束后冷却至室温得到所需的目标产品阳离子聚合物pc，其结构表征结果参见图1，结果显示：成功合成了由47个pei以及11个1,2-环氧十四烷组成的阳离子聚合物pc。
[0091]
上述的pc合成路线如下所示：
[0092][0093]
pei分子中每两个碳原子相应有一个可质子化的氮原子，这些氮原子构成伯氨、仲氨和叔氨，使pei几乎在任何ph条件下都具有吸收质子的能力，使pei能在内涵体的酸性环境中吸收h，使其渗透压增高，导致膜不稳定甚至破裂，从而使被吞噬的复合物中的dna逃逸出来，避免dna降解，利用环氧类交联剂环氧键与伯胺基间的反应，环氧键打开生成羟基而实现交联，交联产物中的羟基可增加聚合物的水溶性，但环氧与胺反应的活性比双键要高的多，如控制不好，会在单位时间内固化而水溶性极差，所以，一般将pei和环氧交联剂配成极稀的溶液，将交联剂溶液慢速滴加进pei溶液。阳离子聚合物作为基因载体，其细胞毒性和转染率十分重要，设计低毒性的阳离子聚合物的一般策略使连接链长较短的阳离子聚合物，分子链较长的阳离子聚合物具有较大的毒性，而链长较长的阳离子聚合物介导较高的转染率。
[0094]
实施例3：dna纳米疫苗的制备和表征
[0095]
采用双微乳液法制备dna纳米疫苗：
[0096]
(1)将400μl含有100μg dna(即实施例1构建的pdna)的depc水溶液加入到 1ml含有2mg实施例2制备的pc和10mg plga的二氯甲烷中得到混合物。将上述混合物在冰浴中以60w超声功率处理2分钟，形成初级水油乳液。
[0097]
(2)再将3mldepc水加到初级水油乳液中，在60w功率下超声2分钟进一步乳化，形成油水乳液，随后用旋转蒸发仪除去二氯甲烷，最终得到dna纳米疫苗(ppc/pdna)， dna纳米疫苗合成路线图参见图2。
[0098]
(3)制备未包载pdna的颗粒(以下简称ppc)：重复上述步骤(1)和(2)，不同的是：步骤(1)的depc水溶液中不加pdna。
[0099]
(4)制备plga包载pdna的颗粒(以下简称plga/pdna):重复上述步骤(1)和 (2)，不同的是：步骤(1)的二氯甲烷中不含pc。
[0100]
通过扫描电子显微镜、透射电子显微镜和动态光散射(dls)表征得到的dna纳米疫苗，见图3a到图3c，图3c中ppc组为未包载dna质粒组，ppc/pdna组为dna纳米疫苗组，可知：
本实施例得到了具有球形结构、形貌均一稳定、粒径范围在50-100nm的纳米颗粒。以上方法将疏水性的plga以及pc溶于有机溶剂二氯甲烷中，通过双微乳液法将亲水性的pdna包载在plga内部，从透射电镜结果可以观察到dna纳米疫苗具有球形结构，并且包载pdna前后的颗粒sem结果相近，说明pdna并不是粘附在纳米粒子表面，而是在纳米粒子内部，进而不影响纳米粒子的分散以及形貌。
[0101]
阳离子聚合物pc与dna的结合能力通过凝胶电泳迁移实验来测定：
[0102]
取200μg实施例1构建的pdna(浓度为1μg/μl)与50μl yoyo-3(浓度为10μm)， pdna与yoyo-3以4：1的体积比混合均匀，在4℃条件下振荡2h后，得到yoyo-3-pdna 混合液(浓度为0.5μg/μl)，再按上述步骤(1)和(2)合成ppc/yoyo-3-pdna(不同以上步骤的是：步骤步骤(1)中，用yoyo-3-pdna混合液代替pdna，其他反应条件相同)，通过pdna和上述产物的凝胶电泳条带来判断包载情况。结果参见图3d，结果显示 dna疫苗的成功包载。
[0103]
取上述配好的yoyo-3-pdna(浓度为0.5μg/μl)作为标准液，将其稀释为不同浓度的yoyo-3-pdna标准溶液(浓度分别为20、10、5、2.5、1.25、0.625以及0.3125μg/ml)。利用荧光分光光度计测定各个浓度yoyo-3-pdna标准溶液的荧光强度(激发波长为550nm，发射波长为551-700nm)，绘制yoyo-3-pdna的标准曲线，绘制的yoyo-3-pdna标准曲线参见图3e。在一定浓度范围内，其线性回归方程为y＝32.45x+43.12，相关系数(r2)＝ 0.9973，线性关系相关性比较高。
[0104]
根据yoyo-3-pdna的标准曲线对plga/pdna以及ppc/yoyo-3-pdna的包封率进行测定，取100μl上述合成方法合成的plga/pdna以及ppc/yoyo-3-pdna，将其在10000 rpm、4℃条件下离心10min，取上清液，然后分析上清液中yoyo-3-pdna的荧光强度，最后通过回归方程计算得到上清液中yoyo-3-pdna的浓度，再根据以下方程计算出dna 纳米疫苗的包封率：
[0105]
总dna含量(μg)＝pdna浓度
×
体积
ꢀꢀꢀꢀꢀ
(a)
[0106]
未包裹的dna含量(μg)＝上清液中的pdna浓度
×
体积
ꢀꢀꢀꢀꢀ
(b)
[0107]
包封率(％)＝(总pdna含量-未包裹的pdna含量)/总dna含量
×
100％
ꢀꢀ
(c)
[0108]
经过公式(a)、(b)以及(c)可计算出plga/pdna包封率为7.13
±
1.22％， ppc/yoyo-3-pdna，即ppc/pdna的包封率为73.08
±
0.86％。结果参见图3f，结果显示 ppc/pdna可以有效负载pdna。
[0109]
本实施例制备的dna纳米疫苗ppc/pdna具有较好的包封率，通过nanodrop分光光度计检测不同环境下dna纳米疫苗ppc/pdna的体外释放。取500μl上述合成方法合成的ppc/pdna分别分散在500μlph5.0和ph7.4的pbs缓冲液中，并在37℃的摇床上孵育。在预定的时间点以10000rpm离心10分钟后提取0.5ml上清液，并加入0.5ml对应ph值的pbs缓冲液以保持体积恒定。将收集到的不同时间点的上清液，通过nanodrap分光光度计检测质粒的释放。结果参见图3g，结果显示在第216h，酸性环境下的dna纳米疫苗可以有效释放质粒，释放量达到总量的74.95
±
0.06％，这可能是由于酯基端的plga不带电荷，以plga为载体可以长时间保护基因不被破坏。
[0110]
用dio或者dii标记dna纳米疫苗：在上述步骤(1)的1ml二氯甲烷中另外加入 100μg dio或者dii后，再进行上述步骤(1)和(2)，合成纳米颗粒后，得到的产物置于再生纤维透析袋(mwco 3500)，然后使用大量的超纯水将溶液中的未包载的dio或者 dii透析出后即得到目标产物-dio标记的dna纳米疫苗或者dii标记的dna纳米疫苗，备用。
[0111]
depc水是用depc(diethyl pyrocarbonate，焦碳酸二乙酯)处理过并经高温高压灭菌的超纯水(一级水)，无色液体，经检测不含杂质rna、dna和蛋白质。
[0112]
实施例4：树突状细胞对dna纳米疫苗的摄取以及胞内定位
[0113]
向小鼠骨髓来源的树突状细胞(bmdcs)中分别加入0.2μg实施例1得到的pdna以及实施例3中合成的ppc/pdna(含0.2μg pdna，可根据实施例3测出的质粒的包封率和总dna含量控制包封的dna质量)孵育48h后，吸出原有载药培养基并用磷酸盐缓冲液洗涤细胞3次后，在室温下用4％多聚甲醛固定液处理20min，同样方式清洗所有细胞后，用dapi(染核)对bmdcs进行染色，最后用共聚焦显微镜观察各组dna疫苗的转染情况，各组荧光成像图片参见图4a。结果显示，含有ppc载体包载pdna组可以观察到明显的mcherry荧光信号，然后pdna组并未观察到荧光信号，证实ppc这个载体可以有效促进bmdcs更有效摄取并递送pdna。图4a为pdna与纳米载体包载pdna后在bmdcs 细胞上转染48h后的情况，可以发现：单纯的pdna在bmdcs细胞体内的转染效率几乎为0，而被纳米载体包载后由于纳米载体可以有效将基因导入体内并表达，图4b中可以观察到pdna在bmdcs细胞上的转染效率在90％以上。由于酯基端的plga不带电荷，以 plga为载体可以保护基因不被破坏，而纳米载体中的阳离子聚合物为该纳米载体提供了良好的转染效率。
[0114]
mcherry是一种来自于蘑菇珊瑚(mushroom coral)的红色荧光蛋白，本实施例中pdna 基因序列中包含mcherry的序列，当pdna表达时可带有mcherry的荧光，在本实施例中用于判断pdna的表达。dapi，即4',6-二脒基-2-苯基吲哚，是一种能够与dna强力结合的荧光染料，本实施例中用于标记细胞核。
[0115]
实施例5：树突状细胞激活实验
[0116]
按照5
×
105/孔将未成熟的bmdcs接种于24孔板中，分别用ppc/pdna(含0.2μgpdna)、25μg ppc与0.2μg pdna在37℃下处理24小时(ctrl组为不添加任何物质组)。以800g离心5分钟，然后将bmdcs与cd11c-apc、cd80-pe和cd-86-pe-cy7荧光抗体在黑暗中孵育30min进行标记，用磷酸盐缓冲液洗涤细胞三次后，利用流式细胞仪分析bmdcs上cd11c
+
cd80
+
和cd11c
+
cd86
+
的表达量，具体流式细胞图谱参见图4c。结合上述图4a和4b结果可知，由于ppc载体的递送使得ppc/pdna有更强的免疫刺激功能，诱导了bmdcs的成熟。
[0117]
cd11c是粘附蛋白白细胞整合素，cd11c表达在正常组织中，主要表达在髓系细胞，如骨髓的中幼粒细胞、早幼粒细胞、晚幼粒细胞、无分叶和分叶核中性粒细胞中，在组织巨噬细胞和单核细胞呈高水平表达，在粒细胞中为低水平表达。它还表达在nk细胞、活化t 细胞、淋巴细胞系中。
[0118]
cd80是t淋巴细胞活化时必需的膜抗原。表达于树突状细胞。他属于免疫球蛋白超家族，其受体是cd28和cd152(ctla4)。
[0119]
cd86，表达于树突状细胞。他属于免疫球蛋白超家族，其配体是cd28和cd152 (ctla4)。cd86与诱导剂cd28和抑制剂ctla4相互作用，是诱导t淋巴细胞增殖及产生il-2的主要协同因子。
[0120]
实施例6：血液的收集和处理
[0121]
用肝素钠抗凝管收集来自雄性c57bl/6小鼠的全血，收集的全血于4℃条件下1000g 离心10分钟(升速度为7，降速度为1)，小心吸出并丢弃掉血浆和红细胞界面上含有白细胞的棕黄色层，然后在冷的0.01m pbs中轻轻重悬分离红细胞，接着重复上述过程2次，
清洗分离出的红细胞，最后将其在10ml冷0.01m pbs中缓慢重悬后于4℃保存，得到溶液称为红细胞原液。
[0122]
实施例7：dna纳米疫苗搭乘于红细胞
[0123]
将实施例3制备的dna纳米疫苗ppc/pdna在10000rpm、4℃条件下离心10min 后重悬于冷的pbs中，然后与等体积含有1
×
108个细胞的红细胞原液混合在2.0ml ep管中。将ep管放置在静音混合器上，以5rpm的速度均匀旋转1小时。然后将搭便车的红细胞在 100g、4℃条件下离心5min，小心除去上清液，用1ml冷的0.01mpbs洗涤两次。最后将搭便车的红细胞重新悬浮在500μl冷的0.01m pbs中，用于进一步表征。
[0124]
将实施例3制备的dio标记的dna纳米疫苗按上述方法以不同比例搭乘于红细胞，然后通过流式细胞仪确定红细胞携带dna纳米疫苗的百分比(参见图5a，其中ctrl组为不含有dna纳米疫苗组，横坐标分别代表10、50、100和250μg的dio标记的dna纳米疫苗搭乘于含有1
×
108个细胞的红细胞原液)。结果显示：随着dna纳米疫苗比例的增加，红细胞的阳性率也随之增高。
[0125]
随后，将实施例3制备的dii标记的dna纳米疫苗与红细胞按上述比例组装方式以100： 1的比例进行组装，并使用clsm观察携带dna纳米疫苗前后的红细胞(参见图5b)。同时通过扫描电子显微镜进一步证明dna纳米疫苗搭乘于红细胞(参见图5c)。由clsm 图以及扫描电镜的结果可以证明dna纳米疫苗成功搭乘于红细胞。
[0126]
实施例8：搭便车的红细胞靶向至脾脏
[0127]
将实施例3制备的dii标记的dna纳米疫苗按上述实施例7的方法以不同比例搭乘于红细胞后，得到10、50、100和250μg的dii标记的dna纳米疫苗搭乘于含有1
×
108个细胞的红细胞原液，然后将上述不同搭乘比例的混合液以及100μg dii标记的dna纳米疫苗，分别通过尾静脉注射雄性c57bl/6小鼠体内，24h后进行生物分布分析，对小鼠进行安乐死并取出小鼠的主要器官，分析不同器官的荧光强度评价了不同比例的搭便车的红细胞对体内分布的影响。图6a是各器官荧光图像，图6b是100μg的dii标记的dna纳米疫苗搭乘于含有1
×
108个细胞的红细胞原液时，对各个器官荧光强度的统计并对比。结果显示：当dna纳米疫苗与红细胞比例达到100：1时脾脏处的荧光强度最强，富集效果最佳。
[0128]
实施例9：对dna纳米疫苗在脾脏处激起的免疫反应进行评估
[0129]
选取6-8周雄性c57bl/6小鼠，将小鼠分为四组，在第1天分别尾静脉注射200μl的 0.01m pbs、nps(实施例3制备的dna纳米疫苗ppc/pdna)、rbc-nps(i)(i为尾静脉注射一次dna纳米疫苗)和rbc-nps(ⅱ)(ii为尾静脉注射两次dna纳米疫苗，本次为两次接种疫苗中的第一针)(nps中均包含10μg pdna)，在第8天分别在小鼠尾静脉注射等量的pbs、nps和rbc-nps(ⅱ)(本次为两次接种疫苗的第二针)，rbc-nps (i)组(本次不注射任何物质)，四天后对小鼠进行安乐死，收集小鼠脾脏。以上实验中， rbc-nps均为100μg的dna纳米疫苗搭乘于含有1
×
108个细胞的红细胞原液。
[0130]
将新鲜采集的脾脏加入含1mlrpmi 1640完全培养基的六孔板中，用无菌注射器吹匀至培养基混浊，以上培养基用ficoll-paque
tm premium无菌溶液以800g、4℃离心30min 后得到单细胞悬液，单细胞悬液用冷的0.01m pbs洗涤3次，最后单细胞悬液中加入相对性的抗体(分别为：cd11c-apc、mhci-fitc、cd3-fitc、cd4-percp、cd8-pe和 cd44-pe-cy7)孵育30min。孵育结束后，洗涤细胞3次，并用200μl 0.01m pbs重悬，最后通过流式细胞仪分析
接种疫苗后脾脏中的树突状细胞的mhc i的表达情况(参见7a 以及7b)、脾脏中cd8
+
t细胞的表达(参见7c以及7d)以及脾脏中记忆t细胞中cd44 的表达(参见7e以及7f)。结果显示：搭便车的红细胞可以促进脾脏中dc的mhci的高表达、增加小鼠体内cd8
+
t细胞以及记忆t细胞的含量，说明了因为搭便车的红细胞高效富集到脾脏后可以将抗原呈递给apcs，从而进一步激起小鼠脾脏免疫增强全身性t细胞免疫反应。
[0131]
mhc class i(mhc i)：位于一般细胞表面上，可以提供一般细胞内的一些状况，比如该细胞遭受病毒感染，则将病毒外膜碎片之氨基酸链(peptide)透过mhc提示在细胞外侧，可以供杀手cd8+t细胞等辨识，以进行扑杀。
[0132]
cd3(分化簇3)t细胞的共受体是一种蛋白质复合物。cd3分子的跨膜区通过盐桥与 tcr两条肽链的跨膜区连接，形成tcr-cd3复合体，共同参与t细胞对抗原的识别。tcr 识别抗原所产生的活化信号由cd3转导至t细胞内。
[0133]
cd4主要由辅助t(th)细胞表达，是th细胞tcr识别抗原的受体，与mhcⅱ类分子的非多肽区结合，参与th细胞tcr识别抗原过程。
[0134]
cd8分子是一种白细胞分化抗原，为部分t细胞表面所具有的一种糖蛋白，用以辅助t 细胞受体(tcr)识别抗原并参与t细胞活化信号的转导，又称为tcr的共受体。表达cd8 的t细胞(cd8+t细胞)通常在活化后分化为细胞毒性t细胞(ctl)，能够特异性地杀伤靶细胞。
[0135]
cd44是一种复杂的跨膜粘附糖蛋白，表达于人的多种细胞，包括胚胎干细胞、分化细胞和癌细胞。cd44是公认的肿瘤干细胞的标志物，是上皮细胞间充质转化(emt)关键调节因子，参与肿瘤的发生，进展和转移。
[0136]
实施例10：dna纳米疫苗生物安全性
[0137]
选取6-8周雄性c57bl/6小鼠，分为两组，一组不接种疫苗，一组在第1天和第8天分别尾静脉注射rbc-nps一次(rbc-nps均为100μg的dna纳米疫苗搭乘于含有1
×
108个细胞的红细胞原液)(以上所用nps中含10μg pdna)，在四天后对未接种疫苗的健康小鼠(组)和接种rbc-nps疫苗组小鼠分别进行安乐死，收集小鼠肝脏以及血清。
[0138]
将肝脏浸泡至福尔马林中用以固定肝脏组织，随后用石蜡包埋肝脏组织。将包埋好的肝脏组织切片，并对切片组织进行苏木精-伊红染色。具体结果参见图8a，随后将收集的组和rbc-nps(ⅱ)的血清进行生化指标分析(参见图8b)。结果显示：虽然在图 6a中可以看出dna纳米疫苗在肝脏处有所富集，但是其对肝脏并无影响，同时血清生化指标也同样证实了其在体内应用的生物安全性及细胞毒性低。
[0139]
实施例11：小鼠肿瘤细胞激发实验
[0140]
选取6-8周雄性c57bl/6小鼠，将小鼠分为四组(每组7只)，第1天分别尾静脉注射200μl的0.01m pbs、nps(实施例3制备的dna纳米疫苗ppc/pdna)、rbc-nps (i)(比例为100：1，i为尾静脉注射一次dna纳米疫苗)和rbc-nps(ⅱ)(ii为尾静脉注射两次dna纳米疫苗，本次为两次接种疫苗的第一针)(nps中均包含10μg pdna)，七天后在上述进行预防治疗的小鼠右腹股沟皮下注射小鼠肝癌细胞hepa 1-6(1
×
106/只) 构建皮下肿瘤模型。在第8天各小鼠分别尾静脉注射等量的pbs、nps和rbc-nps(ⅱ)(本次为两次接种疫苗的第二针)。以上实验中，rbc-nps均为100μg的dna纳米疫苗搭乘于含有1
×
108个细胞的红细胞原液。在整个治疗过程中每隔2天测量小鼠肿瘤大小，肿瘤体积公式为：(长
肿瘤
×
宽
2肿瘤
)/2，共观察39天。
肿瘤体积超过1500mm3后即对小鼠实施安乐死。观察期间小鼠肿瘤生长曲线、小鼠体重变化以及生存周期参见图9a到图9c，结果显示：多次接种搭便车的红细胞组小鼠的肿瘤生长得到明显抑制，同时也延长了小鼠的生存期，证实该搭乘红细胞的dna纳米疫苗具有良好肿瘤生长预防能力。