一种治疗骨性关节炎的组合物、其制备方法及其应用
【技术领域】
[0001] 本发明涉及一种组合物、其制备方法及其应用。
【背景技术】
[0002] 骨性关节炎（Osteoarthritis，OA)是一种老年人常见、多发性、退行性疾病，其典 型病理特征为关节软骨破坏、软骨下骨结构改变以及骨赘发生等。目前我国60岁以上老人 中，就有55%的人患有骨性关节炎，患病率随年龄的增加逐年上升趋势。随着中国逐渐进 入老龄化社会，以及中国人平均寿命的延长，现约有1. 2亿人正在经受着骨性关节炎的折 磨。由于局部血供不良以及自身骨髓干细胞病变，通常骨性关节炎患者的自身再生修复能 力有限，如不靠治疗干预，无法实现关节的修复和功能的恢复。药物治疗和手术也只能一定 程度缓解病情，不能起到再生修复的功能，大部分患者到晚期都不可避免的要手术行人工 关节置换。近年来，以间充质干细胞（Mesenchymal stem cells，MSCs)为基础的再生医学 (Regenerative Medicine)手段成为研宄治疗骨性关节炎热点，其应用前景非常广阔。
[0003] MSCs是一类具有自我更新、增殖和多向分化潜能的干细胞，体外贴壁呈成纤维样 细胞，可以分化为骨、软骨和脂肪细胞，可以分泌大量具有免疫调节、造血支持、促进血管 生成、趋化组织损伤修复等生物活性的细胞因子和生长因子。因此MSCs是组织工程化骨 和软骨构建中重要的种子细胞。然而试验研宄表明，多数情况下，由于体内情况的改变， MSCs在体内的存活和分化能力有限，MSCs注射后一周在体内的存活率非常低（Toma et al.,2002,Circulation 105:93 - 98. Human mesenchymal stem cells differentiate to a cardiomyocyte phenotype in the adult murine heart. Volker et al. , 2010. Nephron Exp Nephrol 2010 ；114:el07-ell6. Poor Cell Survival Limits the Beneficial Impact of Mesenchymal Stem Cell Transplantation on Acute Kidney Injury.)，低的存活率可 能有多种原因，但是缺乏血运、无血液中营养因子是其中主要的原因之一。如果植入的细胞 没有达到预期的存活目的，则其未来的定植和分化就无从谈起。
[0004] 文献中采用的提高间充质干细胞体内存活率的方法有体外调节细胞培养状态和 基因工程化细胞两种。采用基因工程改造的细胞如转入抗凋亡基因 Bcl-2,虽然可以使 得细胞的生存率提高到原来的1. 2倍，但是由于基因改造的风险和滞后性，无法自自体间 充质细胞治疗中世纪采用。而体外细胞培养状态的调节是在细胞体外培养过程中，调节 细胞生长环境，以期在细胞移植后可以有更强的存活能力，比如在培养大鼠 MSCs时增加 Stromal-derived factor lalpha (SDF-lalpha)，在培养 MSCs 加入 Lipopolysaccharides， 采用无氧24-36小时培养MSCs等均可一定程度上提高骨髓MSCs的存活率。但所有这些方 法都是细胞体在外条件下进行，而且输入的时候，细胞的悬浮液没有经过脱氧处理，当细胞 注射入体内后，由于复杂的炎症、营养环境，会改变细胞的生理状态而无法完全实现体外获 得的实验结果。
【发明内容】
[0005] 本发明提供一种治疗骨性关节炎的组合物、其制备方法及其应用。
[0006] 本发明治疗骨性关节炎的组合物的有效成分包括间充质干细胞和细胞因子，所述 组合物中间充质干细胞的浓度为5 X IO5?5 X 10 7个/mL，所述细胞因子由富含FGF2的血 浆和富含VEGF的血浆按体积比1:3?10制成。
[0007] 上述治疗骨性关节炎的组合物的制备方法，按以下步骤进行：
[0008] 一、富血小板血浆制备：
[0009] 将20?120mL外周血分装在50mL离心管中，于200?400g、4°C条件下离心10? 30min，去掉下层红细胞，保留上层血小板血浆，混匀后，于500?IOOOg条件下二次离心 10?30min，去掉部分上层血衆，将剩余血衆和下层血小板混合均勾，从而得到富集2?7 倍的富血小板血浆；
[0010] 二、富FGF2因子血浆制备：
[0011] 在步骤一制备的富血小板血浆中无菌添加120?150IU/mL人凝血酶和12? 15mg/mL CaCl2，在20?37°C恒温培养箱中培养1?6小时，将上述培养物经800?1500g、 4°C离心10?30min，其上清液即为FGF2浓度在40?80pg/mL的富FGF2因子血浆；
[0012] 三、富VEGF因子血浆制备：
[0013] 在步骤一制备的富血小板血衆中无菌添加10?30IU/mL人凝血酶和1?3mg/mL CaCl 2，在20?37°C恒温培养箱中培养中72?144小时，将上述培养物经800?1500g、4°C 离心10?30min，其上清液即为VEGF浓度在150?350pg/mL的富VEGF因子血浆；
[0014] 四、将富FGF2因子血浆和富VEGF因子血浆按体积比1:3?10的比例混合，将混 合后的血浆在25?60mmHg氧分压下，37°C平衡4?8小时，然后向平衡后的混合血浆中加 入间充质干细胞，混合血浆中间充质干细胞的浓度为5X IO5?5X 10 7个/mL，即得到治疗 骨性关节炎的组合物。
[0015] 上述组合物用于治疗骨性关节炎。
[0016] 上述治疗骨性关节炎的组合物在制备治疗骨性关节炎药物的应用。
[0017] 本发明的有益效果：
[0018] 1、本发明突出的特点就是间充质干细胞和细胞生长因子相结合，间充质干细胞在 25-60mmHg氧分压环境培养，细胞因子也在相同的氧分压中平衡。本发明适用于哺乳动物治 疗方法，如人，或者宠物马、狗、猫的骨性关节炎治疗，适合月运动损伤性关节炎，或者退行 性关节炎治疗，关节可以是各种大、小关节。
[0019] 2、细胞因子的获得方法简单和应用方便
[0020] 本发明组合物中的细胞因子获取方法采用的是将血小板α颗粒激活后释放获得 的富FGF2和VEGF细胞因子，比起采用人重组FGF2、人重组VEGF配制的方法成本低廉、制作 工艺简单。此富细胞因子的血浆可以在干细胞培养的同时开始制备，在移植之前与干细胞 进行混合处理，方便使用。
[0021] 3、本组合物中的间充质干细胞可以快速适应关节环境并实现表面附着。本发明不 仅将对间充质干细胞进行低氧驯化处理，而且也事先将富细胞因子血浆在低氧状态下预先 平衡4-8小时，使得间充质干细胞在组合物中维持了其驯化后的状态，组合物移植后，其中 的间充质干细胞更快地适应了骨性关节炎的缺氧的关节环境，并且加快了在缺氧环境中的 贴壁速度。
[0022] 4、本组合物可以促进间充质干细胞在骨性关节炎微环境中存活。本组合物应用 后，达到提高了间充质干细胞在骨性关节炎环境中的生存时间。干细胞活性是其起作用的 最基本要求，如果干细胞在关节腔内存活时间越长，其起到的对骨性关节炎的治疗作用越 显著。
[0023] 5、本组合物可以促进间充质干细胞在骨性关节炎微环境中集落形成数量，从而实 现干细胞在炎症环境下可以顺利定植、成活、扩增，确保了骨性关节炎的修复。
[0024] 6、本组合物中间充质干细胞可以顺利分化成软骨组织，有利于干细胞对骨性关节 炎造成的软骨损伤的修复作用。
【附图说明】
[0025] 图1为不同组别组合物中干细胞贴壁率；图2为第一组和第二组的细胞活率对比； 图3为细胞培养过程中细胞形态图；图4为细胞培养第14天Alcian蓝染色结果；图5为第 一组和第二组克隆形成能力对比图；图6为第一组和第二组集落对比图；图7为损伤对照 组动物切片；图8为修复组动物切片。
【具体实施方式】
[0026] 本发明技术方案不局限于以下所列举【具体实施方式】，还包括各【具体实施方式】间的 任意组合。
【具体实施方式】 [0027] 一：本实施方式治疗骨性关节炎的组合物的有效成分包括间充质干 细胞和细胞因子，所述组合物中间充质干细胞的浓度为5 X IO5?5 X 10 7个/mL，所述细胞 因子由富含FGF2的血浆和富含VEGF的血浆按体积比1:3?10制成。
[0028] 所述间充质干细胞可以为骨髓间充质干细胞、脂肪间充质干细胞，脐带间充质干 细胞、脐带血间充质干细胞，羊膜间充质干细胞，胎盘间充质干细胞，或宫内膜来源的间充 质干细胞。
[0029] 富细胞因子血浆可以调节关节炎性微环境、减少疼痛的同时，还提供了共移植 的间充质干细胞的生存的营养，促进其在体内有效定植和生存，延长干细胞在体内的再 生、微环境调节作用。在组合物制备过程中，采用了与人类关节内氧分压相似的供氧环境 25-60mmHg，促进了干细胞的适应能力，从而起到更好的骨性关节炎的修复作用。
【具体实施方式】 [0030] 二：本实施方式与一不同的是：所述富含FGF2的血浆 中FGF2浓度为40?80pg/mL。其它与一相同。
【具体实施方式】 [0031] 三：本实施方式与一或二不同的是：所述富含VEGF的 血浆中VEGF浓度为150?350pg/mL。其它与一或二相同。
【具体实施方式】 [0032] 四：本实施方式与一至三之一不同的是：所述组合物 中间充质干细胞的浓度为IX IO7个/