1.本发明涉及一种机械增强型脱细胞猪角膜后板层载体支架制备方法及应用，属于生物组织工程中的角膜载体支架技术领域。
背景技术：
2.角膜是一种高度特化的眼表透明组织，在保护眼球和维持视功能方面具有无法替代的作用。角膜内皮位于角膜的最内层，完整的单层人角膜内皮具有内皮泵和角膜-房水屏障功能，对维持角膜的半脱水状态、正常厚度、透明性以及从房水中获取养分与氧气具有无法替代的作用。但这层细胞在成年后丧失了分裂能力，且以每年0.3%~0.6%的速率逐年死亡，若受到感染（包括细菌、真菌和病毒）、手术损伤（如白内障手术等）和长期高眼压胁迫等则死亡速率更快。足够的角膜内皮细胞数量是保障角膜内皮层功能的主要因素，局部细胞的死亡只能依靠邻近细胞的扩展和移行来修补，一旦人角膜内皮细胞的密度低于维持角膜内皮生理功能之临界密度后就会引起不可逆病变，即角膜内皮功能失代偿，引起角膜内皮盲。另外，当病理感染突破内皮深达角膜基质时，往往会伤及深层角膜基质层和内皮层，造成后板层角膜的损伤甚至致盲。角膜内皮及后板层病盲患者绝大部分可以通过角膜移植而复明，但由于捐献角膜的数量非常有限，致使大量患者因得不到移植角膜而无法复明。近年来，角膜组织工程的兴起与发展为组织工程角膜内皮及后板层的体外构建及其临床应用创造了条件，也为角膜病盲患者通过组织工程角膜的移植重见光明带来了新的希望，但如何获得正常足量的人角膜种子细胞和理想的载体支架仍然是当前组织工程角膜体外构建研究的热点和难点。
3.在种子细胞方面，樊廷俊等在国际上成功建立了非转染无致瘤性的人角膜内皮（zl200510044143.3）、上皮（zl201110039014.0）和基质组织细胞系，首次解决了组织工程角膜规模化构建所需大量种子细胞的来源问题。
4.在载体支架方面，目前用于组织工程角膜体外构建所用的载体支架主要有角膜后弹力层、去上皮羊膜、胶原-壳聚糖-硫酸软骨素共混膜、胶原-壳聚糖-透明质酸钠、聚羟乙基丙烯酸甲酯、脱细胞猪角膜基质和n-(1-甲基乙基)-2-丙烯酰胺均聚物等，学者们利用这些载体支架和角膜种子细胞分别构建出具有近似角膜内皮及后板层结构和部分角膜内皮及后板层功能的角膜类似物，为利用载体支架和种子细胞构建组织工程角膜开辟了道路。其中，脱细胞猪角膜作为天然材料，其具备与人角膜内皮细胞较好的生物相容性，因而在载体支架的应用上存在更加无可比拟的优势。然而目前制备的已有的脱细胞猪角膜用于组织工程人角膜内皮的体外构建时均存在一定的缺陷，包括大部分脱细胞猪角膜为带前弹力层而不是带人角膜内皮细胞天然附着载体-后弹力层的角膜基质，另外未对支架硬度进行精确调控，一方面不能满足细胞的信号传导、应答以及细胞行为的定向调控，另一方面无法应用于对支架硬度有一定要求的临床角膜内皮移植手术，如供体内皮或后板层移植的后弹力层自动剥离角膜内皮移植术（dsaek）等。因此，如何筛选和制备出具有高仿生、机械性强、透明性好的可定向调控细胞行为的理想载体支架，仍然是制约组织工程角膜内皮或后板层规
模化生产和应用的瓶颈问题。
5.因此，建立理想机械性能载体支架的制备技术，力争早日实现组织工程角膜内皮或后板层的规模化生产及其临床应用，已成为各国学者们竞相开展角膜组织工程研究的主攻目标，也是全世界角膜病盲患者重见光明的希望所在。
技术实现要素：
6.本发明的目的是提供一种机械增强型脱细胞猪角膜后板层载体支架制备方法及应用，该方法利用新鲜猪角膜制备机械增强型脱细胞猪角膜后板层，使其作为临床移植手术的机械性能理想的载体支架，从而克服现有技术的不足。
7.一种机械增强型脱细胞猪角膜后板层载体支架的制备方法，其特征是包括以下步骤：1）角膜片的取材与溶胀：取新鲜猪眼球，用含有1000 单位/毫升青链霉素混合液的0.9%（w/v）生理盐水冲洗干净后，使用测厚仪测量猪角膜厚度，用角膜板层刀头切除550微米厚度的角膜前板层，留取厚度100~350微米的猪角膜后板层，沿角巩膜缘将上述留取的猪角膜后板层从猪角膜上剪下，获得单独的猪角膜后板层；2）角膜后板层的反复冻融破碎细胞：再用超纯水对切取的角膜后板层溶胀2~3小时；将该角膜后板层在-80℃冰箱冻1~2小时后，于37℃融化10~30分钟，冻融重复2~3遍，以使角膜后板层内的细胞破碎；然后用漂洗缓冲液漂洗2次，每次15~20分钟；3）角膜后板层的脱细胞处理：将冻融漂洗后的角膜后板层放入角膜脱细胞专用溶液中6~8小时进行脱细胞处理，用漂洗缓冲液漂洗2次，每次15~20分钟，继而将角膜后板层片置于dna-rna酶专用溶液，于37℃处理1~2小时后，用漂洗缓冲液漂洗2次，每次15~20分钟，再用超纯水漂洗15~20分钟；4）脱细胞猪角膜后板层的硬化处理：将漂洗后的猪角膜后板层后弹力层面朝上，轻轻平铺于培养皿中，置于超净工作台内，无风状态48~72小时风干；将风干的脱细胞角膜后板层避光浸泡在角膜专用交联剂溶液中，于37℃恒温摇床缓慢摇动浸泡处理20~40分钟后，利用波长320~420纳米的紫外光照射20~40分钟，照射距离为3~6厘米；之后用0.9%（w/v）生理盐水漂洗2次，每次15~20分钟后，再用超纯水漂洗2次，每次15~20分钟；5）脱细胞猪角膜后板层的风干和灭菌：最后将交联漂洗后的脱细胞角膜后板层平铺于培养皿中，风干48~72小时后，使用剂量为14~25kgy的电离射线进行辐照灭菌，即制成机械增强型脱细胞猪角膜后板层载体支架。
8.所述步骤2）中的角膜脱细胞专用溶液的配方为：0.01m pbs缓冲液（ph7.4），0.5%（w/v）脱氧胆酸钠，0.04%（w/v）原钒酸钠。
9.所述步骤2）中的漂洗缓冲液为：0.01m pbs缓冲液（ph7.4）.所述步骤3）中的dna-rna酶专用溶液的配方为：0.01m pbs缓冲液（ph7.4），5~7单
位/毫升 dnase i，5~7微克/毫升rnase a。
10.所述步骤4）中的角膜专用交联剂溶液的配方为：150-200毫克/毫升右旋糖苷溶液，2-4毫克/毫升维生素b2。
11.上述方法制备的机械增强型脱细胞猪角膜后板层载体支架的应用：所述机械增强型脱细胞猪角膜后板层载体支架用于组织工程角膜内皮或角膜后板层的生产。
12.本发明的方法基于角膜后板层的组织结构，使用细胞裂解法，只针对细胞膜脂进行降解进而去除细胞成分，避免了传统使用去垢剂法带来的角膜结构及成分的剧烈破坏，也避免了单独使用酶（dna-rna酶）解法可能带来的免疫原性残留风险。同时，采用高剂量的角膜专用交联剂，调整了脱细胞猪角膜后板层的硬度，使其更能调控细胞生长并满足dsaek术式的需要。本发明通过实验发现角膜硬化交联步骤及风干步骤是确保机械强度的关键，为此设计了专用的角膜专用交联剂，并通过大量实验总结出了最适宜风干时长等参数，从而使本发明所得载体支架结构完整、机械强度更接近于天然角膜后板层、与人角膜内皮组织细胞具有良好的生物相容性、可应用于dsaek术式且其生产成本低，可以广泛地应用于组织工程角膜内皮及后板层的载体支架，适于规模化生产和临床应用。
具体实施方式
13.本发明涉及的各种溶液的配制方法：1、上述漂洗缓冲液的配制方法：取超纯水800毫升，加入7.9克nacl，0.2克kcl，1.05克k2hpo4，0.189克kh2po4，调ph值至7.4，定容至1000毫升；2、上述角膜脱细胞专用溶液的配制方法：取0.01m pbs缓冲液（ph7.4）800毫升，加入5克脱氧胆酸钠，0.4克原钒酸钠，调ph值至7.4，定容至1000毫升；3、上述dna-rna酶溶液的配制方法：取超纯水800毫升，加入15.764克tris-hcl，2.38克mgcl2，0.111克cacl2，调ph值至7.5，定容至1000毫升，4℃备用；使用前取100毫升加入500~700单位 dnase i 和500~700微克rnase a，即为本发明的dna-rna酶溶液；4、上述角膜专用交联剂溶液的配制：取生理盐水800毫升，加入150~200克右旋糖苷，再加入2~4克维生素b2，完全溶解后用生理盐水定容至1000毫升，即为本发明的角膜专用交联剂溶液。
14.本发明的具体实施步骤：1、角膜片的取材与溶胀：取新鲜猪眼球，用含有1000单位/毫升青链霉素混合液的0.9%（w/v）生理盐水冲洗干净后，使用测厚仪测量猪角膜厚度，用角膜板层刀头切除550微米厚度的角膜前板层，留取厚度100~350微米的猪角膜后板层，沿角巩膜缘将其从猪角膜上剪下，获得角膜后板层；2、角膜后板层的反复冻融破碎细胞：将角膜后板层浸入超纯水中，于37℃摇床中溶胀处理2~3小时；将角膜后板层放置在盛有漂洗缓冲液的50毫升离心管中，在-80℃冰箱冻1~2小时，于37℃融化10~30分钟，冻融重复2~3遍，以使角膜后板层内的细胞破碎；然后用漂洗缓冲液漂洗2次，每次15~20分钟；3、角膜后板层的脱细胞处理：将冻融漂洗后的角膜后板层放入角膜脱细胞专用溶液中6~8小时进行脱细胞处理，用漂洗缓冲液漂洗2次，每次15~20分钟，继而将角膜后板层片置于dna-rna酶专用溶液，于37℃处理1~2小时后，用漂洗缓冲液漂洗2次，每次15~20分
钟，再用超纯水漂洗15~20分钟；4、脱细胞猪角膜后板层的硬化处理：将漂洗后的猪角膜后板层后弹力层面朝上，轻轻平铺于塑料培养皿中，置于超净工作台内，无风状态48~72小时风干；将风干的脱猪细胞角膜后板层直接浸入角膜专用交联剂溶液中，于37℃恒温摇床缓慢摇动浸泡处理 20~40分钟后，利用波长320~420纳米的紫外光照射20~40分钟，照射距离为3~6厘米；之后用0.9%（w/v）生理盐水漂洗2次，每次15~20分钟后，再用超纯水漂洗2次，每次15~20分钟；5、脱细胞猪角膜后板层的风干和灭菌：将交联漂洗后的脱细胞猪角膜后板层平铺于塑料培养皿中，置于超净台无菌风干48~72小时后；使用剂量14~25kgy的电离射线进行电离辐射灭菌，即制成机械增强型脱细胞猪角膜后板层载体支架。
15.实施例1取新鲜猪眼球，用含有1000单位/毫升的青链霉素混合液的0.9%（w/v）生理盐水冲洗干净后，使用测厚仪测量猪角膜厚度，用角膜板层刀头切除550微米厚度的角膜前板层，留取的猪角膜后板层厚度为150微米，沿角巩膜缘将其从猪角膜上剪下，获得角膜后板层；将角膜后板层浸入到超纯水中，于37℃摇床中溶胀2小时；取超纯水800毫升，加入7.9克nacl，0.2克kcl，1.05克k2hpo4，0.189克kh2po4，调ph值至7.4，定容至1000毫升，配制成漂洗缓冲液；将角膜后板层放置在盛有漂洗缓冲液的50毫升离心管中，在-80℃冰箱冻1小时，于37℃融化10分钟，冻融重复2遍，使角膜后板层内的细胞破碎；然后用漂洗缓冲液漂洗2次，每次15分钟；取0.01m pbs缓冲液（ph7.4）800毫升，加入5克脱氧胆酸钠，0.4克原钒酸钠，调ph值至7.4，定容至1000毫升，制备角膜脱细胞专用溶液；将冻融漂洗后的角膜后板层放入角膜脱细胞专用溶液中6小时进行脱细胞处理，用漂洗缓冲液漂洗2次，每次15~20分钟；继而取超纯水800毫升，加入15.764克tris-hcl，2.38克mgcl2，0.111克cacl2，调ph值至7.5，定容至1000毫升，4℃备用；使用前取100毫升加入500单位 dnase i 和500微克 rnase a，配制成dna-rna酶溶液，将冻融漂洗后的角膜基质片放入dna-rna酶溶液，置37℃恒温摇床缓慢摇动处理1小时后，用漂洗缓冲液漂洗2次，再用超纯水漂洗1次，每次15分钟，获得脱细胞猪角膜后板层；再取生理盐水800毫升，加入150克右旋糖苷，再加入2克维生素b2，完全溶解后用生理盐水定容至1000毫升，制备出角膜专用交联剂溶液；将漂洗后的猪角膜后板层后弹力层面朝上，轻轻平铺于塑料培养皿中，置于超净工作台内，无风状态48小时风干；将风干的脱猪细胞角膜后板层直接浸入角膜专用交联剂溶液中，置37℃恒温摇床缓慢摇动处理处理 20分钟后，利用波长370纳米的紫外光照射20分钟，照射距离为6厘米；之后用0.9%（w/v）生理盐水漂洗2次，每次15分钟后，再用超纯水漂洗2次，每次15分钟；最后将漂洗后的脱细胞猪角膜后板层平铺于塑料培养皿中，置于超净台无菌风干48小时；最后使用剂量14千戈瑞的电离射线进行电离辐射灭菌，即制成了脱细胞猪角膜后板层，可以用于组织工程角膜内皮生产的载体支架。
16.实施例2取新鲜猪眼球，用含有1000单位/毫升的青链霉素混合液的0.9%（w/v）生理盐水冲洗干净后，使用测厚仪测量猪角膜厚度，用角膜板层刀头切除550微米厚度的角膜前板层，留取的猪角膜后板层厚度为350微米，沿角巩膜缘将其从猪角膜上剪下，获得角膜后板层；
将角膜后板层浸入到超纯水中，于37℃摇床中溶胀3小时；取超纯水800毫升，加入7.9克nacl，0.2克kcl，1.05克k2hpo4，0.189克kh2po4，调ph值至7.4，定容至1000毫升，配制成漂洗缓冲液；将角膜后板层放置在盛有漂洗缓冲液的50毫升离心管中，在-80℃冰箱冻2小时，于37℃融化30分钟，冻融重复3遍，使角膜后板层内的细胞破碎；然后用漂洗缓冲液漂洗2次，每次20分钟；取0.01m pbs缓冲液（ph7.4）800毫升，加入5克脱氧胆酸钠，0.4克原钒酸钠，调ph值至7.4，定容至1000毫升，制备角膜脱细胞专用溶液；将冻融漂洗后的角膜后板层放入角膜脱细胞专用溶液中8小时进行脱细胞处理，用漂洗缓冲液漂洗2次，每次20分钟；继而取超纯水800毫升，加入15.764克tris-hcl，2.38克mgcl2，0.111克cacl2，调ph值至7.5，定容至1000毫升，4℃备用；使用前取100毫升加入500单位 dnase i 和500微克 rnase a，配制成dna-rna酶溶液，将冻融漂洗后的角膜基质片放入dna-rna酶溶液，置37℃恒温摇床缓慢摇动处理2小时后，用漂洗缓冲液漂洗2次，再用超纯水漂洗1次，每次20分钟，获得脱细胞猪角膜后板层；再取生理盐水800毫升，加入200克右旋糖苷，再加入4克维生素b2，完全溶解后用生理盐水定容至1000毫升，制备出角膜专用交联剂溶液；将漂洗后的猪角膜后板层后弹力层面朝上，轻轻平铺于塑料培养皿中，置于超净工作台内，无风状态72小时风干；将风干的脱猪细胞角膜后板层直接浸入角膜专用交联剂溶液中，置37℃恒温摇床缓慢摇动处理处理 40分钟后，利用波长400纳米的紫外光照射40分钟，照射距离为3厘米；之后用0.9%（w/v）生理盐水漂洗2次，每次20分钟后，再用超纯水漂洗2次，每次20分钟；最后将漂洗后的脱细胞猪角膜后板层平铺于塑料培养皿中，置于超净台无菌风干72小时；最后使用剂量21kgy的电离射线进行电离辐射灭菌，即制成了脱细胞猪角膜后板层载体支架，可以用于组织工程角膜后板层生产的载体支架。