人ezh2抑制剂及其应用方法
【专利说明】
[0001] 相关引用
[0002] 本申请要求2012年3月12日提交的美国专利申请号13/418,242的优先权，其全 文通过引用纳入本文。
技术领域
[0003] 本发明涉及人组蛋白甲基转移酶EZH2的野生型和某些突变形式的抑制，所述 EZH2是PRC2复合物的催化亚基，其催化在组蛋白H3上第27位赖氨酸（H3-K27)的单-至 三-甲基化，还涉及用于治疗癌症的方法，所述癌症包括滤泡性淋巴瘤和弥散性大B细胞淋 巴瘤（DLBCL)，以及用于测定对象中对EZH2抑制剂响应性的方法。
[0004] 背景
[0005] 在真核细胞中，DNA与组蛋白包装形成染色质。约150碱基对的DNA在组蛋白的 八聚体（组蛋白2A、2B、3和4各两个）上缠绕两圈形成核小体一一染色质的基本单位。染 色质有序结构的变化能引起关联基因转录中的改变。该过程高度受控，因为基因表达模式 的改变深度影响基础细胞过程，诸如分化、增殖和凋亡。通过共价修饰组蛋白，最显著是其 N端尾部来介导对染色质结构（并因而对转录）变化的控制。这些修饰通常称为表观遗传 学修饰，因为它们能造成基因表达中的可遗传改变，但不影响所述DNA本身的序列。氨基酸 侧链的共价修饰（例如，甲基化、乙酰化、磷酸化和泛素化）是酶促介导的。
[0006] 向组蛋白上的特定氨基酸位点选择性添加甲基基团受到被称为组蛋白甲基转移 酶（HMT)的独特酶家族作用的控制。具体基因的表达水平受相关的组蛋白位点处一个或多 个甲基基团的存在与否影响。具体组蛋白位点处的甲基基团的特定作用持续直至所述甲基 基团被组蛋白去甲基化酶移除，或持续直至所述修饰的组蛋白通过核小体转换被替代。以 类似的方式，其它酶类能够用其它化学物质修饰DNA和组蛋白，并且其它酶也能移除这些 物质来控制基因表达。
[0007] 必须严格控制转录调节幕后的生化系统有序体系，从而最优化地进行细胞生长和 分化。当这些控制被负责DNA和组蛋白修饰的酶的异常表达和/或活性干扰时，产生疾病 状态。例如，在人癌症中，越来越多的证据提示表观遗传酶活性失调导致癌症相关的细胞增 殖失控及其它癌症相关表型，例如增强的细胞迀移和入侵（invasion)。除了癌症外，有越来 越多的证据显示表观遗传酶在众多其它人疾病中的作用，包括代谢疾病（例如糖尿病）、炎 性疾病（例如克罗恩氏病（Crohn'sdisease))、神经退行性疾病（例如阿尔茨海默病）和 心血管疾病。因此，选择性调节表观遗传酶的异常作用就一定范围疾病的治疗而言具有广 泛前景。
[0008]组蛋白甲基转務酶EZH2
[0009] 已知多梳组（PcG)和三胸组（trxG)蛋白是细胞记忆系统的部分。Francis 等?（2001)NatRevMolCellBiol2:409-21;Simon等?（2002)CurrOpinGenet Devl2:210-8.这两组蛋白都涉及保持同源异形框（Hox)基因表达的空间模式，其在胚胎发 育早期由瞬时表达的分节基因建立。一般而言，PcG蛋白是保持"关闭状态"的转录抑制子， 而trxG蛋白是保持"启动状态"的转录激活子。因为PcG和trxG蛋白的成员包含固有的 组蛋白甲基转移酶（HMTase)活性，所以PcG和trxG蛋白可通过核心组蛋白的甲基化来参 与细胞记忆。Beisel等?（2002)Nature419:857-62;Cao等?（2002)Science298:1039-43 ; Czermin等? （2002)Celllll:185-96;Kuzmichev等? （2002)GenesDev16:2893-905; Milne等.（2002)M〇1Cell10:1107-17;Muller等.（2002)Celllll:197-208;Nakamura 等?（2002)MolCelllO:1119-28.
[0010] 生化和基因研宄提供证据显示果幡（Drosophila)PcG蛋白在至少两个不同蛋白 复合物中起作用，所述蛋白复合物为多梳抑制复合物1(PRC1)和ESC-E(Z)复合物（也称作 多梳抑制复合物2(PRC2))，尽管所述复合物的组成可为动态。Otte等.（2003)CurrOpin GenetDev13:448-54?果幡（Drosophila)中的研宄（Czermin等?（同上）；Muller等?（同 上））和哺乳动物细胞中的研宄（Cao等.（同上）；Kuzmichev等.（同上））证明，ESC-E(Z)/ EED-EZH2(即PRC2)复合物具有固有的组蛋白甲基转移酶活性。尽管由不同组分离的复合 物组成略有不同，其一般包括EED、EZH2、SUZ12和RbAp48或其果蝇（Drosophila)同源物。 然而，仅包括EED、EZH2和SUZ12的重建复合物保留对组蛋白H3第27位赖氨酸的组蛋白甲 基转移酶活性。美国专利7, 563, 589 (通过引用纳入本文）。
[0011] 在构成PRC2复合物的各种蛋白中，EZH2(Zeste增强子同源物2)是催化亚基。EZH2 的催化位点进而存在于SET结构域，所述SET结构域是在若干染色质相关蛋白质（包括三 胸组和多梳组的成员）中发现的高度保守序列基序（以Su(var) 3 - 9命名，Zeste增强子， 三胸）。SET结构域是除H3-K79甲基转移酶D0T1以外所有已知组蛋白赖氨酸甲基转移酶 的特征。
[0012] 除Hox基因沉默以外，显示PRC-2介导的组蛋白H3-K27甲基化还参与X灭活。 Plath等.（2003)Science300:131-5;Silva等.（2003)DevCell4:481-95?募集PRC2 复 合物至Xi以及随后组蛋白H3-K27上的三甲基化发生在X灭活的起始阶段，并且依赖Xist RNA。此外，发现EZH2和其相关组蛋白H3-K27甲基转移酶活性区别标记多能外胚层细胞和 分化的滋养外胚层。Erhardt等.（2003)Development130:4235-48)。
[0013] 与EZH2维持多能外胚层细胞的表观遗传修饰模式的作用一致，Cre介导的EZH2去 除引起细胞中组蛋白H3-K27甲基化的缺失。Erhardt等.（同上）。此外，前列腺和乳癌细胞 系和组织的研宄显示EZH2和SUZ12水平与这些癌症的侵袭性之间的强烈相关性（Bracken 等? （2003)EMB0J22:5323-35;Kirmizis等? （2003)M〇1CancerTher2:113-21; Kleer等?（2003)ProcNatlAcadSciUSA100:11606-11;Varambally等?（2002)Nature 419:624-9)，指示RRC2复合物的功能障碍可能引起癌症。
[0014] 近期，报道EZH2的体细胞突变与滤泡性淋巴瘤（FL)和弥散性大B细胞淋巴瘤 (DLBCL)的生发中心B细胞样（GCB)亚型相关。Morin等.（2010)NatGenet42:181-5。在 所有情况中，发现突变EZH2基因的出现是杂合的，并且通过转录组测序在所述突变样品中 检测到野生型和突变等位基因的表达。目前，关于治疗大多数DLBCL的治疗标准是R-CH0P 方法。然而，该方法的结果远不能令人满意。因此，医疗上急需鉴定新型且有效的治疗方法， 其任选地视对象的遗传概况而定。
【发明内容】
[0015] 本发明基于如下发现：表达某些EZH2突变型的细胞比表达野生型EZH2的细胞对 EZH2抑制剂更具响应性。
[0016] 本发明涉及一种治疗或减轻对象的癌或癌前病症症状的方法，向表达突变型 EZH2(该突变型EZH2包含SEQIDNO:6所示的底物口袋结构域（substratepocket domain)中的突变）的对象给予治疗有效量的EZH2抑制剂。
[0017] 本发明还涉及一种测定患有癌症或癌前病症的对象对EZH2抑制剂的响应性的方 法（或体外方法），该方法通过如下方式进行：提供来自该对象的样品；和检测SEQIDN0:6 所示的EZH2底物口袋结构域中的突变；而所述突变的存在指示该对象响应所述EZH2抑制 剂。
[0018] 本发明还提供治疗有效量的EZH2抑制剂在制备治疗或减轻对象中癌症或癌前病 症的症状的药物中的应用，所述对象表达包含SEQIDN0:6中定义的底物口袋结构域中突 变的突变型EZH2。
[0019] 本发明的突变型EZH2是突变型EZH2多肽或编码突变型EZH2多肽的核酸序 列。优选地，所述突变型EZH2包含在SEQIDN0:1的氨基酸第677、687、674、685或641 位的突变。更优选地，突变选自下组：甘氨酸（G)取代SEQIDNO: 1的氨基酸第677位 的野生型残基丙氨酸（A) (A677G);缬氨酸（V)取代SEQIDN0:1的氨基酸第687位的野 生型残基丙氨酸（A) (A687V);甲硫氨酸（M)取代SEQIDN0:1的氨基酸第674位的野生 型残基缬氨酸（V) (V674M);组氨酸⑶取代SEQIDNO: 1的氨基酸第685位的野生型残 基精氨酸（R) (R685H);半胱氨酸（C)取代SEQIDN0:1的氨基