一种使用冷冻干燥技术制备可溶性微针贴片的方法

1.本发明涉及经皮给药、微针递药、微针制备领域，尤其是涉及一种使用冷冻干燥技术制备可溶性微针贴片的方法。


背景技术：

2.微针分为固体微针、中空微针、涂层微针、可溶性微针；其中可溶性微针因为不产生医疗废物，给药方便且生物相容性好等特点，是最有潜力的经皮给药方式之一。可溶性微针的制备，根据是否使用模具分为两大类，不使用模具的制备方法为液滴吹气法、离心光刻法和绘图光刻法；使用模具的制备方法为微成型法、热压印法和注射成型法；其中实验室制备和工业化生产最常用的是微成型法，即将配制的基质溶液经由离心法、真空法或喷雾法填充到微针模具的针腔中，经干燥一定时间后，剥离即得微针贴片。目前微针制备多选择常温干燥，但常温干燥耗时长，通常需要12小时以上，故干燥效率低，是微针工业化制备的限速步骤，且难以控制微针的批间差异性。特别对于蛋白多肽类药物、疫苗、基因治疗药物等热敏性成分，即使暴露在室温条件下也容易失活，长达12小时以上的常温干燥过程会大大降低它们的活性。常温干燥制得的微针含水量通常也较高，容易滋生微生物，不利于微针基质以及加载药物的质量稳定。有研究表明，微针能够成功递送至体内的药物主要集中在针尖部分，而背衬层中的药物几乎不能够透皮吸收，因此目前都主张使用两步法制备药物富集在微针针体中的双层微针，以减少宝贵的药物的浪费；在常温干燥条件下，为了避免针体基质以及药物复溶并扩散至背衬层，背衬层基质多使用有机溶剂溶液，如此才能制备出分层明显的双层载药微针，伴随而来的则是残留有机溶剂的安全性问题。


技术实现要素：

3.为解决现有微针制备方法中的技术缺陷，本发明提供一种使用冷冻干燥技术制备可溶性微针贴片的方法。
4.本发明的目的可以通过以下技术方案来实现：
5.本发明首先提供一种使用冷冻干燥技术制备可溶性微针贴片的方法，包括以下步骤：
6.s1、制作微针针体：
7.将针体基质溶液注入微针模具中，使针体基质溶液填充模具，将模具置于-196℃～0℃条件下冷冻，即得到无背衬层的冷冻的微针针体；
8.s2、制作微针的背衬层：
9.在低温条件下，将微针背衬层基质溶液注入含有冷冻的微针针体的模具中，使微针背衬层基质溶液完全浸润，冷冻，再进行冷冻干燥，剥离后即得到可溶性微针贴片，所述可溶性微针贴片含有由若干微针组成的微针阵列。
10.在本发明的一个实施方式中，微针模具中，微针针体高度为50μm～1500μm，微针针体的针尖间距为50μm-1000μm，微针针体的形状为四棱锥形、圆锥形、塔形或其他不规则形。
11.在本发明的一个实施方式中，步骤s2中，微针背衬层基质溶液厚度0.5mm～5mm。
12.在本发明的一个实施方式中，步骤s1中，针体基质溶液中用于形成微针针体的针体材料选自以下材料中的一种或几种：聚乙烯吡咯烷酮(pvp)、聚乙烯醇(pva)、透明质酸及其钠盐、蔗糖、卡波姆、聚乙烯酸、聚氧化乙烯、聚丙烯酸、聚丙烯酰胺、聚(甲基乙烯基醚/马来酸)半酯共聚物、聚乙二醇、支链淀粉、羟丙基纤维素、羟乙基纤维素、羟丙基甲基纤维素或羧甲基纤维素；用于配制形成针体基质溶液的溶剂为水，针体基质溶液配制时，针体材料可单独使用，也可以复配使用，总质量分数为5％～60％。
13.本发明中，用于形成微针针体的针体材料经冷冻干燥后依然可以形成相对紧密的结构，以保证微针针体的硬度，进而保证微针刺入皮肤的成功率和透皮给药的效率。
14.在本发明的一个实施方式中，步骤s2中，微针背衬层基质溶液中用于形成微针背衬层的背衬层材料选自以下材料中的一种或几种：聚乙烯吡咯烷酮(pvp)、聚乙烯醇(pva)、透明质酸(ha)、蔗糖、卡波姆、聚乙烯酸、聚氧化乙烯、聚丙烯酸、聚丙烯酰胺、聚(甲基乙烯基醚/马来酸)半酯共聚物、聚乙二醇、支链淀粉、羟丙基纤维素、羟乙基纤维素、羟丙基甲基纤维素或羧甲基纤维素；用于配制形成微针背衬层基质溶液的溶剂为水，微针背衬层基质溶液配制时，背衬层材料可单独使用，也可以复配使用，总质量分数为5％～60％。
15.本发明中，用于形成微针背衬层的背衬层材料经冷冻干燥后依然可以形成相对紧密的结构，以维持微针针体的稳固，从而保证良好的皮肤刺入效果。
16.本发明制备过程中，溶剂中的水会在冷冻或冷冻干燥的过程中挥发，进而冷冻干燥制得的微针含水量更低，有利于基质及药物的质量稳定。
17.在本发明的一个实施方式中，步骤s2中，冷冻干燥的工艺参数：温度为-100℃～-10℃，压强为0.05mbar～0.12mbar，冷冻干燥时间为15分钟以上。待冷冻干燥完成后，即可进行脱模，得到具有良好的形态外观以及适宜硬度的载药或不载药微针贴片。
18.在本发明的一个实施方式中，步骤s1中，针体基质溶液中除了含有针体材料外，还含有药物或活性成分，药物或活性成分在针体基质溶液中的质量分数为0.1％～30％。负载药物或活性成分的情况主要是针对微针治疗作用的需要，以加载相关药物。
19.在本发明的一个实施方式中，所述药物选自蛋白多肽类药物(如胰岛素、重组水蛭素、抗体类药物等)、疫苗(如新冠疫苗、狂犬疫苗、流感病毒疫苗等)、化学药物(如麻醉药、镇痛药、甾体类抗炎药、神经系统用药、激素类药物等)、基因治疗类药物(如mrna、核酸等)、细胞(如干细胞、t细胞等)中的任意一种或者多种。
20.在本发明的一个实施方式中，步骤s1中，针体基质溶液中除了含有针体材料、药物或活性成分以外，还含有冻干保护剂，冻干保护剂的质量分数为0.1％～10％。
21.在本发明的一个实施方式中，所述冻干保护剂选自甘露醇、海藻糖、蔗糖、乳糖、麦芽糖、棉子糖、甘氨酸或精氨酸等。
22.在本发明的一个实施方式中，步骤s1中，使针体基质溶液填充模具的方法包括：通过真空法或离心法，或者直接使用喷雾法填充，刮除表层多余的溶液。
23.在本发明的一个实施方式中，步骤s2中，将微针背衬层基质溶液注入含有冷冻的微针针体的模具中的方法为使用离心法或者真空法。
24.在本发明的一个实施方式中，步骤s2得到可溶性微针贴片后，在背衬层之外另外添加胶黏层或巴布贴等，以辅助微针贴片更好黏附于皮肤表面。
25.本发明还提供基于上述制备方法制备的可溶性微针贴片。
26.本发明制备的可溶性微针贴片，包括针体和背衬层，为一种双层微针。
27.本发明冷冻干燥法制备的微针贴片可用于化学药的经皮递送，蛋白质多肽类药物的经皮递送，以及疫苗或基因类药物的经皮递送等等。
28.传统制备微针的方法依靠常温干燥，为微针制备的限速过程，需要较长的干燥时间，一般需要十二小时以上，效率低下，且难以控制批间差异；长时间将热敏性药物暴露在室温条件下也会导致其失活；常温干燥所得微针含水量相对较高，易滋生微生物，不利于微针基质及药物的质量稳定；且传统方法制备双层微针需要依赖于有机溶剂，伴随着残留溶剂的安全性问题。
29.与现有技术相比，本发明的优势体现在以下方面：
30.本发明基于冷冻干燥的技术制备微针，最快只需30分钟即可完成干燥过程，可大大节约时间和空间成本，提高生产效率，并且可以控制批间差异；冷冻干燥全程在低温低压下进行，非常有利于蛋白多肽类药物、疫苗、基因治疗药物等热敏性成分的稳定性；基于冷冻法制备出的双层微针，不依赖有机溶剂即可使药物集中在针尖部分，避免了宝贵的药物的浪费，提高药物利用率，降低了成本，同时避免了残留溶剂的安全性问题；冷冻干燥制得的微针含水量更低，有利于基质及药物的质量稳定；冷冻干燥的方法自动化程度高，减少了人工成本；制备出的微针结构相对疏松，能够更加迅速地溶解扩散，同时让患者获得更加良好的使用体验；微针需要刺破皮肤给药，必须建立可靠的灭菌方法，目前微针灭菌多使用射线灭菌，而冻干法可以进行无菌化操作，大大简化了生产工序，有效提高生产效率，提高了灭菌的可靠性；因此本发明冷冻干燥法制备微针优势显著，是当代微针制造工艺的一种创新突破，为微针的工业化生产和普及推广提供了一种升级方案。
附图说明
31.图1：实施例1中装载亚甲蓝染色剂的双层冻干微针照片。
32.图2：实施例3中装载胰岛素的冻干微针贴片照片。
33.图3：常温微针与实施例3所得冻干微针的体外释放实验结果。
34.图4；大鼠施用胰岛素微针后的血糖数据。
35.图5：常温微针与实施例3所得冻干微针中胰岛素稳定性实验。
具体实施方式
36.下面结合附图和具体实施例对本发明进行详细说明。
37.实施例1～6
38.实施例1～6的操作流程为：
39.第一步，制备微针的针体部分，将含有或不含有药物的微针基质溶液注入微针模具中，填充后刮除多余的基质，冷冻；
40.第二步，制备微针的背衬部分，在低温条件下将背衬基质溶液注入含有冷冻针体的模具中，冷冻，然后进行冷冻干燥，剥离后即可得到所需的微针贴片。
41.各实施例1～6中所用的基质、药物、保护剂及其含量，操作方法以及工艺参数见表1。
42.表1实施例1～6中所用基质、药物、保护剂及其含量，操作工艺参数
[0043][0044][0045]
实施例1中使用冷冻干燥法，制备以pvp为针体、以pva为背衬的可溶性微针；针体加载亚甲蓝染料以考察双层微针的分层效果。
[0046]
将实施例1所得双层微针贴片置于光镜下观察，结果如图1所示，亚加蓝染料主要分布在微针针尖部分，微针分层效果良好。
[0047]
将实施例1制备的微针置于物性仪下检测微针硬度：将微针针尖向上平放于物性仪上，针尖距离探头约0.5cm，探头测试速度为0.1～0.2mm/s，测试距离为0.2～0.6mm；以压力曲线的突降点作为微针的断裂点，对应的压力作为微针的硬度，根据文献报道，微针的硬度大于0.1n/needle即可达到刺入皮肤的要求。
[0048]
实施例1中，pvp可以替换成或再包括聚乙烯醇(pva)、透明质酸(ha)、蔗糖、卡波姆、聚乙烯酸、聚氧化乙烯、聚丙烯酸、聚丙烯酰胺、聚(甲基乙烯基醚/马来酸)半酯共聚物、聚乙二醇、支链淀粉、羟丙基纤维素、羟乙基纤维素、羟丙基甲基纤维素或羧甲基纤维素中的一种或多种。
[0049]
实施例1中，pva可以替换成或再包括聚乙烯吡咯烷酮(pvp)、透明质酸(ha)、蔗糖、卡波姆、聚乙烯酸、聚氧化乙烯、聚丙烯酸、聚丙烯酰胺、聚(甲基乙烯基醚/马来酸)半酯共聚物、聚乙二醇、支链淀粉、羟丙基纤维素、羟乙基纤维素、羟丙基甲基纤维素或羧甲基纤维素中的一种或多种。
[0050]
实施例3是使用冷冻干燥法，制备以ha为针体加载胰岛素、以pva为背衬的可溶性微针。
[0051]
实施例3中，透明质酸可以替换成或再包括聚乙烯吡咯烷酮、聚乙烯醇、卡波姆、蔗糖、支链淀粉、羧甲基纤维素、羟丙基纤维素中的一种或多种。
[0052]
实施例3中，胰岛素可以替换成低分子肝素、重组水蛭素、疫苗、美容活性成分、麻醉药、镇痛药、甾体类抗炎药、神经系统用药中的任意一种或者多种。
[0053]
实施例3中，海藻糖可以替换成棉子糖、甘露醇、蔗糖、乳糖、麦芽糖、甘氨酸或精氨酸等。
[0054]
为增加对实施例3的说明，制作一种常温干燥微针作为对比，常温干燥微针制作的具体方法为：首先将含有30％ha、5％胰岛素以及5％海藻糖的混悬液注入微针模具中，抽真空使溶液完全填充模具，刮去表层多余溶液，在小于40％湿度条件下常温干燥8小时后，即可得到无背衬层的微针阵列；将20％的pva溶液注入上述含有微针阵列的模具中，使用真空法进行填充，在小于40％湿度条件下常温干燥12小时以上，剥离即可得到常温干燥制备的双层微针。
[0055]
实施例3所得冷冻干燥双层微针贴片置于微距镜头下观察，如图2所示。
[0056]
将实施例3所得载有胰岛素的冷冻干燥微针贴片和作为对比的常温微针贴片浸入37℃的2ml pbs中，每隔一段时间，取出100μl溶液，并补充100μl空白pbs缓冲液。使用酶标仪在595nm处检测吸收波长(bradford测定法)。
[0057]
考察实施例3所得载有胰岛素的冷冻干燥微针贴片和作为对比的常温微针贴片的使用效果。
[0058]
大鼠体内降血糖效果考察：取160g左右的大鼠12只，使用文献报道方法进行糖尿病的造模：将链脲佐菌素(stz)溶解在10mm柠檬酸盐缓冲液中(ph＝4.5)，以70mg/kg的剂量腹腔注射，每天一次，持续三天。注射三天后监测大鼠的血糖水平(bgl)，当大鼠的bgl达到稳定的高血糖时视为造模成功。去除大鼠腹部毛发，将剃毛的糖尿病大鼠分为4组：冻干微针贴片组、常温微针贴片组、皮下注射胰岛素组和空白组。实验期间，糖尿病大鼠禁食，但可以自由饮水，空腹2小时后注射胰岛素。在微针贴片组中，用手指将微针贴片插入皮肤后，持续按压3分钟，然后胶布固定。空白组不予处理。每1小时分别从尾静脉采集血样，并通过血
糖仪测定血糖浓度。
[0059]
将实施例3所得载有胰岛素的冷冻干燥微针贴片与常温微针同时置于室温条件下，三个月后以上述bradford测定法测定贴片中胰岛素含量，以考察微针贴片中胰岛素的稳定性。
[0060]
上述微针贴片，胰岛素的释放如图3所示，大鼠体内血糖如图4所示，稳定性实验中胰岛素含量如图5所示。
[0061]
如图3所示，实施例3所得冷冻干燥微针在体外能够迅速溶解扩散，在30分钟内即可以释放出大部分药物；而常温干燥微针需要60分钟才能达到相当的释药量。因此，冷冻干燥微针具有更快的溶解和溶出的速度，对于需要迅速透皮起效的药物，冷冻干燥微针相比于普通微针具有明显的优势。
[0062]
如图4所示，直接注射胰岛素组的大鼠bgls在一小时内降至正常范围，并逐渐发展为低血糖，大鼠存在严重低血糖风险；常温干燥微针贴片组，大鼠的bgls可以在2小时内降至正常范围，并维持了长达6小时；实施例3所得冷冻干燥微针贴片组，大鼠的bgls可以在1小时内降至正常，并在之后的6小时内都维持在正常水平。冷冻干燥胰岛素贴片能够成功递送胰岛素，达到良好的降血糖效果，且不会造成低血糖风险；相比于常温干燥微针，冻干微针具有更快速的释药性能，避免持续高血糖对患者带来的危害。
[0063]
如图5所示，常温存放三个月后，微针贴片中胰岛素含量皆有一定量的损失，存在统计学差异。但实施例3所得冷冻干燥微针中胰岛素含量显著高于常温干燥微针，表明冷冻干燥微针能够更好的维持蛋白多肽类药物、疫苗、基因治疗药物等热敏性成分的稳定性。
[0064]
由上述试验可知，以浓度为5％～60％的微针基质加载0.1％～30％的药物(或者活性成分)，同时包含0.1％～10％保护剂作为针体，以5％～60％的上述基质作为背衬，基于冷冻法制备双层微针，使用冷冻干燥技术完成干燥过程；最终制备出的冻干微针能够达到微针刺入皮肤的需求，可以满足正常使用。
[0065]
与常温干燥相比，本发明提供的一种基于冷冻干燥技术的快速制备微针的方法，最快只需30分钟即可完成干燥过程，可大大节约时间和空间成本，提高生产效率，并且可以控制微针产品的批间差异；冷冻干燥全程在低温低压下进行，非常有利于蛋白多肽类药物、疫苗、基因治疗药物等热敏性成分的稳定性；基于冷冻法制备出的双层微针，不依赖有机溶剂即可使药物集中在针尖部分，避免了宝贵的药物的浪费，提高药物利用率，降低了成本；冷冻干燥制得的微针含水量更低，有利于基质及药物的质量稳定；冷冻干燥的方法自动化程度高，便于无菌操作，制备出的微针结构相对疏松，能够更加迅速地溶解扩散，达到更加快速的递药速度，同时让患者获得更加良好的使用体验。本发明基于冷冻干燥技术的快速制备微针的方法，与常温干燥法制备微针相比，特点如下表：
[0066][0067][0068]
上述的对实施例的描述是为便于该技术领域的普通技术人员能理解和使用发明。熟悉本领域技术的人员显然可以容易地对这些实施例做出各种修改，并把在此说明的一般原理应用到其他实施例中而不必经过创造性的劳动。因此，本发明不限于上述实施例，本领域技术人员根据本发明的揭示，不脱离本发明范畴所做出的改进和修改都应该在本发明的保护范围之内。