transplantation in a rat model of parkinson's disease.cell transplant 22,1281-1293,2013)。在动物纹状体中需要更多数量的存活da神经元才能达到与fvm移植物近似的恢复水平(a.kirkeby等,generation ofregionally specified neural progenitors and functional neurons from humanembryonic stem cells under defined conditions.cell rep 1,703-714,2012)。而症状改善不明显的现象提示二维培养获得的da前体细胞与正常胚胎中脑的前体细胞在本质上是不同的。
5.最近十年，诱导多能干细胞(ipsc)或胚胎干细胞(esc)的发育培养方式从二维平面培养进步成三维立体培养，成功的实现了体外三维器官诱导培养，该三维器官被称做“类器官”，目前全世界科研领域已完成诱导发育结肠、肝脏、视网膜和大脑等类器官。这些类器官可以在某种程度上以三维方式模拟正常器官发育，可用于机制研究和药物筛选。不同组织类器官体外培养的成功率差异显著，肠道、胰腺及胆管等类器官培养成功率较高，但直至2013年，人脑类器官才得以建立，2016年，junghyunjo及其同事报告了从人ipsc中成功生成中脑类器官(j.jo等,midbrain-likeorganoids from human pluripotent stem cells contain functional dopaminergicand neuromelanin-producing neurons.cell stem cell 19,248-257,2016)。
6.目前，多能干细胞(hpsc)被广泛用于研究帕金森病的治疗作用和发病机制。对于hpsc的治疗作用的研究，多集中于使用二维培养的人多能干细胞(hpsc)通过诱导分化后移植入纹状体等特定区域；而对于使用hpsc进行发病机制的研究，已有研究团队选择使用中脑类器官模型作为帕金森病的发病分子机制研究和药物筛选的平台(陶梦丹等，人多能干细胞在帕金森综合症治疗与研究中的作用，中山大学学报(医学科学版)，第43卷第2期，第173-180页，2022)。然而，ipsc诱导的中脑类器官是否可作为供体移植物来移植治疗pd尚未有研究报导。
7.至今，多项临床研究涉及使用胎儿腹侧中脑组织移植治疗pd。但是，使用胎儿腹侧中脑(fvm)组织移植存在未被解决的问题。包括在一项独立双盲试验中，fvm组织移植未能达到主要终点，甚至被发现与pd异动症的出现有关，而这种副作用被认为是与移植物内复杂的细胞成分和/或同种异体移植物诱发的免疫识别密切相关(d.e. redmond等,influence of cell preparation and target location on the behavioralrecovery after striatal transplantation of fetal dopaminergic neurons in a primatemodel of parkinson's disease.neurobiol dis 29,103-116,2008)。现有研究已证明，用于患者移植试验的fvm组织不可避免地含有几种非多巴胺能神经元群，包括gaba 能神经元、谷氨酸能神经元、胆碱能神经元和血清素能神经元(s.c.neto等,cell fateanalysis of embryonic ventral mesencephalic grafts in the 6-ohda model ofparkinson's disease.plos one 7,e50178,2012)，其中移植物中包含过多的血清素能神经元的存在将引发导致不良副作用，包括移植物诱发的运动障碍(t.carlsson等, serotonin neuron transplants exacerbate l-dopa-induced dyskinesias in a ratmodel of parkinson's disease.j neurosci 27,8011-8022,2007)。也就是说，血清素能神经元为中脑移植物中的一种污染细胞，可导致包括fvm组织移植物诱发的运动障碍在内的不良副作用。因此，如何制备基本上或实质上不含有血清素能神经元的中脑类器官成为了中脑类器官应用时需面对的技术障碍。
8.另外，尽管已提供了制备中脑类器官的方法，然而现有的方法作为持续的培养过程，仍然无法确定哪个培养阶段得到的中脑类器官适合实现本发明的目的。
9.通过对现有研究的总结可以发现，现有的研究结果已反映了包含来自正常胚胎中脑的前体细胞的fvm移植物相对于二维培养的da前体细胞在pd治疗上具有优势，但fvm移植物受限于胚胎组织来源不充分和伦理因素的限制；另一方面，现有技术中仅将hpsc诱导的中脑类器官用作pd机制研究平台，但并未进行过中脑类器官是否可作为治疗pd的候选移植物的研究。因此，是否可以使用ipsc诱导的中脑类器官以及选择哪个阶段的中脑类器官(如果可以)作为治疗pd的供体移植物，成为pd治疗领域亟待解决的问题。另外，鉴于fvm中存在以血清素能神经元为代表的污染细胞，如何提供基本上或实质上不含有血清素能神经元的中脑类器官也是该领域需要同时解决的问题。
技术实现要素：
10.为解决上述现有技术中存在的问题，提供了本发明的技术方案。
11.本发明的第一个方面，提供了中脑类器官用于治疗帕金森病的用途，或者中脑类器官在制备用于治疗帕金森病的药物中的用途。
12.在一个实施方案中，所述中脑类器官由多能干细胞制备得到，所述多能干细胞为诱导多能干细胞(ipsc)、胚胎干细胞(esc)、神经干细胞(nsc)。其中，所述神经干细胞可以为诱导神经干细胞(insc)。更优选地，所述多能干细胞为人诱导多能干细胞(hipsc)。
13.在一个实施方案中，所述中脑类器官中不含有血清素能神经元。
14.在一个实施方案中，所述中脑类器官具有以下特征：(1)对nestin、sox2、 tuj1、ki67、otx2、foxa2、en1、nurr1和th的染色呈阳性，其中表达foxa2 的细胞比例为20-40％，表达en1的细胞比例为10-30％，表达otx2的细胞比例为 5％-15％，表达nurr1的细胞比例为0.01-5％，表达th的细胞比例为0.01-5％；(2) 所述中脑类器官对darpp32、gad67、vglut1、chat和serotonin的染色呈阴性；(3)所述中脑类器官不表达foxg1、nkx2.2、nkx6.1、hoxa2、hoxb、gbx2 和gata3；以及(4)所述中脑类器官表现出顶端-基底极性。优选地，所述中脑类器官中表达foxa2的细胞比例为约30％，表达en1的细胞比例为约18％，表达otx2 的细胞比例为约10％，表达nurr1的细胞比例为约2％，并且表达th的细胞比例为约0.8％。更优选地，所述中脑类器官中表达foxa2的细胞比例为30％，表达en1 的细胞比例为18％，表达otx2的细胞比例为10％，表达nurr1的细胞比例为2％，并且表达th的细胞比例为0.8％。
15.本领域技术人员将理解，所述中脑类器官对nestin、sox2、tuj1、ki67、otx2、 foxa2、en1、nurr1和th的染色呈阳性，意味着所述中脑类器官表达nestin、 sox2、tuj1、ki67、otx2、foxa2、en1、nurr1和th。相应地，本领域技术人员将理解，所述中脑类器官对darpp32、gad67、vglut1、chat和serotonin 的染色呈阴性，意味着所述中脑类器官不表达darpp32、gad67、vglut1、chat 和serotonin或对darpp32、gad67、vglut1、chat和serotonin的表达量处于检测限之下。
16.在一个实施方案中，所述中脑类器官在治疗帕金森病前被切成0.1-2mm3的小块并重悬浮于含有0.1-1μm rock抑制剂、无维生素a型b27、和10-30ng/ml bdnf 的移植缓冲液中。优选地，所述移植缓冲液含有0.5μm的rock抑制剂、无维生素a 型b27、和20ng/ml的
bdnf。
17.在一个实施方案中，所述中脑类器官为在体外培养10-25天的中脑类器官。优选地，所述中脑类器官为在体外培养13-17天的中脑类器官。优选地，所述中脑类器官为在体外培养约15天的中脑类器官。更优选地，所述中脑类器官为在体外培养15天的中脑类器官。
18.在一个实施方案中，所述中脑类器官的制备方法包括：(1)神经诱导阶段：将诱导多能干细胞(优选为hipsc)解离为单个细胞，并形成均一拟胚体，使所述拟胚体在含有肝素、sb431542、noggin、chir99021、y27632的培养基a中培养，45-50 小时后(优选约48小时后，更优选48小时后)将培养基a更换为含有肝素、sb431542、 noggin、chir99021但不含y27632的培养基b继续进行培养，获得培养物a；(2) 中脑模式化阶段：在所述培养基b中加入shh-c25ii和fgf8形成培养基c，继续培养所述培养物a以进行中脑模式化，得到培养物b，其中shh-c25ii的浓度为150-250 ng/ml(优选为200ng/ml)；(3)片层化阶段：待培养物b伸出神经外胚层芽之后，完全去除培养基c，加入低生长因子基质胶进行包埋，并在低生长因子基质胶凝固后在含有胰岛素、层粘连蛋白、shh-c25ii、fgf8的培养基d中生长，得到培养物c，其中shh-c25ii的浓度为150-250ng/ml(优选为200ng/ml)；(4)最终分化阶段：将培养物c转移至含有bdnf、gdnf、抗坏血酸、camp的培养基e中进行培养，获得中脑类器官；其中，所述制备方法的各阶段共进行10-25天。优选地，所述制备方法的各阶段共进行13-17天。优选地，所述制备方法的各阶段共进行约15天。更优选地，所述制备方法的各阶段共进行15天。
19.在一个实施方案中，在神经诱导阶段，在培养基a中培养48小时，在第2天更换为培养基b并培养2天；在中脑模式化阶段，在培养基c中培养3天；在片层化阶段，在培养基d中培养1天；在最终分化阶段，在培养基e中培养2-17天(即在体外培养10-25天的中脑类器官)。优选地，在最终分化阶段，在培养基e中培养7天 (即在体外培养15天的中脑类器官)。
20.在一个实施方案中，所述中脑类器官的制备方法中所述培养基a、培养基b、培养基c、培养基d中均含有能够使诱导多能干细胞生长的神经元诱导基础培养基，所述神经元诱导基础培养基为dmem/f12:neurobasal 0.8-1.2:1、0.5-2:100的n2添加剂、0.5-2:50的无维生素a型b27、0.5-2％的最低基本培养基(mem)-非必需氨基酸和0.01-1％的β-巯基乙醇；培养基e含有在神经元诱导基础培养基的基础上去除 dmem/f12的培养基。
21.在一个实施方案中，所述中脑类器官的制备方法中所用的神经元诱导基础培养基为dmem/f12:neurobasal 1:1、1:100的n2添加剂、1:50的无维生素a型b27、1％的最低基本培养基(mem)-非必需氨基酸和0.1％的β-巯基乙醇。
22.本发明的第二个方面提供了一种中脑类器官，其特征在于：(1)对nestin、sox2、 tuj1、ki67、otx2、foxa2、en1、nurr1和th的染色呈阳性，其中表达foxa2 的细胞比例为20-40％，表达en1的细胞比例为10-30％，表达otx2的细胞比例为 5％-15％，表达nurr1的细胞比例为0.01-5％，表达th的细胞比例为0.01-5％；(2) 所述中脑类器官对darpp32、gad67、vglut1、chat和serotonin的染色呈阴性；(3)所述中脑类器官不表达foxg1、nkx2.2、nkx6.1、hoxa2、hoxb、gbx2 和gata3；以及(4)所述中脑类器官表现出顶端-基底极性。优选地，所述中脑类器官中表达foxa2的细胞比例为约30％，表达en1的细胞比例为约18％，表达otx2 的细胞比例为约10％，表达nurr1的细胞比例为约2％，并且表达th的细胞比例为约0.8％；其中，所述中脑类器官来源于人诱导多能干细胞。更优选地，所述中脑类器官中表达
foxa2的细胞比例为30％，表达en1的细胞比例为18％，表达otx2的细胞比例为10％，表达nurr1的细胞比例为2％，并且表达th的细胞比例为0.8％。
23.本发明的第三个方面提供了一种中脑类器官的制备方法，包括：(1)神经诱导阶段：将诱导多能干细胞(优选为hipsc)解离为单个细胞，并形成均一拟胚体，使所述拟胚体在含有肝素、sb431542、noggin、chir99021、y27632的培养基a中培养，45-50小时后(优选约48小时后，更优选48小时后)将培养基a更换为含有肝素、sb431542、noggin、chir99021但不含y27632的培养基b继续进行培养，获得培养物a；(2)中脑模式化阶段：在所述培养基b中加入shh-c25ii和fgf8形成培养基c，继续培养所述培养物a以进行中脑模式化，得到培养物b，其中shh-c25ii 的浓度为150-250ng/ml(优选为200ng/ml)；(3)片层化阶段：待培养物b伸出神经外胚层芽之后，完全去除培养基c，加入低生长因子基质胶进行包埋，并在低生长因子基质胶凝固后在含有胰岛素、层粘连蛋白、shh-c25ii、fgf8的培养基d中生长，得到培养物c，其中shh-c25ii的浓度为150-250ng/ml(优选为200ng/ml)；(4)最终分化阶段：将培养物c转移至含有bdnf、gdnf、抗坏血酸、camp的培养基e中进行培养，获得中脑类器官；其中，所述制备方法的各阶段共进行10-25天。优选地，所述制备方法的各阶段共进行13-17天。优选地，所述制备方法的各阶段共进行约15天。更优选地，所述制备方法的各阶段共进行15天。
24.在一个实施方案中，根据本发明的中脑类器官的制备方法，在神经诱导阶段，在培养基a中培养48小时，在第2天更换为培养基b并培养2天；在中脑模式化阶段，在培养基c中培养3天；在片层化阶段，在培养基d中培养1天；在最终分化阶段，在培养基e中培养2-17天(即在体外培养10-25天的中脑类器官)。优选地，在最终分化阶段，在培养基e中培养7天(即在体外培养15天的中脑类器官)。
25.在一个实施方案中，根据本发明的中脑类器官的制备方法，所述中脑类器官的制备方法中所述培养基a、培养基b、培养基c、培养基d中均含有能够使诱导多能干细胞生长的神经元诱导基础培养基，所述神经元诱导基础培养基为 dmem/f12:neurobasal 0.8-1.2:1、0.5-2:100的n2添加剂、0.5-2:50的无维生素a 型b27、0.5-2％的最低基本培养基(mem)-非必需氨基酸和0.01-1％的β-巯基乙醇；培养基e含有在神经元诱导基础培养基的基础上去除dmem/f12的培养基。优选地，根据本发明的中脑类器官的制备方法，所述神经元诱导基础培养基为 dmem/f12:neurobasal 1:1、1:100的n2添加剂、1:50的无维生素a型b27、1％的最低基本培养基(mem)-非必需氨基酸和0.1％的β-巯基乙醇。
26.相对于现有研究，本发明具有良好的效果和明显的优势和进步。
27.首先，现有研究中通过干细胞治疗帕金森病时使用的是二维培养ipsc得到的分化细胞，而与传统的二维培养相比，本发明的来自ipsc的中脑类器官是在复杂的空间和时间规则下形成的，在一定程度上重现了患者自身的胚胎发生，这使类器官在细胞移植治疗中与宿主更具相容性，这一动态过程可以提供适合阶段的壁龛信号，以诱导具有更完整和成熟功能活性的同种异体群体和组织特异性细胞类型。
28.第二，现有研究中已将hpsc诱导为中脑类器官模型以提供研究帕金森病发病机制或药物筛选的平台，但是缺乏对于使用中脑类器官作为治疗物以移植方式治疗帕金森病的研究；本发明的研究结果表明，可使用人诱导多能干细胞衍生的中脑类器官作为治疗产品用于移植治疗帕金森病，并且提供了中脑类器官作为治疗移植物的最适合的生长培养阶
段。
29.第三，现有研究中已有将使用胎儿腹侧中脑(fvm)组织移植治疗帕金森病的成功尝试，但fvm治疗pd的方法具有伦理障碍、来源稀少和移植异质性方面的问题；但是，本发明的中脑类器官显示出在伦理、来源和移植方面的优势，源自ipsc的hmo 可以很好地解决与胚胎衍生的fvm组织相关的伦理和来源问题，并且就异质性问题而言，hmo具有可应用于自身移植或同质移植的优势。
30.第四，现有研究中在使用fvm治疗帕金森病时，通过分离所需的腹侧中脑区域存在技术困难，因此在fvm的移植物中经常检测到其他污染细胞，特别是其中含有的血清素能神经元，会诱发产生严重的副作用，包括移植物诱发的运动障碍等；本发明提供的特定生长培养阶段的中脑类器官中不含有血清素能神经元等污染细胞，从而避免了污染细胞导致的运动障碍等严重副反应。
附图说明
31.附图用来提供对本技术技术方案的进一步理解，并且构成说明书的一部分，与本技术的实施例一起用于解释本技术的技术方案，但并不构成对本技术技术方案的限制。
32.图1是显示hipsc向中脑类器官的分化的图：(a)从ipsc到中脑类器官(hmo) 的分化过程示意图；(b)用于表征hipsc衍生的hmo的免疫荧光染色，比例尺：a、 b、c为250μm，d为75μm，e为50μm，f为100μm；(c)hmo中的神经黑色素生成的评估，a为具有神经黑色素颗粒的类器官的代表性微分干涉相差(dic)图像(虚线框内)，b为fontana-masson染色，比例尺：100μm；(d)对整体类器官进行高效液相(hplc)分析。da和代谢物dopac的量在60div高钾刺激后评估(n＝10)。 fgf8：成纤维细胞生长因子8；shh：刺猬因子；bdnf：脑源性神经营养因子；gdnf：胶质细胞衍生的神经营养因子；camp：二丁酰腺苷3',5'-环一磷酸钠盐；sox2：sry-box 转录因子2；th：酪氨酸羟化酶；tuj1：微管蛋白β3iii类；otx2：orthodenticlehomeobox 2；foxa2：叉头框蛋白a2；en1：engrail-1；nurr1：核受体亚家族4； girk2：g-蛋白偶联内向整流钾；div：体外天数；ap.：顶部；bas.：底部；min：分钟。
33.图2是显示hmo功能成熟度评估的图：(a)通过使用med64多电极阵列系统，评估整体类器官的电生理活动，a为电生理信号处理系统的示意图，b为具有64电极阵列的盘上的类器官的显微照片，c为在不同通道中同时发生的突发代表网络爆发(方框区域)，d为具有代表性的尖峰簇之一(即c中的箭头)；(b)将ipsc-egfp衍生的hmo移植入scid小鼠的大脑以检查电生理特性，a-d为在第4天和第7天显示egfp+类器官的显微图像(a、c为dic图像；b、d为荧光显微图像，比例尺：2mm)， e为移植后6周含有egfp+类器官的脑切片；(c)全细胞电流钳记录，a为移植的 gfp标记细胞的定期自发ap活动，b为阶跃电流注入诱发的ap，c为膜片在移植神经元上的代表性电压依赖性na
+
和k
+
电流，蓝框内向内的na
+
各自的痕迹被扩大，d 为膜片神经元的相差图像和记录的神经元的egfp、生物细胞素和th的相应三重染色，比例尺为25μm。div：体外天数；wks：周。
34.图3是显示寻找移植hmo的最佳分化阶段的图：(a)实验设计的示意图；(b) 不同分化时间点的代表性rt-pcr结果，该结果在第0天以未分化hipsc的倍数变化形式给出；(c)在10、15和25div时，多巴胺能祖细胞标志物foxa2和成熟多巴胺能神经元标志物th在hmo上的代表性免疫荧光染色结果，比例尺：a、c为250 μm，e为100μm，b,d为50μm，f为25μm；(d)hmo在
移植到scid小鼠脑中后的存活和分化(n＝9)，a为第10天、b-d为第15天、e为第25天类器官的移植，在25div的类器官大多在移植后死亡，比例尺：a为250μm，b,c,d为50μm，e为 100μm。d0：第0天；div：体外天数。
35.图4是显示将ipsc衍生的中脑类器官移植到pd小鼠模型中的图：(a)行为测试的实验设计和时间表的示意图，在4个月的过程中，处死a组和c组中的小部分动物进行组织学分析；(b)免疫荧光染色证实了移植器官在体内的分化和成熟，比例尺：50μm；(c)a-d为移植后三个时间点的代表性共聚焦显微镜图像和移植细胞中 th+细胞的比例(6周为2.57％，12周为14.11％，16周为7.33％)；*p《0.0453， **p《0.0078，****p《0.0001，由双因素方差分析和tukey多重比较检验计算，比例尺： 25μm，e-g为行为测试的结果，包括阿扑吗啡诱导旋转、旷场和转棒测试。tx：移植物；wks：周。
36.图5是显示移植神经元的轴突投射的图：(a)显示移植细胞在6周时分布的代表性免疫荧光图像；(b)hncam的免疫荧光染色，表明移植物衍生的纤维支配宿主大脑区域，包括大脑皮层(a)、纹状体(b)、mfb(c、d)和mb(e)，方框区域在i-iv中被放大，比例尺：250μm；(c)hncam的免疫荧光染色，表明移植物衍生的纤维在12周时神经支配宿主大脑区域(i对应于a，ii对应于b，iii对应于c，iv 对应于d，v对应于e)，比例尺：250μm。wks：周；pfc：前额叶皮层；fa/cc：胼胝体；mo：躯体运动皮层；ss：躯体感觉皮层；nac：伏隔核；strd/strv：背外侧/腹侧纹状体；gp：苍白球；vpl：丘脑腹侧后外侧核；mfb：内侧前脑束；hy：下丘脑；th：丘脑；mb：中脑；mrn：中脑网状核；fr：后屈束；spf：束旁核；cla：屏状核；ep：梨状核；si：无名质；ot：嗅球；snr/snc：实质黑质的网状/致密部分；vta：腹侧被盖区。
37.图6是显示移植物衍生的多巴胺能神经元支配宿主神经元回路的图：(a) th+/hncam+纤维支配pal(a)和同侧snr/snc(d)，a和d中的方框区域分别在 b、c和e、f中放大，比例尺：250μm；(b)移植的da神经元接收来自宿主和/或移植神经元的突触(h+m syn)输入(a中的方框区域在b中放大)，移植的多巴胺能神经元将轴突延伸到相邻的msn(c中的方框区域在d中放大)。比例尺：a，b， c为50μm；d为7.5μm。mb：中脑；pal：苍白球；strd：背外侧纹状体；snr：实质黑质网状部分；vta：腹侧被盖区。
38.图7是显示移植的神经元与宿主神经元连接的图：(a)位于str中的移植神经元投射到pfc和hy(a和c中方框区域分别在b和d中放大)；(b)a为显示狂犬病毒追踪系统的示意图；b为显示被g-狂犬病毒感染的gfp+起始神经元随后开始表达mcherry，追踪的上一级神经元被g狂犬病毒逆行传播感染，并也出现mcherry 标记；(c)单突触追踪确定了早期的宿主到移植物的连接，a为起始神经元主要位于移植部位并逆行感染相邻的移植和/或宿主细胞(箭头突出显示带有gfp+/mcherry+ 的起始神经元)，b-f为位于多个大脑区域(包括pfc、fi、strd、lha、mb)的分散追踪神经元。比例尺：a、c、d、e、f为250μm；b为75μm。puro：嘌呤霉素；fi：海马伞；lha：下丘脑外侧区。
39.图8是显示中脑类器官内的细胞组成的图：(a)不同时间点的类器官形态；图像a到c由dic拍摄，图像d由立体显微镜拍摄，图像e由相机拍摄，比例尺：2mm； (b)在第15天和第35天对单个多巴胺能神经元相关标志物呈阳性的细胞比例(n＝10 类器官)；(c)非da细胞的检查，在第35天的类器官中检测到少量o4+细胞(a)，在第15天的类器官中检测到少量olig2+细胞(b)，在第15天的类器官中通过免疫荧光染色未检测到与前脑(foxg1)、后脑(nkx6.1、nkx2.2、gata3)和其他神经元亚型(包括chat、5-ht、darpp32、vglut1)相关的标志
物呈阳性的细胞，比例尺：250μm；(d)实时pcr结果证实不存在血清素祖细胞。
40.图9是显示组织学分析揭示了单侧内源性多巴胺能神经元的退化的图：(a)ihc 分析显示6-ohda损伤小鼠的sn和纹状体中单侧内源性th阳性中脑多巴胺能神经元的退化；(b)受损半球中移植物衍生的多巴胺能神经元，比例尺：100μm。6-ohda：6-羟基多巴胺；wks：周；nac：伏隔核；strd/strv：背外侧/腹侧纹状体；hy：下丘脑；th：丘脑；pal：苍白球。
41.图10是显示使用狂犬病毒进行追踪的图：(a)hipsc，以及表达狂犬病糖蛋白 (rvg)和egfp的第4天和第7天的类器官，a、c和e为dic图像，b、d和f为使用荧光显微镜观察的活细胞图像；(b)移植后4周，在植入部位发现具有gfp表达的成熟多巴胺能神经元，比例尺：50μm；(c)th、darpp32和hsyn的三重染色证实了da和msn神经元之间的突触连接(箭头)。msn：内侧棘神经元。
具体实施方式
42.下面将参照附图来详细描述本发明的各种示例性实施例。对示例性实施例的描述仅仅是说明性的，并不作为对本发明及其应用或使用的任何限制。本发明可以以许多不同的形式实现，不限于这里所述的实施例。提供这些实施例是为了使本发明透彻且完整，并且向本领域技术人员充分表达本发明的范围。除非另外具体说明，否则在这些实施例中描述的技术手段应被解释为仅是示例性的，而非限制性的。
43.在本发明中，术语“类器官”意指由干细胞经体外三维(3d)培养产生的类似于器官、具有自我更新和组装能力、并且结构和功能与器官高度相似的微型器官。
44.在本发明中，术语“中脑类器官”(midbrain organoids或midbrain-like organoids， mo)意指由干细胞经体外三维培养产生的类似于中脑、具有自我更新和组装能力、并且结构和功能与中脑高度相似的微型器官。其中，人干细胞衍生的中脑类器官为人中脑类器官(hmo或hmos)。
45.在本发明中，术语“拟胚体”(embryoid body，eb)意指胚胎干细胞(es)或诱导多能干细胞(ips)在体外一定的培养条件下形成的具有内、中、外三胚层结构、且形态学上与哺乳动物早期的胚胎发育阶段高度相似的一种球状结构。
46.在本发明中，术语“血清素能神经元”(serotonergic neuron或serotoninergicneuron)，也称为“5-羟色胺能神经元”，意指以5-羟色胺为递质的神经元。
47.在本发明中，单数形式“一个/种(a/an)”以及“所述(the)”包括复数形式，除非上下文另外明确地指示。如技术人员从本文包含的教导中显而易见的是，当在数值和范围的语境中使用时，术语“约”或“大约”是指近似或接近所指定的值或范围的值或范围，使得实施例可以按照预期执行。在一些实施例中，“约”意指数值量
±
10％。
48.在本发明的研究中，使用了以下的研究材料和方法。
49.组织处理和免疫荧光染色：在室温(21℃)下用50ml的0.9％盐水和100ml 冰冷的在磷酸盐缓冲盐水(pbs)中的4％多聚甲醛(pfa)经心脏灌注小鼠。取出大脑并在4％pfa中再保存2小时，然后在20％蔗糖(0.1m pb中)中重新悬浮过夜，并在30％蔗糖中脱水。在-20℃收集了12个系列的40μm厚的冠状位鼠脑切片 (coronal slices)。对于if/ihc，组织在室温下用3％驴血清封闭2小时。表1列出了所用一抗的信息和工作稀释度。使用基于过氧化物酶的反应，然后进行二氨基联苯胺(dab)沉淀(山羊抗兔，zsgb-bio，北京，中国)或适当的
biosystems，美国)进行qrt-pcr分析。对于每种细胞培养条件，对关注基因的表达以一式三份进行测定测量。使用gapdh作为内参基因。
54.高效液相色谱(hplc)分析：将类器官培养基更换为hbss(gibco)(每孔3ml)，在37℃培养30分钟，随后更换为包含da摄取阻滞剂nomifensine(10μm，sigma) 和单胺氧化酶抑制剂pargyline(50μm，sigma)的3ml高钾-hbss培养基(60mmkcl和82mm nacl)，在37℃下孵育45分钟。然后从每孔转移180μl的高钾培养基至放置于冰上的含有20μl 1n高氯酸(merck)和抗氧化剂(0.33g/l na2s2o5， 0.083g/l edta)的深色eppendorf管中并在-80℃下储存直至分析。通过进行hplc 分析测量100μl上清液的神经递质含量。
55.med64多电极阵列和全细胞膜片钳记录：采用多电极阵列装置记录第60天中脑类器官的电生理活动。med64 probe中心每个平面微电极的面积为50μm
×
50μm，间距为150μm(p515a模型)。使用全细胞膜片钳记录分析移植的egfp+类器官的电生理活性。使用acsf槽液(125mm nacl、2.5mm kcl、2mm cacl2、1.25mmnah2po4、1mm mgso4、25mm葡萄糖和26mm nahco3)对急性脑切片进行全细胞膜片钳记录。内液由143mm kcl、8mm nacl、10mm hepes、1mm mgcl2、 2％biocytin、2mm na-atp和0.4mm na-gtp组成。通过使用荧光显微镜观察 egfp+细胞。
56.显微镜和量化：使用leica显微镜拍摄所有明场图像，使用leica dmi6000共聚焦显微镜用于获取荧光图像。为了评估体外总dapi标记细胞中en1-、foxa2-、 otx2-、nurr1-和th表达细胞的数量，使用imagej软件计算了三个类器官中的至少10个采样区域。描绘脑切片上的移植物，并使用共聚焦显微镜捕获图像，以显示th+和hna+信号。使用image j手动计数单标记或双标记细胞。数据表示为th+与总hna+细胞的比值。
57.统计分析：所有数据均以平均值
±
sem表示，并使用graphpad prism 9进行统计分析。为了分析共表达th的hna+细胞的比例，使用了双因素方差分析和tukey 多重比较检验。对于所有行为测试结果，使用了双因素方差分析和bonferroni多重比较。显著性设置为p值≤0.05。
58.实施例1细胞培养和中脑类器官的产生
59.本发明提供的中脑类器官(hmo)的产生方法可分为神经诱导、中脑模式化、片层化、最终分化四个阶段，如图1a所示。产生中脑类器官的细胞来源为多能干细胞，例如可以是人诱导多能干细胞(hipsc)，在产生中脑类器官之前，hipsc例如可以在e8-mtesr培养基(stemcell
tm
，目录号05990)中的无饲养层基质胶 (feeder-free matrigel)上培养。采用包含如下四个阶段的制备方法诱导产生人中脑类器官。
60.神经诱导阶段：使用tryple
tm express(gibco，12563029)将hipsc从完整的群落中解离成单个细胞，并在具有v形底锥形孔的低细胞粘附96孔培养板 (corning)上按每孔10,000个细胞进行铺板，以形成均一的拟胚体(embryoid bodies， eb)；孔中含有神经元诱导基础培养基，该神经元诱导基础培养基含有dmem/f12 (gibco，10565-018)：neurobasal(gibco，21103049)1:1、1:100n2添加剂(gibco， 17502048)、1:50无维生素a型b27(gibco，12587010)、1％最低基本培养基 (mem)-非必需氨基酸(gibco，11130051)和0.1％β-巯基乙醇(invitrogen， 31350010)，并在上述神经元诱导基础培养基中添加1μg/ml肝素(sigma-aldrich)、 10μm sb431542(stemgent)、200ng/ml noggin(peprotech)、0.8μm chir99021 (reagents direct)和10μm rock抑制剂y27632(calbiochem)。前48小时加入rock抑制剂，
第2天更换培养基。
61.中脑模式化阶段：第4天，hmlo的神经元诱导基础培养基中加入200ng/ml的 shh-c25ii(peprotech)和100ng/ml的fgf8以用于中脑模式化。
62.片层化阶段：3天后，hmlo开始伸出神经外胚层芽。此时，完全去除培养基，并立即使用配备有预冷的200μl移液器吸头的移液器将30μl低生长因子基质胶(bdbiosciences，356230)添加到每个孔中。将基质胶包埋的中脑类器官置于37℃培养箱中30分钟，使基质胶凝固并在添加2.5μg/ml胰岛素(sigma-aldrich)、200ng/ml 层粘连蛋白(sigma-aldrich)、200ng/ml shh-c25ii和100ng/ml fgf8的神经元诱导基础培养基中生长24小时。
63.最终分化阶段：一旦hmlo嵌入基质胶中，在类器官中就会开始形成更扩张的神经上皮。为了促进生长和分化，通过使用切割的1000μl移液器吸头进行移液，将hmlo 转移到超低附着的6孔板(costar)中。这些板含有最终分化培养基，该最终分化培养基为在神经元诱导基础培养基的基础上添加10ng/ml bdnf(peprotech)、10ng/mlgdnf(peprotech)、100μm抗坏血酸(sigma-aldrich)和125μm db-camp (sigma-aldrich)并去除dmem/f12所得到的培养基。使用轨道式摇床(设置为70 rpm)培养hmlo，以增强营养物质和氧气交换。每2-3天更换一次培养基。
64.在制备中脑类器官的多次尝试中，发明人发现，当上述“中脑模式化阶段”和“片层化阶段”的shh-c25ii的浓度小于150ng/ml时，例如为100ng/ml时，形成中脑类器官的重现性较差，即无法稳定地形成所需的中脑类器官。
65.实施例2体外ipsc衍生的中脑类器官的表征
66.在不同时间点获得的hmo通过使用免疫荧光染色(图1b)和qpcr(图3c)来分析。在体外15天(days in vitro,div)时，hmo对神经干/祖细胞标志物nestin 和sox2、泛神经元和增殖标志物tuj1和ki67、胚胎中脑脑祖细胞标志物otx2和底板(floor-plate)衍生的多巴胺能祖细胞标志物foxa2和en1的染色为阳性，表明类器官主要由发育早期的中脑da谱系细胞组成(图1b，a至d)。在体外25天时， hmo对中脑有丝分裂后da细胞标志物nurr1和酪氨酸羟化酶(th)的染色为阳性(图 1b，e)。在体外45天时，证实了中脑a9区域特异性标志物girk2的表达(图1b， f)。此外，类器官内的神经上皮从体外15天时开始表现出顶端-基底极性，这可以通过ki67(一种主要位于类器官顶端侧的增殖标志物)的表达、以及tuj1+(一种位于基底侧的标志物)来阐明(图1b，b)。
67.在表征标志物表达谱后，我们评估了hmo的功能。在体外45天时开始出现神经黑色素样结构，并进行fontana-masson染色以显示神经黑色素，它们是通常由位于 snpc区域的多巴胺能神经元产生的黑色/棕色颗粒色素。如图1c所示，阳性染色的沉积物主要位于神经元胞质溶胶内。为了确认神经递质多巴胺的释放，我们对高钾刺激的培养上清液进行了高效液相色谱(hplc)分析，并且在体外60天时检测到dopac (3.806ng/ml，n＝10)及其代谢物dopa(6.149ng/ml，n＝10)的大量释放(图1d， a，b)。使用hplc在培养物中没有检测到神经递质血清素的分泌(数据未显示)。
68.为了进一步了解在hmo中形成的神经元网络的功能活动，我们使用了med64多电极阵列系统，这是一种记录整个类器官产生的细胞外场电位的非侵入性方法。在体外60天时的类器官中发现了几个同步的全网络爆发(network-wide bursts)细胞电位，表明中脑类器官中的神经元已经发展出适当的网络连接和电生理活动(图2a)。
69.此外，为了检查单个多巴胺能神经元的电生理特性，将中脑类器官移植到免疫缺陷小鼠的大脑中，并对急性脑切片(acute brain slices)进行全细胞膜片钳记录。
70.首先生成了一个具有增强型绿色荧光蛋白(egfp)慢病毒表达的报告hipsc系。 egfp在从hipsc分化为hmo的过程中组成性表达(图2b，a-d)。egfp+类器官被移植到scid小鼠的纹状体中。移植后六周，在所有移植动物中检测到egfp+移植物，并通过全细胞膜片钳记录检查移植细胞的电生理特性(图2b，e)。全细胞电流钳记录显示在移植的具有较长单个动作电位(action potential，ap)活动持续时间的 egfp+细胞中有规律的自发动作电位(超过10ms，图2c，a)。在电流钳模式下，可以通过以20-pa增量步长注入从-200pa至500pa的电流来诱发ap，并在响应开始时呈现典型的后超极化(afterhyperpolarization，ahp)“下垂”并且在响应结束时呈现延迟的内向整流(图2c，b)。在电压钳模式下，电压门控钾(k
+
)通道和钠(na
+
) 通道可以以10-mv的步长从
–
60mv到+60mv的保持电位被诱发(图2c，c)。膜片细胞被确认为th、egfp和生物胞素(biocytin)阳性(图2c，d)。
71.实施例3确定移植da分化的最佳阶段
72.一个理想的分化阶段将确保移植物入体后能良好存活以及其da神经元能成功分化并发育成熟。为了找到最佳的分化时间窗，首先测量了分化过程中类器官内与中脑 da神经元发育相关的基因的mrna表达，这些相关基因包括foxa2、en1、otx2、 nurr1、th和tuj1。与早期da谱系发育相关的转录因子foxa2、en1和otx2 在第7天达到峰值，然后逐渐减少。另一方面，由有丝分裂后da细胞表达的转录因子，如nurr1和th，在第15天开始被检测到，并分别在第25天和第30天达到峰值(图3b)。泛神经元标志物tuj1的水平在观察期间(第0天-第35天)逐渐增加 (图3b)。免疫荧光染色的结果显示出类似的趋势。foxa2染色从第10天到第15 天增加，并在第25天逐渐减少，而th染色在第15天开始检测到并在第25天增加(图 3c)。类器官在第10天显示出高表达的祖细胞标志物foxa2，但没有表达成熟的 da神经元标志物th(图3c，a和b)。因此，在第25天类器官中，th+信号的上调与foxa2+信号的下调相关(图3c，e和f)。之前使用insc衍生的da细胞进行移植的研究表明，处于晚期成熟阶段的da细胞无法在移植中存活(y.yuan等, dopaminergic precursors differentiated from human blood-derived induced neuralstem cells improve symptoms of a mouse parkinson's disease model.theranostics8,4679-4694,2018)。因此，我们将分化阶段缩小到第10天到第25天，以进行进一步的移植测试。我们将第10、15和25天的类器官移植到scid小鼠的纹状体中(图 3a和3d)。六周后，处死小鼠进行分析。通过使用对人细胞核(hna)或人细胞质 (stem121)特异的抗体来鉴定移植的细胞(图3d)。移植后一个月，在接受第10 天和第15天hmo的小鼠大脑中检测到存活细胞(图3d，a至d)。绝大多数的第 25天类器官移植物在移植后1个月内死亡(图3d，e)。相比之下，第10天的hmo 显示出良好的存活率，但仅产生少量th+细胞(图3d，a)。与第10天和第25天 hmo相比，第15天hmo在存活率和成熟为da神经元之间取得平衡(图3d，b至d)。基于上述结果，选择第15天的hmo进行进一步研究。
73.在体内效力测试之前，对第15天hmo的标志物表达和细胞类型组成进行了表征。免疫荧光染色结果显示，第15天hmo含有约30.65％的foxa2阳性细胞、17.54％的en1阳性细胞和10.04％的otx2阳性细胞，而只有一小部分细胞中有丝分裂后的 da标志物nurr1(2.06％)和th(0.79％)呈阳性(图8b，a)。在体外35天时， nurr1和th阳性细胞的比例分别增加到50.44％和32.22％(图8b，b)。
74.先前的研究表明，用于患者移植试验的胎儿腹侧中脑组织含有几种非多巴胺能神经元群，包括gaba能神经元、谷氨酸能神经元、胆碱能神经元和血清素能神经元(s. c.neto等,cell fate analysis of embryonic ventral mesencephalic grafts in the6-ohda model of parkinson's disease.plos one 7,e50178,2012)。移植物中过多的血清素能神经元导致不良副作用，包括移植物诱发的运动障碍(t.carlsson等, serotonin neuron transplants exacerbate l-dopa-induced dyskinesias in a ratmodel of parkinson's disease.j neurosci 27,8011-8022,2007)。鉴于上述问题，发明人通过染色细胞谱系标志物来评估hmo内各种细胞类型的组成，包括内侧棘状神经元(msn)的darpp32、gaba能的gad67、谷氨酸能的vglut1、胆碱能的 chat和血清素能神经元的serotonin。在hmo中没有检测到任何这些标志物(图 8c)。因此除了免疫荧光染色外，我们还在转录水平检测了nkx2.2、nkx6.1、hoxa2、 hoxb、gbx2和gata3的表达，它们是确定血清素能神经元的重要转录因子(m.p. smidt等,subset specification of central serotonergic neurons.front cell neurosci 7, 200,2013)，结果没有发现支持这些基因表达的证据(图8d)。关于少突胶质细胞谱系，通过免疫荧光染色，在第15天的类器官中观察到少量olig2+细胞(《1％)，并在第35天的类器官中鉴定出少量o4+细胞，在第15天和第35天的类器官中均未观察到mbp+成熟少突胶质细胞(图8c，a、b、d)。
75.实施例4pd模型建立与hmo移植
76.所有动物实验均按照3r原则(reduction,refinement,replacement)进行，并经首都医科大学宣武医院伦理委员会批准。本研究包括86只scid小鼠(8-12周龄， charles river，中国北京)，其中76只按先前报导的方法建立pd模型(y.yuan等, dopaminergic precursors differentiated from human blood-derived induced neuralstem cells improve symptoms of a mouse parkinson's disease model.theranostics8,4679-4694,2018)。简而言之，将2μl 6-ohda(5mg/ml，在含0.2％抗坏血酸的盐水中)直接注入右侧纹状体(前后[ap]＝+0.5mm，横向[l]＝-2.1mm，垂直[v]＝-3.2 mm)。6-ohda损伤后4周，选择26只阿扑吗啡诱导的在30分钟内旋转超过100 圈的动物进行移植实验。
[0077]
将26只6-ohda损伤小鼠中的10只分配到纹状体内仅接受缓冲液注射的载体对照组(vehicle control group)。其余16只pd小鼠被分配到hmo移植组。将第15 天的hmo移植到单侧6-ohda损伤的scid pd小鼠的纹状体中(图4a)。选择hmo 移植后的三个时间点，即在移植后6、12和16周，处死小鼠进行组织学分析。每个时间点的小鼠数量如下：6周(n＝4，a组)、12周(n＝8，b组)和16周(n＝4，c 组)。在研究过程中，16只小鼠中的一只意外死亡。其余15只移植的pd小鼠均表现为移植物存活，每个时间点的小鼠数量如下：6周(n＝4)、12周(n＝8)和16周 (n＝3)。将对应于2
×
105个细胞的类器官用物理手段切成小块(每块约0.2mm3) 并重新悬浮在含有rock抑制剂(0.5μm)、无维生素a型b27和bdnf(20ng/ml) 的4μl移植缓冲液中，然后将其注入右侧纹状体([ap]＝+0.5mm，横向[l]＝-2.1mm，垂直[v]＝-3.0mm)。注射速率为0.5μl/min，针头在原位再放置5分钟，然后慢慢缩回。
[0078]
在移植后6、12和16周，处死小鼠进行组织学分析。通过对hna和人神经细胞粘附分子(hncam)染色来鉴定移植的细胞。通过共同标记mda特异性标志物，包括foxa2、nurr1、th以及a9区域特异性da神经元标志物girk2，证实了体内移植类器官的分化和成熟(图4b，a至c)。移植后6周，移植的细胞对oct4和ki67 呈阴性，表明致瘤风险较低(图4b，d)。
[0079]
移植后6周，约2.57％的存活hna+细胞与th共标记(图4c，d)；在移植后 12周和16周，共表达th的移植细胞(hna+)的比例分别为14.11％和7.33％(图 4c，d)。与6周相比，移植后12周和16周的th+移植物呈现出更成熟的形态，具有更大的体细胞和更广泛的枝状结构(图4c，a至c)，表明移植物随着时间的推移逐渐成熟。
[0080]
实施例5移植ipsc衍生的中脑类器官可改善pd小鼠的运动功能
[0081]
为了检查移植物在恢复pd小鼠运动功能方面的功效，进行了行为测试，包括阿扑吗啡(apo)诱导的旋转、旷场测试和旋转棒测试。具体测试方式如下。
[0082]
apo诱导的旋转测试：在移植人中脑类器官(hmo)之前和之后的不同时间点，研究了阿扑吗啡(apo)诱导的旋转。皮内apo注射(盐水中10mg/ml，0.5mg/kg) 后5分钟，记录旋转。使用30分钟内的总净旋转次数(对侧减去同侧)进行分析。
[0083]
旷场测试：通过使用自动旷场系统测量平均速度和总移动距离来评估自发运动。使小鼠在测试前习惯于旷场场地(25.4cm
×
25.4cm)10分钟，然后是30分钟的观察期。每只动物在类器官移植前1周进行测试，并在移植后6周和12周重新测试。总移动距离的旷场测量值以米(m)为单位。
[0084]
转棒测试：通过使用哈佛仪器(harvard instruments)转棒仪测试被动运动协调功能。为了获得稳定的表现，所有动物都进行了两天的预训练。第1天，在300秒内从2到20转每分钟(rpm)的旋转棒上训练小鼠3次。在第2天，小鼠在一根棒上训练，该棒在300秒内两次从3rpm加速到30rpm，一次从4rpm加速到40rpm。测试从第三天开始，使用一根旋转棒，在300秒内从4加速到40rpm。测量停留在棒上的持续时间。对于数据分析，使用每只动物的三次重复测试的平均长度。使用 graphpad进行统计分析。对于多重比较，使用双因素方差分析和bonferroni的事后检验。
[0085]
结果显示，接受hmo移植物的pd小鼠在所有三个测试中都显示出统计学上的显著改善，这在载体对照组中未观察到(图4c，e至g)。结果表明，hmo的移植能够恢复因6-ohda损伤而受损的运动功能。
[0086]
实施例6移植的神经元逐渐发出轴突投射以支配目标大脑区域
[0087]
对于脑损伤小鼠的功能恢复来说，特定的轴突投射和整合到宿主神经元回路中是至关重要的(k.s.ziemba等,targeting axon growth from neuronal transplants alongpreformed guidance pathways in the adult cns.j neurosci 28,340-348,2008)。为了分析来自移植物的投射，我们使用人细胞特异性hncam抗体来标记移植细胞及其投射。在检查的时间段内，移植物团块大多保持在同一位置；然而，这些过程(树突和轴突)延伸至远离移植核心的位置(图5a)。在移植后6周和12周收集的大脑被冠向切片并沿前后(a-p)轴进行分析。
[0088]
在6周时，一些hncam+纤维沿着胼胝体(fa/cc)从纹状体移植区域延伸到大脑皮层(图5b，a)，主要位于前额叶皮层(pfc)的初级躯体运动皮层(mo)，该区域是一个天然的a9或a10神经元目标区域。没有观察到hncam+纤维进入初级躯体感觉(ss)区域。另一方面，一部分hncam+纤维向后延伸并进入苍白球(gp)、丘脑腹后外侧核(vpl)和内侧前脑束(mfb)(图5b，c和d)。一些hnacm+纤维继续生长穿过中脑(mb)运动相关核，例如中脑网状核(mrn)和束后屈肌(fr)，进入束旁核(spf)和丘脑后复合体(th)(图5b，e；b-e中的白框对应于i、ii 和iii)。一些hncam+纤维最终延伸至后侧大脑脚(cpd)(图5b，e；b-e中的白框对应于iv)。
[0089]
到12周时，可见明显的hncam+投射覆盖了屏状核(cla)和梨状核(ep)，少数纤维到达喙部嗅球(ot)和无名质(si)(图5c，a和i)。对更多的头端结构的分析，包括背外侧/腹侧纹状体(strd/strv)、伏隔核(nac/acb)，显示strv和 nac区域(该区域主要是a10目标)缺乏明显的移植物衍生神经支配。将移植物置于背侧纹状体中(图5c，b、c和iii)，该区域已被证实与细胞治疗研究中运动功能的改善密切相关。仔细观察轴突延伸的方向，发现有几根hncam纤维沿着胼胝体(cc) 进入对侧皮质(图5c，ii)。与6周时的小鼠相比，可以看到strd中的hncam+终端网络显著增长，更接近黑质(sn)(图5c，d、iv)。一小部分纤维延伸到实质黑质的网状/致密部分(snr/snc)和腹侧被盖区域(图5c，e和v；图6a，d至f)。
[0090]
实施例7移植物衍生的多巴胺能神经元支配宿主回路
[0091]
组织学分析显示了载体对照组小鼠的sn和str中单侧内源性th阳性中脑多巴胺能神经元的退化，表明了完整的str病变(图9a)，这与apo诱导的旋转不对称结果一致。为了检查da纤维的生长，我们对th和hncam切片进行了双重染色(图 6a)。在移植后6周，一些th+/hncam+纤维向后延伸并进入由内部和外部苍白球组成的苍白球(pal)(图6a，a至c)。移植后12周，一小部分th+/hncam+纤维继续延伸并进入同侧的黑质网状部/致密部(snr/snc)以及腹侧被盖区(图6a，d 至f)。
[0092]
移植物区域的功能恢复不仅取决于da神经元的存活和多巴胺释放的增加，还取决于移植物与宿主神经元回路的整合，以实现pd相关运动症状的长期缓解(a.f. adler等,hesc-derived dopaminergic transplants integrate into basal gangliacircuitry in a preclinical model of parkinson's disease.cell rep 28, 3462-3473.e3465,2019)。本实施例使用可以识别人和小鼠物种的突触蛋白抗体来识别形成的突触，染色显示移植物衍生的th+神经元已经接受了来自宿主(小鼠)和/ 或移植(人)神经元的突触输入(图6b，a和b)。此外，中脑da神经元自然会投射到纹状体内侧棘神经元(msn)。为了检查移植的神经元是否已形成突触，对 darpp32(msn的标志物)以及th和突触蛋白进行染色(图6b，c和d；图10c)。结果表明，移植的da神经元能够与内源性msn形成突触。
[0093]
实施例8逆行追踪揭示轴突生长模式
[0094]
霍乱毒素b亚基(ctb)为一种逆行轴突示踪剂，其被显微注射到不同组小鼠的喙部pfc(前额叶皮层)或后部区域hy(下丘脑)。通过ctb特异性抗体观察预期目标部位内的ctb沉积物。为了确认ctb沉积物与移植物本身明显分离，ctb和hna 被双重染色，结果显示ctb注射部位不存在移植细胞(数据未显示)。两周后，脑切片用ctb和hna或hncam双重染色，在纹状体中检测到ctb标记的移植物(图7a)，表明移植后4周移植的细胞已投射到pfc和hy中。
[0095]
狂犬病毒通过单个突触的选择性逆行传播允许精确识别宿主突触前输入到移植细胞上。为了实现单突触逆行传递，将表达慢病毒载体(狂犬病毒辅助构建体)的hipsc 衍生中脑类器官移植到中脑(图7b，a；图10a)，该慢病毒载体可编码tva(a亚组禽肉瘤白血病病毒)、rvg(狂犬病毒糖蛋白)和gfp。追踪载体和对照载体购自 addgene(id分别为30195和30456，watertown,ma)。人ipsc(第30-35代) 用慢病毒表达追踪载体或对照载体转导，并通过嘌呤霉素选择和gfp表达确认成功转导的细胞。对照病毒的滴度为4
×
108tu/ml；示踪病毒为2
×
108tu/ml， rv-enva-g-mcherry g-狂犬病毒(brainvta公司，中国武汉)为2
×
108tu/ml。使用0.1-0.5％(每只小鼠约1μl)的工作稀释液进行体内注射。组蛋白标记的gfp 可用于起始细胞确认；tva受体和rvg在enva-假型-狂犬病毒初次感染后，可促进狂犬病毒
的单突触逆行传播(图7b，b)。发明人采用了一个控制载体，该载体包括 gfp和tva但同时缺少rvg，来控制非特异性标记。移植后4周，在植入部位观察到用gfp和th共标记的分化多巴胺能神经元(图10b)。为了将突触输入标记到移植细胞(此处称为起始神经元)上，将enva-假型g-狂犬病毒注射到与hmo移植物相同的部位(图7c，a)。
[0096]
在起始细胞中证实了gfp表达(图10a)。在用同样表达mcherry的g-狂犬病毒载体感染后，表达tva受体的起始神经元被g-狂犬病毒感染，并且容易被gfp和 mcherry的共表达识别。g-狂犬病毒可以在起始细胞中组装成感染性颗粒，因为这些神经元表达rvg。由于狂犬病毒更喜欢通过活跃的突触逆行传播，所以每个与起始神经元形成突触前连接的神经元，称为追踪神经元，都将被mcherry转导(g.ugolini 等,specificity of rabies virus as a transneuronal tracer of motor networks:transferfrom hypoglossal motoneurons to connected second-order and higher order centralnervous system cell groups.j comp neurol 356,457-480,1995)。因此，在与起始神经元连接的跟踪神经元中只能识别出红色荧光(mcherry，但不是gfp表达)。小鼠被微量注射假型狂犬病毒并在一周后处死用于组织学分析。检测到成功感染假型狂犬病毒的移植神经元，并确定了位于移植物内部的追踪神经元以及几个大脑区域(包括pfc、菌毛(fi)、strd、下丘脑外侧区(lha)和mb)(图7c，c至f)。
[0097]
基于上述实施例1-8的结果，本发明的hipsc衍生的中脑类器官被移植到免疫缺陷小鼠帕金森病模型中，植入后的中脑类器官成熟为foxa2/nurr1/th/girk2免疫反应性da神经元，表现出电生理活动并改善pd小鼠的运动功能。移植的中脑类器官显示出强大的神经突/轴突延伸和与宿主神经元的双向突触连接。
[0098]
相对于现有研究中使用fvm治疗pd的方式表现出的伦理问题、来源稀少和移植异质性，本发明的中脑类器官显示出在伦理、来源和移植方面的优势。源自ipsc的 hmo可以很好地解决与胚胎衍生的fvm组织相关的伦理和来源问题。就异质性问题而言，hmo也是有利的，其可应用于自身移植或同质移植。
[0099]
从细胞组成来说，在fvm组织中，神经元仅占总细胞的5.6％左右，大多数细胞是星形胶质细胞、小胶质细胞、内皮细胞等(f.a.azevedo等,equal numbers ofneuronal and nonneuronal cells make the human brain an isometrically scaled-upprimate brain.j comp neurol 513,532-541,2009)。在神经元中，约70％为da谱系细胞，30％为gaba能细胞，2-3％为谷氨酰胺能细胞(m.a.ungless等,are you oraren't you？challenges associated with physiologically identifying dopamineneurons.trends neurosci 35,422-430,2012)。鉴于在受孕后7-9周的小胚胎中单纯分离所需的腹侧中脑区域存在技术困难，因此在移植物中经常检测到其他污染细胞，例如血清素能神经元，这些细胞被认为与严重的副作用有关，如运动障碍等。本发明提供的ipsc衍生的第15天的hmo主要由神经元谱系细胞组成，未检测到星形胶质细胞或少突胶质细胞(图8c)；在第15天的hmo中，这些神经元细胞中有超过30％是da谱系细胞(30.64％的foxa2+、17.54％的en1+、10.04％的otx2+、2.10％的nurr1+和0.80％的th+；图8b，a)且没有发现gaba能细胞、谷氨酰胺能细胞或血清素能细胞(图8c，f)。对于可能引起运动障碍等严重副作用的血清素能谱系细胞，我们还在转录水平上检查了发育过程中与血清素能细胞规格相关的基因，均未达到可检测的水平(图8c，e和图8d)。
[0100]
二维培养中的ipsc衍生的da前体也能够解决上述与fvm组织相关的一些问题。然而，关于ipsc衍生物的最大担忧是与多能干细胞不完全分化相关的致瘤风险。与单细胞培养相比，类器官的发育还依赖于内部结构接触/支持和内在信号，这些信号在器官/组织水平上协调/同步所有相关细胞的发育。这个过程更类似于胚胎发育，并且由此产生的类器官具有与fvm组织相当的低致瘤风险。正如本发明实施例(特别是实施例4)所揭示的，在移植到免疫缺陷小鼠的大脑中四个月后，没有观察到肿瘤形成或移植物过度生长，并且移植物对ki67和oct4呈阴性(图4b，d)，证实了本发明的中脑类器官的致瘤风险为低水平。
[0101]
已有研究表明，以二维方式培养的ipsc衍生da细胞与fvm组织中的da细胞不同。与fvm移植相比，需要更多数量的以二维方式培养的ipsc衍生da细胞才能实现类似水平的运动功能恢复。大约500
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700个存活的fvm的da神经元足以逆转药物诱导的旋转(a.rath等,survival and functional restoration of human fetalventral mesencephalon following transplantation in a rat model of parkinson'sdisease.cell transplant 22,1281-1293,2013)；而似乎需要数千个ipsc衍生的二维培养的da神经元来完全逆转药物诱导的旋转(g.hargus等,differentiatedparkinson patient-derived induced pluripotent stem cells grow in the adult rodentbrain and reduce motor asymmetry in parkinsonian rats.proc natl acad sci u s a107,15921-15926,2010)。fvm的da细胞具有更高效率与其更大的枝状化能力有关：有活力的fvm的da神经元可以将突起延伸到6毫米，并且几乎可以将整个纹状体枝状化(a.rath等,survival and functional restoration of human fetal ventralmesencephalon following transplantation in a rat model of parkinson's disease.celltransplant 22,1281-1293,2013)；相比之下，ipsc衍生的二维培养的da神经元将突起延伸至2-3mm，并且仅约10％的纹状体树突状(p.brundin等,behaviouraleffects of human fetal dopamine neurons grafted in a rat model of parkinson'sdisease.exp brain res 65,235-240,1986)。在目前的研究中，hmo产生了大约 200-800个存活的da神经元，并且可以在移植后6周逆转阿扑吗啡诱导的旋转(图 4c，e)。此外，hmo衍生的da神经元不仅在整个纹状体呈现枝状化，还向中脑、丘脑和下丘脑区域发送投射(图5b和c)，并接收来自前额叶皮层、中脑和下丘脑区域的传入投射(图7c)。hmo与原生的sn a9 da神经祖细胞/前体具有更大的相似性，这种内在相近性以及具有较少污染细胞的同质性更高的群体，会赋予hmo更强的能力来建立与大脑中自然投射目标的双定向突触连接。