本发明涉及中药，尤其涉及一种组合物及其在制备治疗肝癌或/和乳腺癌的药物中的应用和筛选方法。
背景技术：
1、随着社会经济发展、人口老龄化进程加快以及不良生活习惯、环境污染等致癌因素流行，恶性肿瘤死亡率持续上升，疾病负担日益加重。据全球肿瘤研究中心（iarc）最新研究报告，全球范围内肿瘤的发病率和死亡率呈逐年上升趋势，因此对肿瘤的研究受到广泛重视。常见的恶性肿瘤有乳腺癌、肝癌、胃癌、肺癌和结直肠癌等。
2、通关藤，也被称为乌骨藤、通光散、下奶藤等，是萝藦科牛奶菜属植物的干燥茎。近年研究指出，通关藤在体内外均被证实了具有抗肿瘤活性，如肝癌、肺癌、食管癌、胃癌和乳腺癌等。c21甾体皂苷类作为通关藤的首要特征，被认为是其主要的抗肿瘤活性成分，它能够抑制癌细胞成长、调节肿瘤细胞血管生成和破坏肿瘤组织的血液供应，进而抑制肿瘤的生长和扩散，还能促进癌细胞的分化，使其向正常细胞转化。
3、期刊文件《基于网络药理学和实验验证探讨通关藤治疗乳腺癌作用机制》中提供了通关藤中37种可用于乳腺癌的活性成分，期刊文件《基于网络药理学探讨通关藤抗肝细胞癌的作用机制》中提供了通关藤中50种可用于肝细胞癌的活性成分。但是这些活性成分都是基于通关藤活性成分数据库而筛选得到的，数据库中的活性成分没有经过体内代谢过程的验证，而某些活性成分经体内代谢后可能发生结构改变、导致筛选的活性成分可能是未被实际吸收的无效前体；也可能漏掉通关藤原形成分经代谢后产生的真正活性成分。
4、目前还有一些专利文件是基于入血成分筛选有效活性成分的，比如公开号为cn118010862a的专利文件公开的一种脑心清片药效物质基础的改良分析方法，将uplc-q/tof-ms技术应用到脑心清片化学成分和入血成分鉴定和分析研究中，与网络药理平台结合，发现脑心清片药效物质成分及作用机制，揭示脑心清片复杂的药效网络机制。
5、但目前还未有对通关藤治疗肝癌或/和乳腺癌的关键活性成分和作用机制的研究。
技术实现思路
1、本发明要解决上述问题，提供一种组合物及其在制备治疗肝癌或/和乳腺癌的药物中的应用和筛选方法。
2、本发明解决问题的技术方案是，首先，提供一种组合物，包括新绿原酸、绿原酸、隐绿原酸、通关藤苷i、通关藤苷h。
3、本发明中，发明人通过通关藤片的入血原形成分结合靶向网络药理学研究，筛选得到一种组合物，组合物中的多个活性成分在入血成分中共存、协同作用。
4、其次，本发明还提供上述组合物在制备治疗肝癌或/和乳腺癌的药物中的应用。
5、作为本发明的优选，所述组合物尤其适用于制备治疗肝癌和乳腺癌的药物中的应用。
6、作为本发明的优选，所述组合物通过至少影响pi3k-akt信号通路、gnrh信号通路和il-17信号通路，以应用于制备治疗肝癌或/和乳腺癌的药物中，尤其适用于制备治疗肝癌和乳腺癌的药物中。
7、作为本发明的优选，所述组合物通过至少作用于stat3、pik3ca、kdr、hsr90aa1、met、pik3cd和pik3cb靶点，以至少影响pi3k-akt信号通路、gnrh信号通路和il-17信号通路，以应用于制备治疗肝癌或/和乳腺癌的药物中，尤其适用于制备治疗肝癌和乳腺癌的药物中。
8、本发明中，组合物中的多个活性成分在入血成分中共存、协同作用，每个活性成分对应多个靶点，每个靶点连接多个活性成分，多个靶点对应多个通路，使得组合物中的多个活性成分协同从多个靶点、多个通路作用于肝癌或/和乳腺癌。
9、单独应用时，所述绿原酸的给药量不低于10μg/ml，示例地，可以是10μg/ml、25μg/ml、50μg/ml、100μg/ml、200μg/ml、400μg/ml、600μg/ml、800μg/ml，均能抑制mcf-7细胞活力和hepg2细胞活力，以有效应用于乳腺癌和肝癌。
10、优选地，所述绿原酸的给药量不低于100g/ml，对mcf-7细胞活力和hepg2细胞活力的抑制性进一步提高，同时可降低mcf-7、hepg2细胞mda含量，提高mcf-7、hepg2细胞sod酶活力，提高mcf-7、hepg2细胞内gsh的含量。
11、进一步优选地，所述绿原酸的给药量不低于400g/ml，对mcf-7细胞活力和hepg2细胞活力的抑制性更进一步提高，同时更进一步降低mcf-7、hepg2细胞mda含量，更进一步提高mcf-7、hepg2细胞sod酶活力，更进一步提高mcf-7、hepg2细胞内gsh的含量。
12、单独应用时，所述新绿原酸的给药量不低于50μg/ml，示例地，可以是50μg/ml、100μg/ml、200μg/ml、400μg/ml、600μg/ml、800μg/ml，均能抑制mcf-7细胞活力和hepg2细胞活力，以有效应用于乳腺癌和肝癌。
13、优选地，所述新绿原酸的给药量不低于100g/ml，对mcf-7细胞活力和hepg2细胞活力的抑制性进一步提高，同时可降低mcf-7、hepg2细胞mda含量，提高mcf-7、hepg2细胞sod酶活力，提高mcf-7、hepg2细胞内gsh的含量。
14、进一步优选地，所述新绿原酸的给药量不低于400g/ml；对mcf-7细胞活力和hepg2细胞活力的抑制性更进一步提高，同时更进一步降低mcf-7、hepg2细胞mda含量，更进一步提高mcf-7、hepg2细胞sod酶活力，更进一步提高mcf-7、hepg2细胞内gsh的含量。
15、单独应用时，所述隐绿原酸的给药量不低于25μg/ml，示例地，可以是25μg/ml 、50μg/ml、100μg/ml、200μg/ml、400μg/ml、600μg/ml、800μg/ml，均能抑制mcf-7细胞活力和hepg2细胞活力，以有效应用于乳腺癌和肝癌。
16、优选地，所述隐绿原酸的给药量不低于100g/ml，对mcf-7细胞活力和hepg2细胞活力的抑制性进一步提高，同时可降低mcf-7、hepg2细胞mda含量，提高mcf-7、hepg2细胞sod酶活力，提高mcf-7、hepg2细胞内gsh的含量。
17、进一步优选地，所述隐绿原酸的给药量不低于400g/ml；对mcf-7细胞活力和hepg2细胞活力的抑制性更进一步提高，同时更进一步降低mcf-7、hepg2细胞mda含量，更进一步提高mcf-7、hepg2细胞sod酶活力，更进一步提高mcf-7、hepg2细胞内gsh的含量。
18、单独应用时，所述通关藤苷i的给药量不低于50μg/ml，示例地，可以是50μg/ml、100μg/ml、200μg/ml、400μg/ml、600μg/ml、800μg/ml，均能抑制mcf-7细胞活力和hepg2细胞活力。
19、优选地，所述通关藤苷i的给药量不低于100μg/ml，对mcf-7细胞活力和hepg2细胞活力的抑制性进一步提高，同时可降低mcf-7、hepg2细胞mda含量，提高mcf-7、hepg2细胞sod酶活力，提高mcf-7、hepg2细胞内gsh的含量。
20、进一步优选地，所述通关藤苷i的给药量不低于600μg/ml，对mcf-7细胞活力和hepg2细胞活力的抑制性更进一步提高，同时更进一步降低mcf-7、hepg2细胞mda含量，更进一步提高mcf-7、hepg2细胞sod酶活力，更进一步提高mcf-7、hepg2细胞内gsh的含量。
21、单独应用时，所述通关藤苷h的给药量不低于50μg/ml，示例地，可以是50μg/ml、100μg/ml、200μg/ml、400μg/ml、600μg/ml、800μg/ml，均能抑制mcf-7细胞活力和hepg2细胞活力。
22、优选地，所述通关藤苷h的给药量不低于100μg/ml，对mcf-7细胞活力和hepg2细胞活力的抑制性进一步提高，同时可降低mcf-7、hepg2细胞mda含量，提高mcf-7、hepg2细胞sod酶活力，提高mcf-7、hepg2细胞内gsh的含量。
23、进一步优选地，所述通关藤苷h的给药量不低于600μg/ml，对mcf-7细胞活力和hepg2细胞活力的抑制性更进一步提高，同时更进一步降低mcf-7、hepg2细胞mda含量，更进一步提高mcf-7、hepg2细胞sod酶活力，更进一步提高mcf-7、hepg2细胞内gsh的含量。
24、组合应用时，所述组合物的给药量不低于100μg/ml，示例地，可以是100μg/ml、200μg/ml、300μg/ml、400μg/ml、500μg/ml、600μg/ml、700μg/ml、800μg/ml、900μg/ml、1000μg/ml。
25、组合物中酚酸类化合物和苷类化合物的给药量比为1:（0.5~5），示例地，可以是1:0.5、1:1、1:1.5、1:2、1:2.5、1:3、1:3.5、1:4、1:4.5、1:5。酚酸类化合物是指新绿原酸或绿原酸或隐绿原酸，苷类化合物是指通关藤苷i或通关藤苷h。
26、优选地，酚酸类化合物和苷类化合物的给药量比为1:（1~2）。
27、最后，本发明还提供从通关藤片中筛选上述组合物的方法，包括以下步骤：
28、s1.给药后利用uplc-q/tof-ms技术分析给药血浆中的入血成分；
29、s2.利用网络药理学相关数据库，搜集所述入血成分对应的作用靶点，构建通关藤片靶点库；构建肝癌和乳腺癌交集靶点库；将所述通关藤片靶点库和所述肝癌和乳腺癌交集靶点库取交集得到潜在作用靶点；
30、s3.利用所述入血成分、所述潜在作用靶点，构建通关藤片的“入血成分-靶点-疾病”可视化网络图，并据网络分析得到入血成分中的主要活性成分，所述主要活性成分为所述组合物。
31、步骤s1中，作为本发明的优选，对实验大鼠给药后剁头取血，对血液样品离心后取上清液，得到血浆样品，血浆样品于-80℃下保存备用。对血浆样品前处理后采用超高效液相色谱-四级杆飞行时间质谱（uplc-q/tof-ms）技术筛选出所述入血成分。
32、进一步优选地，血浆样品前处理包括以下步骤：取出血浆样品，在0~4℃下解冻。在1 ml血浆中加入3~5ml冷甲醇，涡旋3~8min后，震荡15~25 min，在0~4℃，6000~10000 r/min条件下离心5~15min，取上清液用氮气吹干，用80~120 µl甲醇复溶，再次在0~4℃，12000~15000 r/min条件下离心5~15 min，取上清液用于uplc-q-tof-ms分析。
33、进一步优选地，hplc色谱条件为色谱柱：agilent poroshell-c18 （4.6 mm×150mm，2.7 μm），柱温：30℃，流速：0.5 ml/min，进样量：5μl；流动相a：乙腈，流动相b：0.1%甲酸水，梯度洗脱程序为：0~4 min，5~20 % a；4~15 min，20~25 % a；15~25min，25~35 % a；25~45min，35~50 % a；45~50 min，50~75 % a； 50~55min，75~95 % a； 55~57min，95~100 %a；57~62min，100 % a；62~67min，100~5 % a；67~72min，5 % a。
34、质谱条件：采用esi电喷雾离子源，mse全扫描模式，正、负离子模式下采集数据，扫描时间0.3 s，扫描范围50~1200 da。采用氩气作为碰撞气体，低碰撞能量为6 v，高碰撞能量为20~30 v、30~50 v、50~60 v。使用甲酸钠和亮氨酸脑啡肽对质谱仪进行校正和实时校正。亮氨酸脑啡肽生成实时参考离子在正离子模式下为[m+h]+（m/z 556.2771），在负离子模式下为[m-h]-（m/z 554.2615）
35、步骤s2中，作为本发明的优选，将鉴定出的入血成分导入swiss targetprediction数据库、uniprot数据库，查找各个入血成分相对应的靶点蛋白，得到通关藤片靶点库。
36、在genecards数据库获取到肝癌和乳腺癌的疾病相关靶点，得到肝癌和乳腺癌交集靶点库。其中进一步优选地，采用计算中位数的算法来去除相关度值较低的基因。
37、使用venny 2.2.0在线分析工具，上传通关藤片靶点库、肝癌和乳腺癌交集靶点库，从而获取通关藤片治疗肝癌、乳腺癌疾病的潜在作用靶点。
38、步骤s3中，作为本发明的优选，将由步骤s1获得的通关藤片中的入血成分及由步骤s2获得的潜在作用靶点分别导入cytoscape软件，构建通关藤片的“入血成分-核心靶点-疾病”网络，据网络分析得到关键入血成分。
39、作为本发明的优选，还包括以下步骤：s4.对所述潜在作用靶点建立ppi网络，获得关键作用靶点。
40、步骤s4中，进一步优选地，将潜在作用靶点导入string数据库进行ppi网络构建，并隐去游离蛋白后，得到网络分析图，通过cytoscape软件进行了可视化展示获得通关藤片治疗肝癌、乳腺癌的关键作用靶点。
41、作为本发明的优选，还包括以下步骤：s5.对所述潜在作用靶点进行go富集分析和kegg通路富集，获得富集显著性高的信号通路。
42、步骤s5中，进一步优选地，访问metascape数据库官方网站，将潜在作用靶点导入，获得go富集分析和kegg通路富集分析结果，并绘制bp、cc和mf三合一柱状图及kegg富集分析气泡图，分别对其富集显著性高的通路进行分析。
43、作为本发明的优选，还包括以下步骤：s6. 通过cck-8实验验证所述组合物对hepg2、mcf-7细胞增殖的影响；进行细胞实验氧化应激因子试剂盒检测证药效成分对hepg2、mcf-7细胞mda含量、sod酶活力、gsh含量影响。
44、本发明的有益效果：
45、本发明通过通关藤片的入血原形成分结合靶向网络药理学研究，筛选得到一种组合物，组合物中的多个活性成分（新绿原酸、绿原酸、隐绿原酸、通关藤苷i、通关藤苷h）在入血成分中共存，每个活性成分对应多个靶点，每个靶点连接多个活性成分，多个靶点对应多个通路，使得组合物中的多个活性成分协同从多个靶点、多个通路作用于肝癌或/和乳腺癌，为开发治疗肝癌或/和乳腺癌的药物提供了新的研究方向。