一种miRNA-532反义核苷酸药物组合物及其用图
【技术领域】
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[0001]本发明属于生物医药技术领域，涉及一种内源性的非编码小RNAs的新药及用途，尤其是一种含miRNA-532反义核苷酸的药物组合物及其在预防或治疗心脏疾病中的用途。
【背景技术】
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[0002]心血管疾病是人类健康和生命的主要威胁，是人类健康的头号杀手，全世界每年有一千七百多万人死于心血管疾病，其死亡率已接近所有癌症死亡率的总和。随着人类生活水平日益提高和饮食结构的改变，心血管疾病死亡率呈明显上升趋势，已超过癌症成为第一大致死原因。根据近期公布的最新统计结果表明，18岁及以上居民高血压患病率为18.8%，估计全国患病人数1.6亿多，由此造成的心肌肥大、心肌梗死、冠心病、以及心力衰竭等凋亡相关心脏疾病的病人达几千万。目前关于心脏疾病发病机理尚不完全清楚，心脏疾病的预防、诊断和治疗尚不能达到让人满意的效果，急需开发新的技术方法用于心脏病的诊断和防治。miRNA是新近研究发现的一类内源性非编码小RNA分子，许多研究表明miRNA对于维持心脏正常生理功能具有重要作用，心脏中的miRNA异常表达与许多心脏疾病的发生相关。因此，将miRNA作为心脏疾病治疗的靶点，开发相关药物具有潜在的临床应用价值；单一的miRNA可以同时作用于多个靶基因的mRNA的表达，药物作用于一个miRNA可以调节多个参与心脏发病基因的表达，影响多个信号通路，从整体上达到治疗疾病的目的。由于miRNA在心脏病理状态下表达水平不同，可以通过检测miRNA的表达水平来预测诊断疾病。
[0003]细胞凋亡(apoptosis)又称程序性细胞死亡，是指细胞在一定的生理或病理条件下，遵循自身的程序，自己结束生命的过程，是一个主动的、高度有序的、由基因控制及一系列酶参与的过程，对正常胚胎发育，维持细胞群体及恶性病变过程中均起重要作用，在保证多细胞生物的健康生存过程中扮演着关键的角色。在许多心肌损伤或心脏病理状态下，如心肌缺血再灌注损伤、心肌肥大和心力衰竭等，心肌细胞会发生凋亡。由于成熟的心肌细胞不能分裂增殖，心肌细胞过度凋亡必然会使心肌细胞数目减少，这可能是心脏疾病发病的机理。目前研究发现许多miRNA通过调控凋亡相关靶蛋白的表达参与细胞凋亡的发生，这些miRNA有促凋亡的，也有抑凋亡的。寻找心脏中特异表达的、参与心肌细胞凋亡的miRNA，阐明其作用机理，对于开发以miRNA为策略的心脏疾病的诊断和治疗具有及其重要的意义和应用前景。
【发明内容】
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[0004]本发明的目的在于克服现有技术存在的缺点，寻求一种新型药物组合物，确定调控心肌细胞凋亡的心脏特异性表达的miRNA及其在心肌缺血再灌、心肌梗死、冠心病、心肌肥大和心肌纤维化等心脏疾病中的用途，用于心脏疾病的诊断与防治。
[0005]为了实现上述发明目的，本发明涉及的药物组合物包括miRNA-532反义核苷酸和药学上可接受的载体、病毒或辅料；所用的miRNA-532反义核苷酸的序列为5’ -ACGGUCCUACACUCAAGGCAUG-3’ ；所述载体为壳聚糖、胆固醇、纳米颗粒和脂质体中的一种或多种；所述病毒载体为腺病毒载体、慢病毒载体、逆转录病毒载体中的一种或多种，优选的为腺病毒载体；所述辅料为甘露醇、磷酸盐缓冲液、生理盐水中的一种或多种。
[0006]本发明中所述的药物组合物中过表达miRNA-532反义核苷酸的腺病毒载体感染滴度为1016PFU。
[0007]本发明的miRNA-532反义核苷酸药物组合物用于心肌梗死、心肌缺血损伤、心肌肥大和心肌纤维化的治疗和防治，以口服或注射方式给药；所述注射为静脉注射、肌肉注射、冠状动脉内注射或直接心肌注射。
[0008]本发明还提供一种用于预防或治疗心脏疾病的试剂盒，含有的miRNA-532反义核苷酸与载体构成药物导入体内，用于心肌梗死、心肌缺血损伤、心肌肥大和心肌纤维化的预防与治疗。
[0009]本发明通过实验发现miRNA-532在心肌缺血损伤及缺氧诱导的心肌细胞凋亡过程中表达显著上调；通过转染和注射miRNA-532反义核苷酸抑制miRNA-532的表达能够抑制心肌细胞凋亡、心肌缺血损伤和心肌梗死面积减少；通过抑制心肌细胞凋亡对心脏具有保护作用，给予miRNA-532升高miRNA-532的表达能够诱导心肌细胞凋亡和心肌缺血损伤加重。
[0010]本发明与现有技术相比，其选用的原料科学合理，制备工艺简单，药物作用明显，使用范围广，使用安全可靠，应用环境友好。
【附图说明】
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[0011]图1为心肌缺血损伤及缺氧处理(Anoxia)的心肌细胞凋亡过程中miRNA-532表达水平的变化图；
[0012]图2为抑制内源性的miRNA-532对心肌细胞凋亡的抵抗作用图；
[0013]图3为miRNA-532反义核苷酸对心肌缺血损伤的抵抗作用图。
【具体实施方式】
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[0014]下面通过具体实施例并结合附图进一步阐述本发明。
[0015]以下各实施例中涉及的材料、实验方法和操作工艺，包括原代心肌细胞培养，腺病毒的构建及感染心肌细胞的剂量，细胞转染，心脏缺血再灌手术步骤，Evans blue/TTC双染和 TUNEL 检测均参见以下文献:Wang JX, etal, miR-499 regulates mitochondrialdynamics by targeting calcineurin and dynamin-related protein-1.2011 January17:71-78;其中所用的试验动物为小鼠，其小鼠品种为C57/BL6，购自北京医科大学；所用的酶如限制性内切酶、扩增酶和逆转录酶等，均购自北京奥博生物有限公司；所用的试剂均为分析纯级试剂，且从正规渠道商购获得。
[0016]实施例1、
[0017]miRNA-532反义核苷酸过表达腺病毒载体及阴性对照腺病毒构建，本实施例采用人工合成miRNA-532反义核苷酸序列，亚克隆连入Amb1n公司的pSi lencer Adeno1.0-CMV系统，构建miRNA-532反义核苷酸过表达腺病毒。其miRNA-532反义核苷酸核苷酸序列如下列 SEQ ID NO:1 所示:5’ -ACGGUCCUACACUCAAGGCAUG-3’
[0018]按照公司说明书步骤，将Pac I线性化的该载体与线性化的腺病毒骨架(AdenovirTs LacZ Backbone)共转染HEK-293细胞,包装腺病毒,扩增收集病毒,测定病毒滴度；将空载体和腺病毒骨架按照上述步骤共转染HEK-293细胞，包装阴性对照腺病毒。
[0019]将上述所得的过表达miRNA-532反义核苷酸的重组体腺病毒磷酸盐缓冲液稀释为感染滴度lxl016PFU/ml，按Iml量无菌分装到安瓿瓶内，即得。
[0020]实施例2、
[0021]心肌缺血及心肌细胞缺氧诱导的心肌细胞凋亡过程中miRNA-532表达情况检测，本实施例对心肌细胞凋亡实验模型，采用常规的方法培养大鼠乳鼠原代心肌细胞，低氧培养箱(氧浓度低于1%)培养不同时间，提取RNA，实时荧光定量PCR技术检测miRNA-532的表达水平，图1为心肌缺血损伤及缺氧处理(Anoxia)