一种蓝莓提取物及其制备方法与在制备具有降血脂和/或减肥作用的药物或食品中的应用与流程

1.本发明涉及生物医药技术领域，具体涉及一种蓝莓提取物及其制备方法与在制备具有降血脂和/或减肥作用的药物或食品中的应用。


背景技术：

2.肥胖，一定程度的明显超重与脂肪层过厚，尤其是甘油三酯积聚过多而导致。随着人们生活质量及生活方式明显改变，而肥胖症的发病率高、增长态势也越发明显，肥胖是由于食物摄入过多或机体代谢的改变而导致体内脂肪积聚过多造成的，是大部分代谢类慢性病的促病因素。研究发现，肥胖者更易罹患高血脂、高血压等病症。除了改变生活方式、控制饮食、运动、药物和手术等，临床上尝试过使用多种药物用于治疗肥胖(如甲状腺提取物、2-硝基苯酚和苯丙胺)，但疗效与安全性均不理想。
3.蓝莓又称越桔，营养丰富，被称为“水果皇后”；其果实不仅颜色极具吸引力，而且风味独特；同时还具有改善视力、增强自身免疫力、抗癌、增强记忆力、抗氧化和减缓衰老等功能。此外，现有技术虽然有报道蓝莓具有一定的降血脂功效；但是现有技术对于蓝莓中的降血脂作用或减肥作用研究得不够深入，仍需要本领域技术人员进一步对其降血脂作用或减肥作用的物质基础进行深入研究。如能从蓝莓中开发一种具有优异降血脂或减肥作用的有效部位或单体化合物具有重要的应用价值。


技术实现要素：

4.鉴于此，本发明首先提供了一种蓝莓提取物的制备方法，研究表明，由该方法制备得到的蓝莓提取物具有优异的降血脂作用。
5.本发明的技术方案如下：
6.一种蓝莓提取物的制备方法，其特征在于，包含如下步骤：
7.(1)取蓝莓鲜果，然后加入0～5℃的水进行破碎，得破碎混合液；
8.(2)将破碎混合液进行固液分离，取液体得蓝莓破碎液；
9.(3)在蓝莓破碎液中加入乙酸乙酯进行萃取，得乙酸乙酯萃进行取液，将乙酸乙酯萃取液浓缩干燥后得乙酸乙酯萃取物；
10.(4)将乙酸乙酯萃取物进一步采用制备型液相色谱仪进行洗脱分离，将洗脱液浓缩干燥后得蓝莓提取物。
11.发明人在研究中表明，将蓝莓破碎液经乙酸乙酯萃取然后再经制备型液相色谱仪制备得到的蓝莓提取物，其具有优异的降血脂以及减肥作用。
12.优选地，步骤(1)中所述的水为1～3℃的水。
13.优选地，步骤(1)中蓝莓鲜果与水的用量比为1kg:6～12l。
14.最优选地，步骤(1)中蓝莓鲜果与水的用量比为1kg:8l。
15.优选地，步骤(2)中将破碎混合液进行固液分离的具体方法为：将破碎混合液先进
行离心，然后将上清液进行过滤，取滤液即得所述的蓝莓破碎液。
16.优选地，步骤(3)中蓝莓破碎液与乙酸乙酯的体积比为1:0.5～3；
17.进一步优选地，步骤(3)中蓝莓破碎液与乙酸乙酯的体积比为1:1～2。
18.优选地，步骤(4)中所述制备型液相色谱仪的具体条件为：色谱柱选用反相制备型色谱柱；检测波长为300～330nm；柱温度为20～30℃；以含0.05～0.2(体积)％三氟乙酸的水溶液为流动相a，以含0.05～0.2(体积)％三氟乙酸的甲醇溶液为流动相b，进行梯度洗脱。
19.进一步优选地，步骤(4)中所述制备型液相色谱仪的具体条件为：色谱柱选用c18反相制备型色谱柱；检测波长为315nm；柱温度为25℃；以含0.1(体积)％三氟乙酸的水溶液为流动相a，以含0.1(体积)％三氟乙酸的甲醇溶液为流动相b，进行梯度洗脱。
20.优选地，所述的梯度洗脱的具体条件包括：0～3min，流动相b的体积变化为0～8％；3～11min，流动相b的体积变化为8～22％；11～19min，流动相b的体积为22％保持不变；收集15.9min～18.3min时间段内洗脱下来的洗脱液，浓缩干燥后即得所述的蓝莓提取物。
21.发明人需要强调的是采用本发明所述的方法将蓝莓破碎液经乙酸乙酯萃取然后再经制备型液相色谱仪制备蓝莓提取物；其中制备型液相色谱仪的梯度洗脱条件对于能否制备得到具有优异降血脂以及减肥作用的蓝莓提取物起着决定性作用；不同梯度洗脱条件下制备得到的蓝莓提取物的降血脂以及减肥作用是截然不同的；发明人经大量的实验研究表明，在上述制备型液相色谱仪的梯度洗脱条件下制备得到的蓝莓提取物，其降血脂以及减肥作用远远高于在其它梯度洗脱条件下制备得到的蓝莓提取物；现有研究表明，只有在本发明上述制备型液相色谱仪的梯度洗脱条件下制备得到的蓝莓提取物才具备优异的降血脂以及减肥作用。
22.本发明还提供了一种由上述制备方法制备得到的蓝莓提取物。
23.优选地，所述的蓝莓提取物在制备具有降血脂和/或减肥作用的药物或食品中的应用。
24.有益效果：本发明提供了一种全新的蓝莓提取物的制备方法；该方法首先将蓝莓破碎液经乙酸乙酯萃取，然后再经制备型液相色谱仪制备得到的蓝莓提取物；研究表明，在本发明所述制备型液相色谱仪的梯度洗脱条件下制备得到的蓝莓提取物具有优异的降血脂以及减肥作用；因此，可以进一步将本发明所述的蓝莓提取物作为有效成分用于开发具有降血脂和/或减肥作用的药物或食品。
具体实施方式
25.下面将结合实施例对本发明技术方案进行清楚、完整地描述。显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有作出创造性劳动前提下所获得的所有其它实施例，都属于本发明保护的范围。
26.实施例1蓝莓提取物的制备
27.(1)取蓝莓鲜果，然后加入2℃的水进行破碎，得破碎混合液；其中蓝莓鲜果与水的用量比为1kg:8l；
28.(2)将破碎混合液先进行离心，然后将上清液进行过滤，取滤液即得所述的蓝莓破碎液；
29.(3)在蓝莓破碎液中加入乙酸乙酯进行萃取，得乙酸乙酯萃取液，将乙酸乙酯萃取液浓缩干燥后得乙酸乙酯萃取物；其中，蓝莓破碎液与乙酸乙酯的体积比为1:1；
30.(4)将乙酸乙酯萃取物进一步采用制备型液相色谱仪进行洗脱分离，将洗脱液浓缩干燥后得蓝莓提取物；
31.步骤(4)中所述制备型液相色谱仪的具体条件为：色谱柱选用c18反相制备型色谱柱；检测波长为315nm；柱温度为25℃；以含0.1(体积)％三氟乙酸的水溶液为流动相a，以含0.1(体积)％三氟乙酸的甲醇溶液为流动相b，进行梯度洗脱；
32.所述的梯度洗脱的具体条件包括：0～3min，流动相b的体积变化为0～8％；3～11min，流动相b的体积变化为8～22％；11～19min，流动相b的体积为22％保持不变；收集15.9min～18.3min时间段内洗脱下来的洗脱液，浓缩干燥后即得所述的蓝莓提取物。
33.对比例1蓝莓提取物的制备
34.(1)取蓝莓鲜果，然后加入2℃的水进行破碎，得破碎混合液；其中蓝莓鲜果与水的用量比为1kg:8l；
35.(2)将破碎混合液先进行离心，然后将上清液进行过滤，取滤液即得所述的蓝莓破碎液；
36.(3)在蓝莓破碎液中加入乙酸乙酯进行萃取，得乙酸乙酯萃取液，将乙酸乙酯萃取液浓缩干燥后得乙酸乙酯萃取物，即所述的蓝莓提取物；蓝莓破碎液与乙酸乙酯的体积比为1:1。
37.对比例1与实施例1的区别在于，仅仅将蓝莓破碎液经乙酸乙酯萃取后，取乙酸乙酯萃取物即得所述的蓝莓提取物；而实施例1则是进一步将乙酸乙酯萃取物用制备型液相色谱仪进一步浓缩富集有效成分，进而得到蓝莓提取物。
38.对比例2蓝莓提取物的制备
39.(1)取蓝莓鲜果，然后加入2℃的水进行破碎，得破碎混合液；其中蓝莓鲜果与水的用量比为1kg:8l；
40.(2)将破碎混合液先进行离心，然后将上清液进行过滤，取滤液即得所述的蓝莓破碎液；
41.(3)在蓝莓破碎液中加入乙酸乙酯进行萃取，得乙酸乙酯萃取液，将乙酸乙酯萃取液浓缩干燥后得乙酸乙酯萃取物；其中，蓝莓破碎液与乙酸乙酯的体积比为1:1；
42.(4)将乙酸乙酯萃取物进一步采用制备型液相色谱仪进行洗脱分离，将洗脱液浓缩干燥后得蓝莓提取物；
43.步骤(4)中所述制备型液相色谱仪的具体条件为：色谱柱选用c18反相制备型色谱柱；检测波长为315nm；柱温度为25℃；以含0.1(体积)％三氟乙酸的水溶液为流动相a，以含0.1(体积)％三氟乙酸的甲醇溶液为流动相b，进行梯度洗脱；
44.所述的梯度洗脱的具体条件包括：0～11min，流动相b的体积变化为0～22％；11～19min，流动相b的体积为22％保持不变；收集15.9min～18.3min时间段内洗脱下来的洗脱液，浓缩干燥后即得所述的蓝莓提取物。
45.对比例2与实施例1的区别在于，制备型液相色谱仪的梯度洗脱条件不同；对比例2
的梯度洗脱条件为：0～11min，流动相b的体积变化为0～22％；11～19min，流动相b的体积为22％保持不变；收集15.9min～18.3min时间段内洗脱下来的洗脱液。而实施例1的梯度洗脱条件为：0～3min，流动相b的体积变化为0～8％；3～11min，流动相b的体积变化为8～22％；11～19min，流动相b的体积为22％保持不变；收集15.9min～18.3min时间段内洗脱下来的洗脱液。
46.对比例3蓝莓提取物的制备
47.(1)取蓝莓鲜果，然后加入2℃的水进行破碎，得破碎混合液；其中蓝莓鲜果与水的用量比为1kg:8l；
48.(2)将破碎混合液先进行离心，然后将上清液进行过滤，取滤液即得所述的蓝莓破碎液；
49.(3)在蓝莓破碎液中加入乙酸乙酯进行萃取，得乙酸乙酯萃取液，将乙酸乙酯萃取液浓缩干燥后得乙酸乙酯萃取物；其中，蓝莓破碎液与乙酸乙酯的体积比为1:1；
50.(4)将乙酸乙酯萃取物进一步采用制备型液相色谱仪进行洗脱分离，将洗脱液浓缩干燥后得蓝莓提取物；
51.步骤(4)中所述制备型液相色谱仪的具体条件为：色谱柱选用c18反相制备型色谱柱；检测波长为315nm；柱温度为25℃；以含0.1(体积)％三氟乙酸的水溶液为流动相a，以含0.1(体积)％三氟乙酸的甲醇溶液为流动相b，进行梯度洗脱；
52.所述的梯度洗脱的具体条件包括：0～3min，流动相b的体积变化为0～15％；3～11min，流动相b的体积变化为15～25％；11～19min，流动相b的体积为25％保持不变；收集15.9min～18.3min时间段内洗脱下来的洗脱液，浓缩干燥后即得所述的蓝莓提取物。
53.对比例3与实施例1的区别在于，制备型液相色谱仪的梯度洗脱条件不同；对比例3的梯度洗脱条件为：0～3min，流动相b的体积变化为0～15％；3～11min，流动相b的体积变化为15～25％；11～19min，流动相b的体积为25％保持不变；收集15.9min～18.3min时间段内洗脱下来的洗脱液。而实施例1的梯度洗脱条件为：0～3min，流动相b的体积变化为0～8％；3～11min，流动相b的体积变化为8～22％；11～19min，流动相b的体积为22％保持不变；收集15.9min～18.3min时间段内洗脱下来的洗脱液。
54.实验例1降脂减肥活性评价
55.高脂肥胖模型小鼠模型构建方法：取spf级6周龄16-20g雄性c57bl/6雄性小鼠；适应性饲养5天后，小鼠喂食高脂肥胖模型饲料(tp23300型60％高脂肥胖模型饲料)诱导肥胖模型，肥胖模型饲料喂养第4周(第28天)，构建高脂肥胖模型小鼠。
56.取高脂高糖肥胖模型小鼠随机分为5组(每组10只)，分别为模型组(不给药)、实验组1(给药实施例1制备得到的蓝莓提取)、对照组1(给药对比1制备得到的蓝莓提取)、对照组2(给药对比2制备得到的蓝莓提取)、对照组3(给药对比3制备得到的蓝莓提取)，继续喂食高脂肥胖模型饲料。另外取10只正常小鼠喂食正常饲料作为空白组对照。将待测蓝莓提取物按2.0mg/ml溶于水中，实验组和对照组按150mg/(kg
·
d)的给药剂量给药进行灌胃给药；空白组和模型组分别灌胃等量的水。连续给药8周后，所有小鼠禁食12h后，异氟烷麻醉，经眼眶静脉丛采血，4000rpm离心分取血清，按试剂盒说明书方法测定血清中甘油三酯、总胆固醇、低密度脂蛋白固醇、高密度脂蛋白固醇的含量。实验结果见表1。
57.表1.本发明蓝莓提取物降脂减肥活性实验结果
[0058][0059][0060]
*
，相比于肥胖模型组，p＜0.05，
**
，相比于肥胖模型组，p＜0.01；
#
，相比于空白组组，p＜0.05，
##
，相比于空白组，p＜0.01。
[0061]
由表1实验数据可以看出，模型组小鼠血清中的甘油三酯、总胆固醇以及低密度脂蛋白固醇等脂质水平显著高于空白组；这说明高脂肥胖模型小鼠模型构建成功。
[0062]
由表1实验数据还可以看出，实验组1小鼠血清中的甘油三酯、总胆固醇以及低密度脂蛋白固醇等脂质水平远远小于对照组1小鼠血清中的甘油三酯、总胆固醇以及低密度脂蛋白固醇等脂质水平；且实验组1小鼠血清中的甘油三酯、总胆固醇以及低密度脂蛋白固醇等脂质水平与空白组趋于接近；这说明：将蓝莓破碎液经乙酸乙酯萃取然后再经制备型液相色谱仪制备得到的蓝莓提取物，其降血脂以及减肥作用远远好于仅仅经乙酸乙酯萃取得到的蓝莓提取物，具有十分优异的降血脂以及减肥作用。
[0063]
由表1实验数据还可以看出，对照组2小鼠血清中的甘油三酯、总胆固醇以及低密度脂蛋白固醇等脂质水平与对照组1相比改善得并不明显；对照组3小鼠血清中的甘油三酯、总胆固醇以及低密度脂蛋白固醇等脂质水平与对照组1相比，并无得到改善；且对照组2和3小鼠血清中的甘油三酯、总胆固醇以及低密度脂蛋白固醇等脂质水平远远高于实验组1。这说明：采用本发明所述的方法将蓝莓破碎液经乙酸乙酯萃取然后再经制备型液相色谱仪制备蓝莓提取物；其中制备型液相色谱仪的梯度洗脱条件对于能否制备得到具有优异降血脂以及减肥作用的蓝莓提取物起着决定性作用；梯度洗脱条件的选取不当，不但不能有效地提高制备得到的蓝莓提取物的降血脂以及减肥作用，有可能也会降低蓝莓提取物的降血脂以及减肥作用；上述实验结果表明，在本发明所述的制备型液相色谱仪的梯度洗脱条件下制备得到的蓝莓提取物，其降血脂以及减肥作用远远高于在其它梯度洗脱条件下制备得到的蓝莓提取物；并且只有在本发明所述的制备型液相色谱仪的梯度洗脱条件下制备得到的蓝莓提取物才具备优异的降血脂以及减肥作用，在其它制备型液相色谱仪的梯度洗脱条件下制备得到的蓝莓提取物并未显示出优异的降血脂以及减肥作用。
[0064]
最后说明的是，以上优选实施例仅用以说明本发明的技术方案而非限制，尽管通过上述优选实施例已经对本发明进行了详细的描述，但本领域技术人员应当理解，可以在形式上和细节上对其作出各种各样的改变，而不偏离本发明权利要求书所限定的范围。