真空60min，以去除水和气。然后充氮气，继续升温至290°C，并维持2.5h，回流Ih后冷却至室温，加入无水乙醇，离心，用乙醇洗3遍。所得黄色沉淀重新溶于正己烷，将OA-Gd2O3溶解在正己烷中保存。
[0059]2) TETT-Gd2O3 的制备:
[0060]采用配体交换法将10mg OA-Gd2O3纳米粒和60 μ L醋酸加入到60mL甲苯中，超声30分钟。然后加入上述溶液中1.2mL TETT，在70°C的温度条件下搅拌48小时后，纳米粒就沉淀下来。TETT-Gd2O3收集起来，经过甲苯和甲醇连续3次冲洗。然后溶解在水中，装于分子量为1000的透析袋中放于去离子水中透析24小时，冻干后就得到了 TETT-Gd2O3粉末。将10mg OA-Gd2O3纳米粒和60 μ L醋酸加入到60mL甲苯中，超声30分钟。然后加入上述溶液中1.2mL TETT，在70°C的温度条件下搅拌48小时后，纳米粒就沉淀下来。TETT-Gd2O3收集起来，经过甲苯和甲醇连续3次冲洗。然后溶解在水中，装于分子量为1000的透析袋中放于去离子水中透析24小时，冻干后就得到了 TETT-Gd2O3粉末。
[0061 ] 3 ) PEG-TETT-Gd2O3 的制备:
[0062]在1mL去离子水中加入10mg TETT-Gd2O3固体粉末，加入29mgNHS和23mg EDC进行激活。然后在上述溶液中加入500mgNH2-PEG-C00H，并且将PH值提高到8.0，在室温下将其搅拌24小时后。过量的化合物置于分子量为3500的透析袋中在去离子水中透析24小时，经过透析后冻干就得到了 PEG-TETT-Gd2O3固体粉末。
[0063]4) CTX-PEG-TETT-Gd2O3 的制备:
[0064]将10mg PEG-TETT-Gd2O3固体粉末加入到1mL去离子水中然后加入0.22mg NHS和0.14mg EDS激活0.5小时。然后将4mg CTX加入到上述溶液中并将PH值调节到8.0反应过后，在室温条件下搅拌24个小时，产物就会在溶液中悬浮，透析后就可得到化合物。冻干后就得到了 CTX-PEG-TETT-Gd2O3固体粉末。
[0065]本发明的Gd2O3纳米粒的高分辨透射电镜(HRTEM)、透射电镜(TEM)和傅里叶红外(FTIR)表征见图1和图2。
[0066]从图1中可以看出，OA-Gd2O3纳米粒的晶型良好晶格结构明显，TETT-Gd2O3、TETT-Gd2O3^ CTX-PEG-TETT-Gd2O3这三种纳米粒水分散性良好，随着配体的增加，粒径略有增大。
[0067]从2图中可以看出，S1-O-Si键(1102CHT1)和N-C键(919CHT1)的出现表明了硅烷羧酸成功键和到Gd2O3纳米粒的表面。C=O键(1626，1424cm—1)和C-O-C键(llllcm—1)的出现说明了 PEG成功键合到TETT-Gd2O3上。羰基键由1626到了 1635CHT1，且范围变宽说明CTX键合到了 PEG-TETT-Gd2O3。
[0068]实施例2
[0069]DTPA, TETT-Gd2O3^ PEG-TETT-Gd2O3 和 CTX-PEG-TETT-Gd2O3 弛豫率的测定实验:
[0070]称取一定量DTPA、TETT-Gd2O3^ PEG-TETT-Gd2O3 和 CTX-PEG-TETT-Gd2O3 的纳米粒，溶于1%的琼脂糖凝胶，分别配制成浓度为0.2,0.1,0.05,0.025,0.0125,0毫摩尔(Gd)/升的溶液。使用7T核磁共振仪，选定RARE-TJT2-Hiap序列，各项参数设置如下:
[0071]TR=1500ms, TE = I Ims、33ms、55ms、77ms、99ms, matrix size = 256 X 256，F0V=4.0 X 4.0cm2, flip angle (FA) =180。及 slice thickness=lmm,对所配溶液进行 T1 加权成像扫描，将所得横向弛豫时间(T1)的倒数与浓度进行线性拟合，所得斜率即为弛豫率。其拟合曲线及化合物成像见图3。
[0072]实施例3
[0073]细胞实验:
[0074]I)细胞培养实验:C6胶质瘤细胞采用DMEM培养基(含10%胎牛血清，100U/mL青霉素，100U/mL链霉素)，在37°C含有5%C02的保湿培养箱中培养24小时。
[0075]2)细胞毒性实验:首先将C6胶质瘤细胞以I X 15的细胞密度接种于96孔板孵育24 小时。而后将 TETT-Gd203、PEG-TETT-Gd2O3、CTX-PEG-TETT-Gd2O3 弛豫率的测定实验:用培养基配制成浓度为O、1、2.5和5μ g/mLGd的溶液，分别向96孔板不同孔内加入含纳米粒的培养基，共同孵育，24小时后，弃掉含纳米粒的培养基，用PBS洗两次，加入MTT (100 μ 1，
0.5mg/mL)孵育4小时，弃掉MTT，加入150 μ L DMSO,避光震荡5分钟，用酶标仪测定490nm波长下每孔的OD值。不同浓度下的细胞存活率见图4。
[0076]从图4中可以看出，即使在高达5μ g HiL-1Gd的浓度下孵育24小时后仍然具有很低的细胞杀伤力，表明此纳米粒具有良好的生物相容性。
[0077]实施例4
[0078]动物实验:
[0079]I)磁共振成像实验:选取ICR小鼠(20g)，以6%水合氯醛0.lml/20g，腹腔注射麻醉。使用7T核磁共振仪，选定TurboRARE-T1序列，各项参数设置如下:TR=250.0ms，TE=1.0ms, matrix size=256X256, field of view=3.0X3.0cm2, flip angle=180 ° ,slice thickness=lmm及number of averages=10,对小鼠脑部进行T1加权成像扫描。将PEG-TETT-Gd2O3>CTX-PEG-TETT-Gd2O3纳米粒通过尾静脉以4.8mg/kgGd的剂量注入小鼠内，分别在注射15分钟、60分钟及24小时后，以同样序列对小鼠进行MRI扫描。所得T1加权图像见图5。
[0080]从图5中可以看出，相较于PEG-TETT-Gd2O3,具有靶向作用的纳米粒CTX-PEG-TETT-Gd2O3具有明显的MRI造影增强效果，且能够持续24小时。
[0081]2)取脏器组织及后固定:选取ICR小鼠(20g)，将TETT_Gd203、PEG-TETT-Gd2O3和CTX-PEG-TETT-Gd2O3纳米粒通过尾静脉以7.2mg/kgGd的剂量注入小鼠内，21天后，以6%水合氯醛0.lmL/20g腹腔注射麻醉，仰卧固定，沿胸廓下沿打开胸腔，将灌注针由左心室插入总动脉，固定灌注针，在心尖处用眼科剪剪一小开口，打开灌注泵，以30mL/min灌注生理盐水，同时按摩肝脏，待肝脏发白后，以5mL/min的速度灌注多聚甲醛溶液直至各组织发硬为止(约30分钟)，取出肝脏、脾、肺、肾内脏置于多聚甲醛中过夜，弃去多聚甲醛，换30%的蔗糖溶液后固定至组织沉于瓶底。
[0082]3)组织冰冻切片:将组织从蔗糖溶液中取出，蒸馏水洗净，用包埋剂OCT包埋组织，置于-80°C冰箱冷冻成块后取出，进行冰冻切片，切片厚度为5 μ m,展于载玻片上。
[0083]4)切片组织的HE染色:将组织切片入蒸馏水后，放入Harris苏木精染液中染色15min,自来水冲洗20min返蓝,后置于盐酸酒精分色液中10秒进行分色，自来水冲洗5min后如蒸馏水，然后置于1%伊红染色10秒，自来水冲去浮色，依次入70%、95%和100%酒精上行脱水Imin后置入二甲苯中透明2min，以中性树胶封片。
[0084]分析:于倒置显微镜下观察各脏器组织切片，见图6。
[0085]从图6中可以看出Gd2O3纳米粒不具有明显的组织毒性，表明其生物相容性良好。
【主权项】
1.一种具有胶质瘤靶向性的Gd2O3纳米粒，是以Gd2O3为内核，表面修饰有硅烷化试齐U，并加入聚乙二醇，然后键合氯毒素，得到具有胶质瘤靶向性的Gd2O3纳米粒，表达式为:CTX-PEG-TETT-Gd2O3Nps ； 表达式中: CTX为氯毒素； PEG为聚乙二醇； TETT为硅烷羧酸； Gd2O3NPs为三氧化二钆纳米粒。
2.如权利要求1所述的Gd2O3纳米粒，其中，硅烷化试剂为硅烷羧酸、硅烷氨基、硅烷巯基或硅烷。
3.制备权利要求1所述Gd2O3纳米粒的方法，其步骤为: 1)将油酸、油胺和油酸钆溶于二甲苯醚中，在氮气保护下搅拌升温至80?120°C，抽真空，充氮气继续升温至270?320°C，并保持一段时间，回流后冷却至室温，加入无水乙醇，离心，将所得的产物沉淀重新溶于并保存在正己烷中，产物定义为OA-Gd2O3 ； 上述各试剂的比例为:油酸I?2g，油胺I?2g,油酸礼1.5?2.5mmol, 二甲苯醚15?25mL ； 2)将步骤I的产物OA-Gd2O3和醋酸加入到甲苯中溶解，加入硅烷化试剂，加热至60-70V搅拌，收集沉淀物并溶解在水中，于去离子水中透析，冻干得到粉末，粉末定义为TETT-Gd2O3 粉末； 上述各试剂的比例为:0A-Gd20380?120mg，醋酸50?70 μ L，甲苯50?70mL，硅烷化试剂I?1.5mL ； 3)在去离子水中加入步骤2的TETT-Gd2O3粉末，加入N-羟基琥珀酰亚胺和1-乙基-3-(3- 二甲基氨丙基)-碳二亚胺进行激活；并在上述溶液中加入NH2-PEG-C00H，调整PH值为7.5-8.5，室温下搅拌，将沉淀物在去离子水中透析去除过量的反应物，冻干得到固体粉末，固体粉末定义为PEG-TETT-Gd2O3粉末； 上述各试剂的比例为:去离子水8?12mL，TETT-Gd2O3粉末80?120mg，N-羟基琥珀酰亚胺26?32mg, 1-乙基-3-(3- 二甲基氨丙基)-碳二亚胺21?25mg ； 4)将步骤3的PEG-TETT-Gd2O3纳米粒加入到去离子水中，加入N-羟基琥珀酰亚胺和1-乙基-3-(3-二甲基氨丙基)-碳二亚胺进行激活，将氯毒素加入到上述溶液中并调整PH值为7.5-8.5，室温下搅拌，将得到的悬浮液进行透析，得到的化合物冻干后为最终产物CTX-PEG-TETT-Gd2O3 固体粉末； 上述各试剂的比例为=PEG-TETT-Gd2O3粉末80?120mg，去离子水8?12mL，N-羟基琥拍酰亚胺0.2?0.25mg, 1-乙基-3-(3- 二甲基氨丙基)-碳二亚胺0.12?0.16mg,氯毒素2?6mg。
4.根据权利要求3所述的方法，其中，透析是装于透析袋中放于去离子水中透析。
5.根据权利要求3所述的方法，其中，步骤I中的产物沉淀是经乙醇清洗后重新溶于并保存在正己烧中。
6.根据权利要求3所述的方法，其中，步骤2中是将OA-Gd2O3纳米粒和醋酸加入到甲苯中经过超声溶解。
7.权利要求1所述的Gd2O3纳米粒在作为脑胶质瘤特异性磁共振造影剂中的应用。
【专利摘要】一种具有胶质瘤靶向性的Gd2O3纳米粒，是以Gd2O3为内核，表面修饰有硅烷化试剂，并加入聚乙二醇，然后键合氯毒素，得到具有胶质瘤靶向性的Gd2O3纳米粒，表达式为：CTX-PEG-TETT-Gd2O3Nps。本发明还公开了制备上述Gd2O3纳米粒的方法。
【IPC分类】A61K49-14
【公开号】CN104548147
【申请号】CN201310478554
【发明人】闫长祥, 宋光荣, 叶玲, 顾微, 李帅, 邓云龙, 韩松
【申请人】北京三博脑科医院有限公司
【公开日】2015年4月29日
【申请日】2013年10月14日