一种海胆状金@钯纳米颗粒及其制备方法与应用

1.本发明属于伤口修复技术领域，具体涉及一种海胆状金@钯纳米颗粒及其制备方法与应用，尤其涉及不同稀疏程度的海胆状金@钯纳米颗粒在制备促进伤口愈合的各个阶段的药物中的应用。


背景技术：

2.伤口的愈合过程是一个复杂精细的生理过程，多种细胞和生物因子均会参与这一过程并发挥各自独特的作用，愈合过程主要分为四个阶段：止血阶段、炎症阶段、增殖阶段和重塑阶段。当前，各种纳米材料已被广泛的用于加速伤口愈合过程的研究中。有文献表明，纳米材料能够通过纳米桥连效应快速粘合皮肤组织，加速伤口愈合，并且纳米材料在光照下产生自由基以杀死伤口周围细菌，加速炎症阶段进程。但是，现有技术中大多数纳米材料都只能促进伤口愈合的某个单一阶段的进程，无法对多阶段进程促进，也就极大的限制了伤口愈合的效率。
3.巨噬细胞在伤口愈合的增殖、重塑阶段发挥着重要作用。纳米拓扑结构近年来被发现能够促进巨噬细胞向m2表型极化，以促进细胞增殖、肉芽组织形成、血管和细胞外基质的形成。然而鲜少有报道表面具有拓扑结构的纳米颗粒的合成，对于其表面拓扑结构稀疏程度的调节更鲜少报道。


技术实现要素：

4.本发明为解决现有技术中大多数纳米材料都只能促进伤口愈合的某个单一阶段的进程，无法对多阶段进程促进的技术问题，提供一种海胆状金@钯纳米颗粒及其制备方法与应用，该海胆状金@钯纳米颗粒表面拓扑结构稀疏程度可调节。
5.本发明为解决上述技术问题采取的技术方案如下：
6.本发明提供一种海胆状金@钯纳米颗粒，该纳米颗粒由金纳米球和n个钯刺组成，n个钯刺修饰在金纳米球的表面上，n≥1。
7.优选的是，所述金纳米球的粒径为18-22nm，钯刺的粒径为8-11nm。
8.优选的是，所述n为10-29的整数，n个钯刺均匀的分布在金纳米球的表面上。
9.本发明还提供上述海胆状金@钯纳米颗粒的制备方法，包括如下步骤：
10.步骤一、将柠檬酸钠水溶液a加热至100℃后，搅拌15min，加入氯金酸水溶液a，搅拌15min，降温至85-95℃后，加入柠檬酸钠水溶液b和氯金酸水溶液b，搅拌30min，得到含有金纳米球的胶体；
11.所述柠檬酸钠水溶液a中的柠檬酸钠、氯金酸水溶液a中的氯金酸、柠檬酸钠水溶液b中的柠檬酸钠和氯金酸水溶液b中的氯金酸的物质的量比为 66:5:12:5；氯金酸水溶液a和氯金酸水溶液b的浓度均为25mm，柠檬酸钠水溶液a的浓度为2.2mm，柠檬酸钠水溶液b的浓度为60mm；
12.步骤二、将步骤一得到的含有金纳米球的胶体加入搅拌至透明的溶液a中混合均
匀，得到混合溶液，混合溶液在400nm处的吸光度值为0.15-0.25；
13.所述溶液a为含有十六烷基氯化吡啶一水合物和十六烷基三甲基氯化铵中的一种或两种的水溶液，十六烷基氯化吡啶一水合物与十六烷基三甲基氯化铵的物质的量浓度比为(0-10):(0-9)；
14.步骤三、将步骤二得到的混合溶液加热到60-70℃，搅拌30min后，加入氯钯酸钠水溶液，以900rpm的转速搅拌2-5min后，一次性加入抗坏血酸水溶液，以900rpm的转速搅拌2-5min后，静止老化30min，离心，得到海胆状金@钯纳米颗粒；
15.以20ml混合溶液计，氯钯酸钠的物质的量为4
×
10-6
mol，氯钯酸钠和抗坏血酸的物质的量比为1:10。
16.进一步的，所述步骤一中，降温到90℃。
17.进一步的，所述步骤二中，混合溶液在400nm处的吸光度值为0.2。
18.进一步的，所述步骤三中，加热到65℃。
19.进一步的，所述步骤三中，氯钯酸钠水溶液的浓度为10mm，抗坏血酸水溶液的浓度为100mm。
20.进一步的，所述步骤三中，离心的转速为8000rpm，离心的时间为10min。
21.本发明还提供上述海胆状金@钯纳米材料在制备促进伤口愈合各个阶段的药物中的应用。
22.优选的是，所述各个阶段为止血阶段、炎症阶段、增殖阶段和重塑阶段。
23.本发明的原理为：本发明提供的海胆状金@钯纳米颗粒能够在伤口愈合的各个阶段发挥作用，多阶段、程序性促进伤口愈合进程。首先，在止血阶段，海胆状金@钯纳米颗粒基于其金属组分和纳米尺度特性，充分发挥纳米桥连作用，粘附皮肤和封闭伤口，确保伤口组织粘连，达到止血目的，促进止血阶段的伤口愈合。随后，通过金钯的结构异质、费米能级差异及等离子共振特性，促进温和白光照射下的电子由金向钯上的迁移，产生的活性氧自由基能够用于细菌生长抑制，促进炎症阶段的伤口愈合。最后，纳米颗粒能够在增殖阶段和重塑阶段，通过其海胆状形貌诱导巨噬细胞向m2型极化，释放多种细胞因子，分泌il-10等抗炎因子，促进增殖和重塑阶段的伤口愈合。
24.与现有技术相比，本发明的有益效果为：
25.本发明的海胆状金@钯纳米颗粒的制备方法，通过调控含有金纳米球的胶体与溶液a(含有十六烷基氯化吡啶一水合物和十六烷基三甲基氯化铵中的一种或两种的水溶液)之间的浓度比，控制钯刺在金纳米球表面均匀分布的数量，实现海胆状金@钯纳米颗粒表面拓扑结构稀疏程度可调节。
26.本发明的海胆状金@钯纳米颗粒的制备方法，反应条件稳定、温和，制备的海胆状金@钯纳米颗粒形貌、大小均一，且具有良好的生物相容性，具有良好的临床转化可能性。
27.本发明的海胆状金@钯纳米颗粒能够多阶段、程序性促进伤口愈合进程，在伤口愈合的各个阶段均能发挥有效作用。
附图说明
28.为了更清楚地说明本发明实施例中的技术方案，下面将对实施例中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的一些实施例，对于本领
域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其它的附图。
29.图1为本发明实施例1制备的20nm金纳米球tem图。
30.图2为本发明实施例1制备的表面均匀分布12
±
2个钯刺的海胆状金@钯纳米颗粒(aupd sh1)tem图。
31.图3为本发明实施例2制备的表面均匀分布16
±
3个钯刺的海胆状金@钯纳米颗粒(aupd sh2)tem图。
32.图4为本发明实施例3制备的表面均匀分布25
±
4个钯刺的海胆状金@钯纳米颗粒(aupd sh3)tem图。
33.图5为本发明实施例1-3制备的三种海胆状金@钯纳米颗粒(aupd sh1-3)作用下小鼠的皮肤拉力测试。
34.图6为本发明实施例1-3制备的三种海胆状金@钯纳米颗粒(aupd sh1-3)作用以及白光照射下的抗菌性能测试。
35.图7为本发明实施例1-3制备的三种海胆状金@钯纳米颗粒(aupd sh1-3)作用下，il-10细胞因子的分泌。
36.图8为本发明实施例2制备的海胆状金@钯纳米颗粒(aupd sh2)处理小鼠创伤模型图片及伤口愈合曲线。其中，control为空白实验。
具体实施方式
37.为了进一步理解本发明，下面对本发明优选实施方案进行描述，但是应当理解，这些描述只是为进一步说明本发明的特征和优点，而不是对本发明权利要求的限制。
38.本发明的海胆状金@钯纳米颗粒，该纳米颗粒由金纳米球和n个钯刺组成， n个钯刺修饰在金纳米球的表面上，形成异质结结构，n≥1。
39.上述技术方案中，金纳米球的粒径为20nm，钯刺的粒径为8nm。
40.上述技术方案中，n为10-29的整数，如12
±
2、16
±
3、25
±
4个，n个钯刺均匀的分布在金纳米球的表面上，以便于得到形貌和在促进伤口愈合的各个阶段功能最大化的异质材料。
41.本发明的海胆状金@钯纳米颗粒的制备方法，步骤如下：
42.步骤一、将柠檬酸钠水溶液a加热至100℃后，搅拌15min，加入氯金酸水溶液a，搅拌15min，降温至85-95℃后，加入柠檬酸钠水溶液b和氯金酸水溶液b，搅拌30min，得到含有金纳米球的胶体；
43.其中，柠檬酸钠水溶液a中的柠檬酸钠、氯金酸水溶液a中的氯金酸、柠檬酸钠水溶液b中的柠檬酸钠和氯金酸水溶液b中的氯金酸的物质的量比为 66:5:12:5；氯金酸水溶液a和氯金酸水溶液b的浓度均为25mm，柠檬酸钠水溶液a的浓度为2.2mm，柠檬酸钠水溶液b的浓度为60mm；优选降温到90℃。
44.步骤二、将步骤一得到的含有金纳米球的胶体加入搅拌至透明的溶液a中混合均匀，得到混合溶液，混合溶液在400nm处的吸光度值为0.15-0.25；
45.其中，溶液a为含有十六烷基氯化吡啶一水合物和十六烷基三甲基氯化铵中的一种或两种的水溶液，十六烷基氯化吡啶一水合物与十六烷基三甲基氯化铵的物质的量浓度
比为(0-10):(0-9)；优选混合溶液在400nm处的吸光度值为0.2；混合均匀的方式优选为超声。
46.步骤三、将步骤二得到的混合溶液加热到60-70℃，搅拌30min后，加入氯钯酸钠水溶液，以900rpm的转速搅拌2-5min后，一次性加入抗坏血酸水溶液，以900rpm的转速搅拌2-5min后，静止老化30min，离心，得到海胆状金@钯纳米颗粒；
47.其中，以20ml混合溶液计，氯钯酸钠的物质的量为4
×
10-6
mol，氯钯酸钠和抗坏血酸的物质的量比为1:10；优选氯钯酸钠水溶液的浓度为10mm，抗坏血酸水溶液的浓度为100mm；优选加热到65℃；优选离心的转速为8000rpm，离心的时间为10min。
48.本发明还提供上述海胆状金@钯纳米材料在制备促进伤口愈合各个阶段的药物中的应用。各个阶段指止血阶段、炎症阶段、增殖阶段和重塑阶段。
49.在本发明中所使用的术语，一般具有本领域普通技术人员通常理解的含义，除非另有说明。为了使本领域的技术人员更好地理解本发明的技术方案，下面将结合实施例对本发明作进一步的详细介绍。
50.在以下实施例中，未详细描述的各种过程和方法是本领域中公知的常规方法。下述实施例中所用的材料、试剂、装置、仪器、设备等，如无特殊说明，均可从商业途径获得。
51.以下结合实施例进一步说明本发明。
52.实施例1
53.步骤一、金纳米球的合成
54.将150ml 2.2mm柠檬酸钠水溶液加热至沸腾，搅拌15min后加入1ml25mm氯金酸水溶液，搅拌15min，此时溶液逐渐由蓝灰色变为浅粉色，降温至90℃后，加入1ml 60mm柠檬酸钠水溶液和1ml 25mm氯金酸水溶液，搅拌 30min，得到含有金纳米球(粒径为20nm)的胶体，其tem图如图1所示。
55.步骤二、将20ml含有1mm十六烷基氯化吡啶一水合物和9mm十六烷基三甲基氯化铵的水溶液搅拌至透明，加入0.2ml步骤一的含有金纳米球的胶体，超声15min，得到混合溶液；
56.步骤三、将20ml步骤二得到的混合溶液加热至65℃，搅拌30min后，加入0.4ml 10mm氯钯酸钠水溶液，以900rpm的转速搅拌2min后，一次性加入 0.4ml 0.1m抗坏血酸水溶液，以900rpm的转速搅拌2min后，静止老化30min，以8000rpm的转速离心10min后，得到12
±
2个钯刺的海胆状金@钯纳米颗粒 (aupd sh1)，tem图如图2所示。
57.实施例2
58.步骤一、与实施例1相同
59.步骤二、将20ml含有10mm十六烷基氯化吡啶一水合物溶液搅拌至透明，加入0.2ml步骤一的含有金纳米球的胶体，超声15min，得到混合溶液；
60.步骤三、将20ml步骤二得到的混合溶液加热至65℃，搅拌30min后，加入0.4ml 10mm氯钯酸钠水溶液，以900rpm的转速搅拌2min后，一次性加入 0.4ml 0.1m抗坏血酸水溶液，以900rpm的转速搅拌2min后，静止老化30min，以8000rpm的转速离心10min后，得到表面均匀分布16
±
3个钯刺的海胆状金@ 钯纳米颗粒(aupd sh2)的合成，tem图如图3所示。
61.实施例3
62.步骤一、与实施例1相同
63.步骤二、将20ml含有3mm十六烷基氯化吡啶一水合物和6mm十六烷基三甲基氯化铵的水溶液搅拌至透明，加入0.2ml步骤一的含有金纳米球的胶体，超声15min，得到混合溶液；
64.步骤三、将20ml步骤二得到的混合溶液加热至65℃，搅拌30min后，加入0.4ml 10mm氯钯酸钠水溶液，以900rpm的转速搅拌2min后，一次性加入 0.4ml 0.1m抗坏血酸水溶液，以900rpm的转速搅拌2min后，静止老化30min。以8000rpm的转速离心10min后，得到表面均匀分布25
±
4个钯刺的海胆状金@ 钯纳米颗粒(aupd sh3)，tem图如图4所示。
65.对实施例1至实施例3制备的海胆状金@钯纳米颗粒的促进各个阶段伤口愈合能力进行检测。
66.1.在三种海胆状金@钯纳米颗粒(aupd sh1-3)作用下小鼠的皮肤拉力测试
67.在两片balb/c小鼠背部割取的皮肤上分别滴加20μl含有aupd sh1-3(浓度为5mg ml-1
)的pbs缓冲液，将两片皮肤滴加液体处叠放一起并按压20s。随后用shimadzu asd-x以1mm min-1
的速度拉伸这两块皮肤，检测粘合处的拉力，得到粘合处的拉力曲线如图5所示。结果表明，与空白组相比较，aupdsh2 的粘连效果最强，随后为aupdsh3和aupd sh1。
68.2.在三种海胆状金@钯纳米颗粒(aupd sh1-3)作用以及白光照射下的抗菌性能测试
69.选取大肠杆菌和葡萄球菌作为革兰氏阳性、革兰氏阴性细菌的代表，检测纳米粒子在白光照射下的杀菌性能。
70.将两种细菌在20ml lb培养基(含有胰蛋白胨5g l-1
，酵母粉10g l-1
和氯化钠5g l-1
)，37℃条件下，以180rpm转速摇晃培养12h。随后将细菌稀释至 106cfu ml-1
，150μl加入至分别含有400μg ml-1
的aupd sh1-3溶液中，在0.1wcm-2
的白光下照射20min，继续培育6h。将所得菌液稀释106倍，取100μl进行平板涂布，将平板在37℃下培养24h，随后拍照并记录菌落的个数，所得结果如图6所示。结果表明，在白光照射后，与空白组相比较，aupd sh3抑制细菌生长的能力最强，其次为aupd sh2，能力最弱的为aupd sh1。
71.3.在三种海胆状金@钯纳米颗粒(aupd sh1-3)作用下，elisa检测il-10细胞因子的分泌
72.将raw264.7细胞以每孔1
×
104个细胞的密度，置于96孔板中，用100μl 细胞培养基孵育24h。分别用aupd hs1-3以50、25、12.5μgml-1
三种浓度处理raw细胞24h。收集细胞上清，采用elisa法检测il-10含量，结果如图7所示。结果表明，与空白组相比较，aupd sh2能够促使巨噬细胞分泌更多的il-10 细胞因子，其次为aupd sh1和aupd sh3。
73.4.海胆状金@钯纳米颗粒(aupd sh2)处理小鼠创伤模型
74.8周龄雌性balb/c小鼠购于北京维通利华动物科技有限公司，所有的动物都在标准的实验室条件下培养。将小鼠分为4组：(a)pbs-dark，(b)pbs-light，(c)aupd sh2-dark，(d)aupd sh2-light。在造模前，用脱毛膏脱去小鼠背部毛发，随后将小鼠麻醉后，在背部用手术刀割长为15mm的伤口。每只老鼠的伤口处分别滴加pbs，aupd sh2纳米颗粒溶液，b，d组小鼠在0.1w cm-2
白光下照射20min。观测小鼠14天内伤口愈合的情况，所得伤口大小记录如图8所示。结果表明，在白光照射下，海胆状aupd sh纳米颗粒，能够在伤口愈合的各个阶段发挥作用，有效的促进伤口的愈合。
75.显然，上述实施方式仅仅是为清楚地说明所作的举例，而并非对实施例的限定。对
于所属领域的普通技术人员来说，在上述说明的基础上还可以做出其它不同形式的变化或变动。这里无需也无法对所有实施例予以穷举。而由此所引申出的显而易见的变化或变动仍处于本发明创造的保护范围之中。