血管支架及其制备方法和应用与流程

1.本发明涉及生物医疗材料制备技术领域，具体而言，涉及血管支架及其制备方法和应用。


背景技术：

2.目前，金属基血管支架已经发展成为心血管疾病治疗的主要手段。支架扩张会引起病灶部位血管组织的损伤，从而导致血栓的形成，严重危害病人的健康，甚至危及生命安全。目前，解决这一问题的策略主要有药物治疗和支架表面改性两种。
3.其中药物治疗主要为注射抗凝剂、口服抗凝药物、使用血小板拮抗剂和使用溶栓类药物等，但是药物的使用伴随着出血、药物抵抗和胃肠道反应等副作用发生的风险。
4.支架表面改性主要有无机薄膜涂层、药物共混有机涂层、静电自组装固定抗凝分子和化学偶连固定抗凝分子。其中无机薄膜涂层抗凝血功能较好，但是柔韧性差，在支架压握、推送和扩张过程中容易脱落引发血栓造成危害；药物共混有机涂层可以有效的保持抗凝分子活性，但是释放速率过快导致抗凝涂层迅速失效；化学偶连固定抗凝分子能够有效的提高抗凝分子的利用率和化学稳定性，但是会在一定程度影响抗凝分子的活性；静电自组装固定抗凝分子同样可以实现抗凝分子的表面固定，可以更大程度的保留抗凝分子的活性，但是较化学偶连策略固定的抗凝分子化学稳定性和环境稳定性较差。
5.鉴于此，特提出本发明。


技术实现要素：

6.本发明的目的在于提供血管支架的制备方法、血管支架和血管支架在药物负载领域的应用。
7.本发明是这样实现的：
8.第一方面，本发明提供一种血管支架的制备方法，包括在血管支架表面依次沉积一氧化氮催化释放微纳米粒子和凝血酶抑制剂，对血管支架进行表面修饰。其中，一氧化氮催化释放微纳米粒子包括化合物骨架以及掺杂在化合物骨架中的具有一氧化氮催化释放功能的化合物，且化合物骨架包括酚类化合物、醌类化合物和酮类化合物中的一种或多种。凝血酶抑制剂沉积时的固定方式为吸附。
9.第二方面，本发明提供一种血管支架，由前述实施方式任一项的制备方法制得。
10.第三方面，本发明提供一种如前述实施方式的血管支架在制备血管修复制品或血管修复动物模型中的应用。
11.本发明具有以下有益效果：
12.本发明提供一种具有一氧化氮催化释放和凝血酶抑制剂可控洗脱的血管支架及其制备方法和应用，通过使用酚类化合物、醌类化合物和酮类化合物中的一种或多种为化合物骨架，掺杂了具有一氧化氮催化释放功能的化合物得到的一氧化氮催化释放微纳米粒子在室温常压条件下化学结构稳定，表面的活性反应官能团能够接枝其他分子或接枝到其
他材料表面，有效的负载药物和控制释放药物，实现药物的可控性洗脱，增加药物的释放时间，提高缓释效果。同时其内部掺杂的具有一氧化氮催化释放功能的化合物能够催化一氧化氮释放，进一步抑制血栓的形成。此外，本发明在血管支架的表面以吸附的方式固定了凝血酶抑制剂，相较于共价接枝的方法，吸附固定凝血酶抑制剂能够延长凝血酶抑制剂的洗脱时间，实现凝血酶抑制剂的可控洗脱。
附图说明
13.为了更清楚地说明本发明实施例的技术方案，下面将对实施例中所需要使用的附图作简单地介绍，应当理解，以下附图仅示出了本发明的某些实施例，因此不应被看作是对范围的限定，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他相关的附图。
14.图1为实施例1制备得到的一氧化氮催化释放微纳米粒子的透射电镜图；
15.图2为实施例1制备得到的一氧化氮催化释放微纳米粒子中c原子的透射电镜能谱图；
16.图3为实施例1制备得到的一氧化氮催化释放微纳米粒子中o原子的透射电镜能谱图；
17.图4为实施例1制备得到的一氧化氮催化释放微纳米粒子中se原子的透射电镜能谱图；
18.图5为实施例1制备得到的一氧化氮催化释放微纳米粒子中n原子的透射电镜能谱图；
19.图6为实施例1制备得到的血管支架的一氧化氮催化释放速率曲线；
20.图7为实施例1制备得到的一氧化氮催化释放微纳米粒子包载化合物的包载速率图；
21.图8为实施例1每个步骤制备得到的血管支架的一氧化氮释放速率图；
22.图9为实施例1制备得到的血管支架的释药速度曲线；
23.图10为实施例1每个步骤制备得到血管支架的凝血时间图；
24.图11为实施例1制备得到的一氧化氮催化释放微纳米粒子沉积液离心后的实物图；
25.图12为对比例1制备得到的一氧化氮催化释放微纳米粒子沉积液离心后的实物图；
26.图13为空白316l不锈钢片材培养内皮细胞的透射电镜能谱图；
27.图14为实施例1的方法制备的316l不锈钢片材培养内皮细胞的透射电镜能谱图；
28.图15为对比例2的方法制备的316l不锈钢片材培养内皮细胞的透射电镜能谱图；
29.图16为试验例2中培养的内皮细胞数量的柱状图。
具体实施方式
30.为使本发明实施例的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述。实施例中未注明具体条件者，按照常规条件或制造商建议的条件进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市售购买获得的常规产
品。
31.第一方面，本发明提供一种血管支架的制备方法，包括在血管支架表面依次沉积一氧化氮催化释放微纳米粒子和凝血酶抑制剂，对血管支架进行表面修饰。其中，一氧化氮催化释放微纳米粒子包括化合物骨架以及掺杂在化合物骨架中的具有一氧化氮催化释放功能的化合物，且化合物骨架包括酚类化合物、醌类化合物和酮类化合物中的一种或多种。凝血酶抑制剂沉积时的固定方式为吸附。
32.在一些血管修复制品或心血管疾病的治疗中，血管支架的使用已经成为主要手段，但是血管支架在实际使用过程中仍存在支架扩张导致的病灶部位血管组织损伤，进一步导致血栓的形成，严重危害病人的健康及生命安全。为解决上述问题，发明人提出在血管支架表面依次沉积具有一氧化氮催化释放功能的微纳米粒子和凝血酶抑制剂，以减少血栓的形成。
33.一氧化氮(no)作为信号分子是维持心血管系统平衡的关键因素，具有抑制血小板的激活和聚集的作用。no抗凝血材料主要有no释放型和no催化型两种，其中no释放型由于no供体半衰期短释放速度快、负载量有限，限制了其研究和应用；而no催化型抗凝血材料，利用其分解体内丰度相对稳定的内源性一氧化氮供体的功能，能够实现可控速率范围内的有效释放，避免了no释放型抗凝血材料的突释和负载量有限的问题。
34.凝血酶抑制剂是凝血酶的直接抑制剂，其特异性高、半衰期短、给药灵活，能够有效降低出血率和代谢负担，本发明通过药物包载系统可以提高凝血酶抑制剂的利用率，降低代谢压力。
35.本发明通过使用酚类化合物、醌类化合物和酮类化合物中的一种或多种为化合物骨架，掺杂了具有一氧化氮催化释放功能的化合物得到的一氧化氮催化释放微纳米粒子在室温常压条件下化学结构稳定性，表面的活性反应官能团能够接枝其他分子或接枝到其他材料表面，有效的负载和控制释放凝血酶抑制剂，实现药物的可控性洗脱，增加药物的释放时间，提高缓释效果。同时内部掺杂的具有一氧化氮催化释放功能的分子或离子能够催化释放一氧化氮，进一步抑制血栓的形成。此外，本发明在血管支架的表面以吸附的方式固定了凝血酶抑制剂，相较于共价接枝的方法，吸附固定凝血酶抑制剂能够延长凝血酶抑制剂的洗脱时间，实现凝血酶抑制剂的可控洗脱。
36.在可选的实施方式中，一氧化氮催化释放微纳米粒子是将溶液a、溶液b和溶液c混合后反应，反应结束后固液分离得到。
37.溶液a是将酚类化合物、醌类化合物和酮类化合物中的一种或多种溶解到分散介质中制得；溶液b是将具有一氧化氮催化释放功能的化合物分散在分散介质中制得；溶液c是将含有铜离子的化合物溶解在分散介质中制得。
38.溶液a为具有一氧化氮催化释放功能的化合物提供化合物骨架，溶液b和溶液c均能够催化释放no，其中，溶液b和溶液a反应后能够形成微纳米粒子，而溶液c是通过掺杂的形式混合在溶液b和溶液a形成的微纳米粒子中，以提高一氧化氮的释放速率。
39.优选地，溶液a、溶液b和溶液c混合的比例为1：0.001～100：0～100。更优选地，溶液a、溶液b和溶液c混合的比例为1：0.001～10：0～1。
40.可以理解的是，由于溶液b和溶液a反应后得到的微纳米粒子同样可以催化释放一氧化氮，因此，当溶液b和溶液a反应后得到的微纳米粒子一氧化氮的释放速率较高时，溶液
c的添加量可以为0。同样的，当溶液a中掺杂了溶液c后得到的微纳米粒子一氧化氮的释放速率较高时，溶液b的添加量也可以为0。
41.优选地，溶液a、溶液b和溶液c的浓度均为0.001～100mg/ml。
42.更优选地，溶液a的浓度为0.001～10mg/ml，溶液b的浓度为0.001～1mg/ml，溶液c的浓度为0.001～0.1mg/ml。
43.优选地，反应为搅拌或振荡反应，反应温度为0～80℃，反应时间为0.01～72h。更优选地，反应的温度为4～40℃，反应时间为2～24h。
44.需要说明的是，混合反应的时间可以为0.01h的原因在于，溶液a、溶液b和溶液c混合后能够发生键合反应和非键合反应，三种溶液只要混合就会有浑浊产生，一氧化氮催化释放微纳米粒子的形成速度极快，极短时间内就可以发生非键合反应，此时分离得到的微纳米粒子非化学键合多，化学键合少，但也形成了一氧化氮催化释放微纳米粒子。反应时间延长，增加了键合反应的几率，再分离得到的微纳米粒子化学键合增多。
45.在可选的实施方式中，酚类化合物包括单酚及其衍生物、儿茶酚及其衍生物、邻苯三酚及其衍生物和间苯三酚及其衍生物中的至少一种。
46.优选地，醌类化合物包括苯醌及其衍生物、萘醌及其衍生物、菲醌及其衍生物和蒽醌及其衍生物中的至少一种。
47.优选地，酮类化合物包括黄酮类化合物、黄酮醇类化合物、双氢黄酮类化合物中的至少一种。
48.优选地，具有一氧化氮催化释放功能的化合物包括具有一氧化氮催化释放功能的离子和/或分子。
49.优选地，具有一氧化氮催化释放功能的离子包括铜离子化合物或有机铜离子；更优选地，铜离子为cu
+
或cu
2+
。
50.优选地，具有一氧化氮催化释放功能的分子包括双端为伯氨基的含硫醇或双硫键或硫硒键或硫碲键化合物、硒醇或双硒键或硒碲化合物、碲醇或双碲键化合物的一种或多种。
51.本发明选择的酚类化合物、醌化合物、酮化合物以及具有一氧化氮催化释放功能的化合物，其原料来源广泛，价格低廉，降低了血管支架表面沉积的成本，同时增加了其抗凝血的能力。
52.在可选的实施方式中，在血管支架表面固定一氧化氮催化释放微纳米粒子的方法包括：将一氧化氮催化释放微纳米粒子分散于沉积介质中得到一氧化氮催化释放微纳米粒子沉积液，再将血管支架放入一氧化氮催化释放微纳米粒子沉积液中沉积，得到具有一氧化氮催化释放功能的血管支架。
53.优选地，一氧化氮催化释放微纳米粒子沉积的固定方式包括吸附、静电作用、共价接枝或桥联锚定的任一种。
54.优选地，一氧化氮催化释放微纳米粒子沉积液的浓度为0.001～100mg/ml，更优选为0.05～10mg/ml。
55.通过控制一氧化氮催化释放微纳米粒子沉积液的浓度可以改变一氧化氮催化释放微纳米粒子在血管支架上的固定方式，例如吸附、静电作用、共价接枝或桥联锚定，从而改变血管支架表面固定的一氧化氮催化释放微纳米粒子的结合强度、密度等，实现不同材
质的血管支架中一氧化氮的催化释放。
56.吸附是通过配位作用、氢键、分子间作用力、疏水作用力等非键合作用力实现的微纳米粒子在待改性表面的固定，其发生速度相较于键合作用快，例如，在316l ss血管支架表面，一氧化氮催化释放微纳米粒子表面的酚羟基可以与316l ss血管支架表面的金属原子发生配位作用，这一过程较键合作用过程发生速度快，固定后赋予316l ss血管支架一氧化氮催化释放功能。
57.共价接枝是通过微纳米粒子表面的酚羟基、酮基、醛基、芳香环发生键合化学反应，例如，在氨基化血管支架表面，支架可以与一氧化氮催化释放微纳米粒子表面的酚羟基发生席夫碱反应或酚羟基所在的苯环发生迈克尔加成反应，完成共价接枝，这一过程发生速度较非键合作用过程慢，接枝后相较于非键合作用固定具有更好的化学稳定性和作用环境稳定性，固定后赋予氨基化血管支架一氧化氮催化释放功能。
58.优选地，沉积介质包括ph4～12的蒸馏水、pbs缓冲液、tris-盐酸缓冲液、hepes缓冲液、乙醇水溶液、四氢呋喃水溶液、丙酮、苯及其衍生物、二甲亚砜、二甲基甲酰胺和乙腈中的一种或多种。
59.沉积温度为4～80℃，沉积时间为0.01～72h；优选地，沉积温度为4～40℃，沉积时间为0.5～24h。
60.通过上述方法制备得到的一氧化氮催化释放微纳米粒子在室温常压条件下化学结构稳定，表面的活性反应官能团能够接枝其他分子和接枝到其他材料表面；表面和内部掺杂的具有一氧化氮催化释放功能的化合物赋予了一氧化氮催化释放微纳米粒子催化释放一氧化氮的功能，且其催化释放速率可以通过一氧化氮掺杂的量来调控。
61.在可选的实施方式中，在血管支架表面沉积凝血酶抑制剂的方法包括：将固定了一氧化氮催化释放微纳米粒子的血管支架置于凝血酶抑制剂溶液中沉积，得到具有一氧化氮催化释放功能和凝血酶抑制剂可控洗脱的血管支架。
62.凝血酶抑制剂溶液是将凝血酶抑制剂分散到分散介质中，配制成浓度为0.001～100mg/ml的凝血酶抑制剂溶液。
63.优选地，凝血酶抑制剂溶液的浓度为0.001～10mg/ml，更优选为0.05～5mg/ml。通过控制凝血酶抑制剂的浓度在上述范围内，能够实现凝血酶抑制剂在固定了一氧化氮催化释放微纳米粒子的血管支架表面的吸附固定，使得凝血酶抑制剂的洗脱过程可持续，从而实现了在血管支架表面凝血酶抑制剂的可控洗脱。
64.优选地，沉积温度为4～80℃，沉积时间为0.01～72h，更优选地，沉积温度为4～37℃，沉积时间为0.5～24h。
65.需要说明的是，凝血酶抑制剂和一氧化氮催化释放微纳米粒子的沉积过程以非键合反应为主，非键合反应在极短的时间范围内即可发生，因此，当血管支架与一氧化氮催化释放微纳米粒子沉积液或凝血酶抑制剂溶液接触时，一氧化氮催化释放微纳米粒子或凝血酶抑制剂的表面修饰过程就已经形成了，因此，二者的沉积时间均可以趋近于零，控制反应时间的长短可以控制一氧化氮催化释放微纳米粒子和凝血酶抑制剂的负载量。
66.在可选的实施方式中，凝血酶抑制剂包括凝血酶直接抑制剂或凝血酶间接抑制剂。
67.优选地，凝血酶直接抑制剂包括达比加群酯、比伐卢定、阿加曲班和重组水蛭素的
一种或多种。
68.优选地，凝血酶间接抑制剂包括肝素、低分子量肝素、依诺肝素和那曲肝素的一种或多种。
69.在可选的实施方式中，为了便于血管支架的制备，分散介质可以为常规的介质，包括ph2～14的蒸馏水、巴比妥钠缓冲液、巴比妥钠-盐酸缓冲液、甘氨酸-氢氧化钠缓冲液、甘氨酸-盐酸缓冲液、hepes缓冲液、邻苯二甲酸-盐酸缓冲液、磷酸二氢钾-氢氧化钠缓冲液、磷酸盐缓冲液、柠檬酸-磷酸缓冲液、柠檬酸-柠檬酸钠缓冲液、柠檬酸-氢氧化钠-盐酸缓冲液、pbs缓冲液、硼砂-硼酸缓冲液、硼砂-氢氧化钠缓冲液、tae缓冲液、碳酸钠-碳酸氢钠缓冲液、tbst缓冲液、te缓冲液、ten缓冲液、tris-盐酸缓冲液和乙酸-乙酸钠缓冲液中的一种或多种。
70.在可选的实施方式中，根据不同的应用需求，血管支架的材质为金属或聚合物。
71.优选地，金属包括316l ss、ti及其合金、ti-o、ti-n、ti-ni、co-cr合金、fe及其合金、zn及其合金和mg及其合金的一种或多种；
72.优选地，聚合物包括聚乳酸、聚乙醇酸、聚己内酯和聚酸酐的均聚物或共聚物的一种或多种。
73.第二方面，本发明提供一种血管支架，由前述实施方式任一项的制备方法制得。
74.第三方面，本发明提供一种如前述实施方式的血管支架在制备血管修复制品或血管修复动物模型中的应用。
75.由于本发明提供的血管支架其表面的一氧化氮催化释放微纳米粒子表面的活性反应官能团能够接枝其他分子和接枝到其他材料表面，可以有效的负载药物和控制释放药物。因此，在具体的应用过程中，可以在血管修复制品或血管修复动物模型等领域中用作药物负载的载体，其可负载的药物包括抗凝血药物、抗癌药物、抗菌药物、抗炎药物、抗免疫原性药物和骨诱导药物等。
76.以下结合实施例对本发明的特征和性能作进一步的详细描述。
77.实施例1
78.本实施例提供一种血管支架，包括在316l ss血管支架表面吸附单宁酸与硒代胱胺合成的含硒一氧化氮催化释放微纳米粒子，再沉积比伐卢定凝血酶抑制剂，其制备步骤具体如下：
79.s1、一氧化氮催化释放微纳米粒子的制备
80.称取单宁酸溶解到ph为8的pbs缓冲液中，配制成浓度为1mg/ml的单宁酸溶液a。
81.称取含硒的硒代胱胺分子分散在ph为8的pbs缓冲液中，配制成浓度为0.1mg/ml的硒代胱胺溶液b。
82.称取含铜离子的氯化铜分散在ph为8的pbs缓冲液中，配制成浓度为0.1mg/ml的氯化铜溶液c。
83.将溶液a、溶液b和溶液c按物质的量比1：1：0混合，40℃搅拌或振荡反应24h；反应完毕后，分离得到以多酚单宁酸为结构基础，含硒的硒代胱胺分子掺杂的一氧化氮催化释放微纳米粒子。
84.s2、一氧化氮催化释放微纳米粒子的沉积
85.称取s1步骤得到的一氧化氮催化释放微纳米粒子分散到pbs缓冲液中，配制成浓
度为10mg/ml的一氧化氮催化释放微纳米粒子沉积液，将血管支架浸泡于一氧化氮催化释放微纳米粒子沉积液中，40℃下反应24小时，反应完毕后，用蒸馏水充分漂洗、干燥，得到表面沉积了一氧化氮催化释放微纳米粒子的血管支架。
86.s3、凝血酶抑制剂的沉积
87.称取比伐卢定分散到蒸馏水中，配制成浓度为1mg/ml的比伐卢定溶液，将s2步骤得到的表面沉积了一氧化氮催化释放微纳米粒子的血管支架浸泡于比伐卢定溶液中，37℃下沉积6小时，反应完毕后，用蒸馏水充分漂洗，干燥，即得。
88.实施例2
89.本实施例提供一种血管支架，包括在316l ss血管支架表面吸附单宁酸与硒代胱胺、氯化铜合成的铜离子掺杂的一氧化氮催化释放微纳米粒子，再沉积比伐卢定凝血酶抑制剂，其制备步骤具体如下：
90.s1、一氧化氮催化释放微纳米粒子的制备
91.称取单宁酸溶解到ph为8的pbs缓冲液中，配制成浓度为1mg/ml的单宁酸溶液a。
92.称取含硒的硒代胱胺分子分散在ph为8的pbs缓冲液中，配制成浓度为0.1mg/ml的硒代胱胺溶液b。
93.称取氯化铜分散在ph为8的pbs缓冲液中，配制成浓度为0.01mg/ml的氯化铜溶液c。
94.将溶液a、溶液b和溶液c按物质的量比1：0.01：0.1混合，40℃搅拌或振荡反应24h；反应完毕后，分离得到以多酚单宁酸为结构基础，含硒的硒代胱胺分子、铜离子掺杂的一氧化氮催化释放微纳米粒子。
95.s2、一氧化氮催化释放微纳米粒子的沉积
96.称取s1步骤得到的一氧化氮催化释放微纳米粒子分散到pbs缓冲液中，配制成浓度为0.1mg/ml的一氧化氮催化释放微纳米粒子沉积液，将血管支架浸泡于一氧化氮催化释放微纳米粒子沉积液中，25℃下反应24小时，反应完毕后，用蒸馏水充分漂洗、干燥，得到表面沉积了一氧化氮催化释放微纳米粒子的血管支架。
97.s3、凝血酶抑制剂的沉积
98.称取比伐卢定分散到蒸馏水中，配制成浓度为0.05mg/ml的比伐卢定溶液，将s2步骤得到的血管支架浸泡于比伐卢定溶液中，25℃下沉积12小时，反应完毕后，用蒸馏水充分漂洗，干燥，即得。
99.实施例3
100.本实施例提供一种血管支架，包括在co-cr合金血管支架表面吸附由单宁酸、氯化铜和硒代胱胺合成的一氧化氮催化释放微纳米粒子，再沉积比伐卢定凝血酶抑制剂，其制备步骤具体如下：
101.s1、一氧化氮催化释放微纳米粒子的制备
102.称取单宁酸溶解到ph为8的pbs缓冲液中，配制成浓度为1mg/ml的单宁酸溶液a。
103.称取含硒的硒代胱胺分子分散在ph为8的pbs缓冲液中，配制成浓度为0.1mg/ml的硒代胱胺溶液b。
104.称取氯化铜分散在ph为8的pbs缓冲液中，配制成浓度为0.01mg/ml的氯化铜溶液c。
105.将溶液a、溶液b和溶液c按物质的量比1：1：0.1混合，25℃搅拌或振荡反应48h；反应完毕后，分离得到以多酚单宁酸为结构基础，含硒的硒代胱胺分子和铜离子掺杂的一氧化氮催化释放微纳米粒子。
106.s2、一氧化氮催化释放微纳米粒子的沉积
107.称取s1步骤得到的一氧化氮催化释放微纳米粒子分散到tris-盐酸缓冲液中，配制成浓度为10mg/ml的一氧化氮催化释放微纳米粒子沉积液，将血管支架浸泡于一氧化氮催化释放微纳米粒子沉积液中，4℃下反应24小时，反应完毕后，用蒸馏水充分漂洗、干燥，得到表面沉积了一氧化氮催化释放微纳米粒子的血管支架。
108.s3、凝血酶抑制剂的沉积
109.称取比伐卢定分散到蒸馏水中，配制成浓度为1mg/ml的比伐卢定溶液，将s2步骤得到的血管支架浸泡于比伐卢定溶液中，4℃下沉积24小时，反应完毕后，用蒸馏水充分漂洗，干燥，即得。
110.实施例4
111.本实施例提供一种血管支架，包括在316l ss血管支架表面吸附由单宁酸和胱胺合成的一氧化氮催化释放微纳米粒子，再沉积比伐卢定凝血酶抑制剂，其制备步骤具体如下：
112.s1、一氧化氮催化释放微纳米粒子的制备
113.称取单宁酸溶解到ph为8的hepes缓冲液中，配制成浓度为1mg/ml的单宁酸溶液a。
114.称取含硫的胱胺分子分散在ph为8的hepes缓冲液中，配制成浓度为0.1mg/ml的胱胺溶液b。
115.称取氯化铜分散在ph为8的hepes缓冲液中，配制成浓度为0.01mg/ml的氯化铜溶液c。
116.将溶液a、溶液b和溶液c按物质的量比1：1：0混合，40℃搅拌或振荡反应2h；反应完毕后，分离得到以多酚单宁酸为结构基础，含硫的胱胺分子掺杂的一氧化氮催化释放微纳米粒子。
117.s2、一氧化氮催化释放微纳米粒子的沉积
118.称取s1步骤得到的一氧化氮催化释放微纳米粒子分散到pbs缓冲液中，配制成浓度为10mg/ml的一氧化氮催化释放微纳米粒子沉积液，将血管支架浸泡于一氧化氮催化释放微纳米粒子沉积液中，4℃下反应24小时，反应完毕后，用蒸馏水充分漂洗、干燥，得到表面沉积了一氧化氮催化释放微纳米粒子的血管支架。
119.s3、凝血酶抑制剂的沉积
120.称取比伐卢定分散到蒸馏水中，配制成浓度为1mg/ml的比伐卢定溶液，将s2步骤得到的血管支架浸泡于比伐卢定溶液中，25℃下沉积12小时，反应完毕后，用蒸馏水充分漂洗，干燥，即得。
121.实施例5
122.本实施例提供一种血管支架，包括在316l ss血管支架表面吸附由儿茶酚衍生物咖啡酸和碲代胱胺合成的一氧化氮催化释放微纳米粒子，再沉积比伐卢定凝血酶抑制剂，其制备步骤具体如下：
123.s1、一氧化氮催化释放微纳米粒子的制备
124.称取咖啡酸溶解到ph为8的pbs缓冲液中，配制成浓度为1mg/ml的咖啡酸溶液a。
125.称取含碲的碲代胱胺分子分散在ph为8的pbs缓冲液中，配制成浓度为0.1mg/ml的碲代胱胺溶液b。
126.称取氯化铜分散在ph为8的pbs缓冲液中，配制成浓度为0.01mg/ml的氯化铜溶液c。
127.将溶液a、溶液b和溶液c按物质的量比1：0.1：0混合，15℃搅拌或振荡反应16h；反应完毕后，分离得到以儿茶酚咖啡酸为结构基础，含碲的碲代胱胺分子掺杂的一氧化氮催化释放微纳米粒子。
128.s2、一氧化氮催化释放微纳米粒子的沉积
129.称取s1步骤得到的一氧化氮催化释放微纳米粒子分散到碳酸钠-碳酸氢钠缓冲液中，配制成浓度为10mg/ml的一氧化氮催化释放微纳米粒子沉积液，将血管支架浸泡于一氧化氮催化释放微纳米粒子沉积液中，4℃下反应12小时，反应完毕后，用蒸馏水充分漂洗、干燥，得到表面沉积了一氧化氮催化释放微纳米粒子的血管支架。
130.s3、凝血酶抑制剂的沉积
131.称取比伐卢定分散到蒸馏水中，配制成浓度为1mg/ml的比伐卢定溶液，将s2步骤得到的血管支架浸泡于比伐卢定溶液中，4℃下沉积24小时，反应完毕后，用蒸馏水充分漂洗，干燥，即得。
132.实施例6
133.本实施例提供一种血管支架，包括在316l ss血管支架表面吸附由儿茶酚衍生物多巴胺和硒代胱胺合成的一氧化氮催化释放微纳米粒子，再沉积比伐卢定凝血酶抑制剂，其制备步骤具体如下：
134.s1、一氧化氮催化释放微纳米粒子的制备
135.称取多巴胺溶解到ph为8的tris-盐酸盐缓冲液中，配制成浓度为1mg/ml的多巴胺溶液a。
136.称取含硒的硒代胱胺分子分散在ph为8的pbs缓冲液中，配制成浓度为0.1mg/ml的硒代胱胺溶液b。
137.称取氯化铜分散在ph为8的pbs缓冲液中，配制成浓度为0.01mg/ml的氯化铜溶液c。
138.将溶液a、溶液b和溶液c按物质的量比1：1：0混合，40℃搅拌或振荡反应24h；反应完毕后，分离得到以儿茶酚衍生物多巴胺为结构基础，含硒的硒代胱胺分子掺杂的一氧化氮催化释放微纳米粒子。
139.s2、一氧化氮催化释放微纳米粒子的沉积
140.称取s1步骤得到的一氧化氮催化释放微纳米粒子分散到pbs缓冲液中，配制成浓度为10mg/ml的一氧化氮催化释放微纳米粒子沉积液，将血管支架浸泡于一氧化氮催化释放微纳米粒子沉积液中，40℃下反应24小时，反应完毕后，用蒸馏水充分漂洗、干燥，得到表面沉积了一氧化氮催化释放微纳米粒子的血管支架。
141.s3、凝血酶抑制剂的沉积
142.称取比伐卢定分散到蒸馏水中，配制成浓度为1mg/ml的比伐卢定溶液，将s2步骤得到的血管支架浸泡于比伐卢定溶液中，4℃下沉积24小时，反应完毕后，用蒸馏水充分漂
洗，干燥，即得。
143.实施例7
144.本实施例提供一种血管支架，包括在316l ss血管支架表面吸附由多酚单宁酸和单硒代胱胺合成的一氧化氮催化释放微纳米粒子，再沉积比伐卢定凝血酶抑制剂，其制备步骤具体如下：
145.s1、一氧化氮催化释放微纳米粒子的制备
146.称取单宁酸溶解到ph为8的pbs缓冲液中，配制成浓度为1mg/ml的多酚单宁酸溶液a。
147.称取单硒代胱胺分子分散在ph为8的pbs缓冲液中，配制成浓度为0.1mg/ml的单硒代胱胺溶液b。
148.称取氯化铜分散在ph为8的pbs缓冲液中，配制成浓度为0.01mg/ml的氯化铜溶液c。
149.将溶液a、溶液b和溶液c按物质的量比1：1：0混合，40℃搅拌或振荡反应24h；反应完毕后，分离得到以多酚单宁酸为结构基础，含硒和硫的单硒代胱胺分子掺杂的一氧化氮催化释放微纳米粒子。
150.s2、一氧化氮催化释放微纳米粒子的沉积
151.称取s1步骤得到的一氧化氮催化释放微纳米粒子分散到pbs缓冲液中，配制成浓度为10mg/ml的一氧化氮催化释放微纳米粒子沉积液，将血管支架浸泡于一氧化氮催化释放微纳米粒子沉积液中，25℃下反应12小时，反应完毕后，用蒸馏水充分漂洗、干燥，得到表面沉积了一氧化氮催化释放微纳米粒子的血管支架。
152.s3、凝血酶抑制剂的沉积
153.称取比伐卢定分散到蒸馏水中，配制成浓度为1mg/ml的比伐卢定溶液，将s2步骤得到的血管支架浸泡于比伐卢定溶液中，4℃下沉积24小时，反应完毕后，用蒸馏水充分漂洗，干燥，即得。
154.实施例8
155.本实施例提供一种血管支架，包括在316l ss血管支架表面吸附单宁酸与硒代胱胺合成的含硒一氧化氮催化释放微纳米粒子，再沉积肝素凝血酶抑制剂，其制备步骤具体如下：
156.s1、一氧化氮催化释放微纳米粒子的制备
157.称取单宁酸溶解到ph为8的pbs缓冲液中，配制成浓度为1mg/ml的单宁酸溶液a。
158.称取含硒的硒代胱胺分子分散在ph为8的pbs缓冲液中，配制成浓度为0.1mg/ml的硒代胱胺溶液b。
159.称取氯化铜分散在ph为8的pbs缓冲液中，配制成浓度为0.01mg/ml的氯化铜溶液c。
160.将溶液a、溶液b和溶液c按物质的量比1：1：0混合，40℃搅拌或振荡反应24h；反应完毕后，分离得到以多酚单宁酸为结构基础，含硒的硒代胱胺分子掺杂的一氧化氮催化释放微纳米粒子。
161.s2、一氧化氮催化释放微纳米粒子的沉积
162.称取s1步骤得到的一氧化氮催化释放微纳米粒子分散到pbs缓冲液中，配制成浓
度为10mg/ml的一氧化氮催化释放微纳米粒子沉积液，将血管支架浸泡于一氧化氮催化释放微纳米粒子沉积液中，40℃下反应24小时，反应完毕后，用蒸馏水充分漂洗、干燥，得到表面沉积了一氧化氮催化释放微纳米粒子的血管支架。
163.s3、凝血酶抑制剂的沉积
164.称取肝素分散到蒸馏水中，配制成浓度为1mg/ml的肝素溶液，将s2步骤得到的表面沉积了一氧化氮催化释放微纳米粒子的血管支架浸泡于肝素溶液中，37℃下沉积2小时，反应完毕后，用蒸馏水充分漂洗，干燥，即得。
165.实施例9
166.本实施例提供一种血管支架，包括在富氨基化316l ss血管支架表面接枝单宁酸与硒代胱胺合成的含硒一氧化氮催化释放微纳米粒子，再沉积比伐卢定凝血酶抑制剂，其制备步骤具体如下：
167.s1、一氧化氮催化释放微纳米粒子的制备
168.称取单宁酸溶解到ph为8的pbs缓冲液中，配制成浓度为1mg/ml的单宁酸溶液a。
169.称取含硒的硒代胱胺分子分散在ph为8的pbs缓冲液中，配制成浓度为0.1mg/ml的硒代胱胺溶液b。
170.称取氯化铜分散在ph为8的pbs缓冲液中，配制成浓度为0.01mg/ml的氯化铜溶液c。
171.将溶液a、溶液b和溶液c按物质的量比1：1：0混合，40℃搅拌或振荡反应24h；反应完毕后，分离得到以多酚单宁酸为结构基础，含硒的硒代胱胺分子掺杂的一氧化氮催化释放微纳米粒子。
172.s2、一氧化氮催化释放微纳米粒子的沉积
173.称取s1步骤得到的一氧化氮催化释放微纳米粒子分散到ph为8的pbs缓冲液中，配制成浓度为10mg/ml的一氧化氮催化释放微纳米粒子沉积液，将血管支架浸泡于一氧化氮催化释放微纳米粒子沉积液中，40℃下反应24小时，反应完毕后，用蒸馏水充分漂洗、干燥，得到表面沉积了一氧化氮催化释放微纳米粒子的血管支架。
174.s3、凝血酶抑制剂的沉积
175.称取比伐卢定分散到蒸馏水中，配制成浓度为1mg/ml的比伐卢定溶液，将s2步骤得到的表面沉积了一氧化氮催化释放微纳米粒子的血管支架浸泡于比伐卢定溶液中，40℃下沉积24小时，反应完毕后，用蒸馏水充分漂洗，干燥，即得。
176.对比例1
177.本对比例提供一种血管支架，其制备方法与实施例1大致相同，区别仅在于一氧化氮催化释放微纳米粒子的制备中将溶液a、溶液b和溶液c按物质的量比1：0.0001：0混合。
178.对比例2
179.本对比例提供一种血管支架，其制备方法与实施例1大致相同，区别仅在于一氧化氮催化释放微纳米粒子的制备中将溶液a、溶液b和溶液c按物质的量比1：1：101混合。
180.对比例3
181.本对比例提供一种血管支架，其制备方法与实施例1大致相同，区别仅在于凝血酶抑制剂的沉积中81℃下沉积。后续表征表明沉积的凝血酶抑制剂比伐卢定失去凝血酶抑制活性。
182.试验例1
183.将实施例1制备得到的一氧化氮催化释放微纳米粒子置于电子显微镜下观测得到如图1～5所示结果，从图1可以看出，本发明制备得到一氧化氮催化释放微纳米粒子其粒径处于纳米尺度，能较佳地沉积于血管支架上。从图2～5可以发现，本发明实施例1制备得到的一氧化氮催化释放微纳米粒子在c、n、o元素形成的化合物骨架中，硒元素掺杂均匀，具有催化释放一氧化氮的功能。
184.试验例2
185.将实施例1制备得到的一氧化氮催化释放微纳米粒子置于noa280i呼气一氧化氮测定仪进行一氧化氮催化释放速率测试，得到如图6所示结果，从图6可知，在8min左右添加本实施例提供的一氧化氮催化释放微纳米粒子后，一氧化氮的催化释放速率短时间内缓慢降至0.0032
±
0.0004nmol/(ng
·
min)，并保持该释放速率持续释放一氧化氮。
186.试验例3
187.将实施例1制备得到的一氧化氮催化释放微纳米粒子通过粒子溶液和模型分子溶液共混法包载阳离子染料甲苯胺蓝(tbo)、阴离子染料酸性橙(aoⅱ)、疏水性药物阿霉素(dox)、人工合成多肽多肽凝血酶抑制剂比伐卢定(bvld)、人工合成多肽抗菌肽(amp)、蛋白质溶菌酶(lysozyme)、蛋白质牛血清白蛋白(bsa)、人源3t3细胞提取rna，并检测其包载率，得到如图7所示结果。由图7可知，本发明制备的一氧化氮催化释放微纳米粒子能够实现各种小分子、多肽、蛋白质、rna等的包载。
188.试验例4
189.采用griess法，测定实施例1制备得到的血管支架的一氧化氮释放速率，得到如图8所示结果。由图8可知，在316l ss血管支架表面沉积一氧化氮催化释放微纳米粒子(nps)后一氧化氮释放速率升高，再在其表面沉积比伐卢定(bvld)后，一氧化氮的释放速率没有明显改变，说明，本发明在沉积有一氧化氮催化释放微纳米粒子的血管支架表面再次沉积凝血酶抑制剂比伐卢定，对一氧化氮的释放无显著影响。
190.试验例5
191.采用紫外可见光光度法检测实施例1制备得到的血管支架的释药速度，得到如图9所示结果。由图9可知，比伐卢定的洗脱速度稳定在100nmol/天，说明，用本发明提供的方法能够实现比伐卢定持续、稳定的可控洗脱。
192.试验例6
193.采用血凝仪检测316l ss血管支架、氨基化血管支架、沉积具有一氧化氮催化释放微纳米粒子的支架、负载凝血酶抑制剂比伐卢定的沉积了具有一氧化氮催化释放微纳米粒子的支架浸泡处理后的血浆的凝血酶凝血时间，得到如图10所示结果。由图10可知，本发明在血管支架表面沉积一氧化氮催化释放微纳米粒子负载凝血酶抑制剂得到的血管支架抗凝血效果显著提高。
194.试验例7
195.将实施例1和对比例1制备得到的用于制备血管支架的一氧化氮催化释放微纳米粒子沉积液放入离心机中离心，得到如图11～12所示结果。
196.由图可知，图11的沉积液在离心后溶液底部出现沉淀101，而图12的沉积液离心后无沉淀101沉积，说明对比例1在溶液a、溶液b和溶液c混合过程中没有生成一氧化氮催化释
放微纳米粒子，即对比例1制备的血管支架不具有催化释放一氧化氮的功能。
197.试验例8
198.采用实施例1和对比例2完全相同的制备方法，将一氧化氮催化释放微纳米粒子和凝血酶抑制剂分别沉积在两块相同的316l不锈钢片材表面，该片材尺寸为10
×
10
×
0.05mm。
199.将内皮细胞分别置于实施例1、对比例2和空白的316l不锈钢片材(空白对照)上培养，1天后固定用荧光染料染色并在荧光状态下观察细胞数量和状态，测定细胞活性。得到图13～15所示结果。
200.由图可知，图14中的细胞数量与图13中的细胞数量相差不大，而图15中的细胞数量相较于图13明显减少，说明对比例2改变溶液a、b和c的配比后，得到的具有一氧化氮催化释放的微纳米粒子具有细胞组织毒性，不适合血管支架表面改性。
201.使用cck-8试剂盒将图13～15中316l不锈钢片材上内皮细胞数量进行统计，得到如图16所示结果。图16可以明显看出对比例2的细胞数量相较于实施例3和空白对照减少了一倍，进一步表明对比例2改变溶液a、b和c的配比后，得到的具有一氧化氮催化释放的微纳米粒子具有细胞组织毒性，不适合血管支架表面改性。
202.综上所述，本发明提供的一种血管支架及其制备方法和应用至少具有以下优点：
203.1、通过使用酚类化合物、醌类化合物和酮类化合物中的一种或多种为化合物骨架，掺杂了具有一氧化氮催化释放功能的化合物得到的一氧化氮催化释放微纳米粒子在室温常压条件下化学结构稳定性，表面的活性反应官能团能够接枝其他分子或接枝到其他材料表面，有效的负载药物和控制释放药物，实现药物的可控性洗脱，增加药物的释放时间，提高缓释效果。
204.2、通过在化合物骨架中掺杂具有一氧化氮催化释放功能的化合物，使得最终得到的一氧化氮催化释放微纳米粒子能够在化合物骨架中催化释放一氧化氮，进一步抑制血栓的形成。
205.3、本发明在血管支架的表面以吸附的方式固定了凝血酶抑制剂，相较于共价接枝的方法，吸附固定凝血酶抑制剂能够延长凝血酶抑制剂的洗脱时间，实现凝血酶抑制剂的可控洗脱。
206.以上仅为本发明的优选实施例而已，并不用于限制本发明，对于本领域的技术人员来说，本发明可以有各种更改和变化。凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。