灭活钩端螺旋体细菌的免疫原性组合物的制作方法
【专利说明】灭活钩端螺旋体细菌的免疫原性组合物 发明领域
[0001] 本发明涉及一种组合物，其包含灭活钩端螺旋体化eptospira)细菌的免疫原性 细胞制剂，保护动物预防钩端螺旋体细菌感染的疫苗，W及巧樣酸用于稳定灭活钩端螺旋 体细菌的免疫原性制剂的用途。 技术背景
[0002] 钩端螺旋体病是由钩端螺旋体的许多致病血清变型中的任一种感染引起的世界 范围的人畜共患病。所述生物的属是极其易变的，并且包含超过250个血清变型。单个致 病性血清变型的发病率因不同地区而异，可能受如气候、当地动物群和农业实践等因素的 影响。钩端螺旋体病实际上影响到所有的哺乳动物物种。人类钩端螺旋体病也很重要，并 且在热带地方性发生，并且是温带气候中的流行病。然而，与其他物种不同，人类实质上对 于疾病的维持并不重要，并且人对人的传播很罕见。
[0003] 预防钩端螺旋体病的人疫苗接种是研究团体的目标，但是进展一直非常缓慢。鉴 于犬钩端螺旋体病是一种重要的疾病，并且犬是钩端螺旋体病的来源，预防该犬疾病的许 多疫苗是可得的。商业的犬钩端螺旋体病疫苗传统上包含犬（Canicola)血清组和黄痘 出血性（Ictero)血清组的灭活抗原，并且已面市超过五十年。欧洲最近的建议是继续在 疫苗中包含Canicola和Ictero血清组的抗原，附加包含流感伤寒（Gri卵0)血清组和澳 大利亚（Australis)血清组的抗原。而在美国，目前可获得具有四种血清组（Canicola、 ictero、Grippo和化mona)的抗原的四种犬疫苗；在欧洲，目前可获得多种传统二价疫苗 (Canicola、Ictero)和仅一种H价疫苗（Canicola、Ictero 和 Grippo)。
[0004] 即使不是全部如此，大多数可商购的钩端螺旋体病疫苗包括灭活钩端螺旋体细菌 的免疫原性细胞制剂，例如福尔马林灭活的全细胞。已知该些疫苗在远低于室温的胆存温 度，通常在2C至8C之间，非常稳定。然而，特别是考虑到一个事实，即钩体螺旋体病是热 带的地方病，在高于室温的温度下具有疫苗稳定性将是一个重要的优点，因为该将允许在 环境条件下胆存，而不需要任何冷却设备。在过去，因为存在于该类灭活的全细胞疫苗中的 任何蛋白可能是钩端螺旋体抗原不稳定的原因，已经测试了将该些蛋白变性（例如通过施 加不影响钩端螺旋体抗原的热激处理）是否会导致稳定性的显著改善。然而，结果是阴性 的。
[0005] 发明目的
[0006] 需要显著提高包含灭活钩端螺旋体细菌的免疫原性细胞制剂的组合物的稳定性， 特别是获得一种组合物，其即使是在高于室温的温度下胆存至少3个月后，仍然有效引起 免疫应答。特别地，需要一种钩端螺旋体病疫苗，即使在将所述疫苗在37C下胆存3个月 后，特别是在该温度下胆存9个月后，其仍然有效，至少帮助防止钩端螺旋体细菌感染。
[0007] 发明概述
[0008] 为了满足本发明的目的，已根据前文设计了一种组合物，其中所述灭活钩端螺旋 体细菌的免疫原性细胞制剂存在于巧樣酸溶液中（其中术语"酸"包括所述酸的共辆碱）。 已经证明，通过使所述抗原存在于该溶液中，所述抗原的稳定性显著提高。在37 C下胆存至 少3个月的根据本发明的疫苗，保留了足W提供预防钩端螺旋体细菌感染的近乎完全保护 的抗原质量水平。
[000引定义
[0010] 本发明意义上的疫苗是一种适合应用于动物（包括人类）的构成，包括一种或多 种抗原，通常与药学上可接受的载体组合，例如含有水的液体，任选包含免疫刺激剂（佐 剂）、盐、缓冲剂、防腐剂、粘度调节剂等，其在施用于动物后诱导免疫应答，用于治疗疾病或 病症，即帮助预防、改善或治疗疾病或病症。
[0011] 载体是用于携载抗原W使其能够W实用形式存在的工具。典型的载体是水或其它 亲水性液体，但也常使用固体颗粒（例如用于通过干粉雾化器施用的抗原）。
[0012] 灭活细菌的细胞制剂是实质上含有灭活细菌细胞的制剂，任选地被进一步处理 (其可包括至少部分裂解细胞），例如W获得更稳定的或免疫原性更高的制剂。细胞制剂与 包含细菌细胞的提取物（例如提取的表面蛋白和/或多糖）的制剂是相对的。
[0013] 本发明的【具体实施方式】
[0014] 在一个【具体实施方式】中，所述溶液每升包含20mmol的巧樣酸。
[0015] 在另一个【具体实施方式】中，所述溶液被缓冲在5至6之间的抑。
[0016] 在另一个【具体实施方式】中，所述钩端螺旋体细菌选自问号钩端螺旋体犬血清 组 Portland-Vere 血清变型(Leptospira interrogans serogroup Canicola serovar Portland-Vere)、问号钩端螺旋体澳大利亚血清组布拉迪斯拉发血清变型（L巧tospira interrogans serogroup Australis serovar E5ratislava)、问号钩端螺旋体黄痘出血性 血清组哥本哈根血清变型（Leptospira interrogans serogroup Icterohaemorrhagiae serovar Copenhageni)和科氏钩端螺旋体流感伤寒血清组Dadas血清变型（Leptospira kirschneri serogroup Grippoty地osa serovar Dadas),特别地，所述钩端螺旋体细菌是 问号钩端螺旋体澳大利亚血清组布拉迪斯拉发血清变型。
[0017] 通过将巧樣酸溶解于载体，使巧樣酸用于稳定液体载体中的灭活钩端螺旋体细菌 的免疫原性制剂的用途，特别具体体现下述用途中，其中所述制剂在高于18C，特别是在 37C下的3个月胆存期间，保留至少25%的其抗原质量化ISA单位计，与在2-8C的温 度下胆存的相同制剂相比时）。 实施例
[0018] 现将基于下列的实施例进一步解释说明本发明。
[0019] 实施例1 ;测定存在于可商购的疫苗中的灭活钩端螺旋体抗原在犬中的效力。
[0020] 实施例2 ;测定钩端螺旋体抗原在37C胆存时的稳定性。
[0021] 实施例3 ;测定配制在巧樣酸中的钩端螺旋体抗原在37C胆存时的稳定性。
[0022] 实施例1
[0023] 在该第一个实施例中，测定了存在于可商购的疫苗中的灭活钩端螺旋体抗原在常 规犬中的效力，所述抗原根据疫苗的标签配制（100 % )，或者稀释4倍（25 % )。将存在于可 商购的疫苗Nobivac L4(可得自于MSD Animal Health, Boxmeer,荷兰；另参见欧洲药品管 理局在2012年5月21日出版的关于Nobivac L4的CVMP意见概要）中的确定浓度的化学灭 活的相同类型和血清变型的钩端螺旋体细菌，即问号钩端螺旋体犬血清组化dland-Vere 血清变型（犬钩端螺旋体（Leptospira canicola) ;5300ELISA单位/ml)、问号钩端螺 旋体澳大利亚血清组布拉迪斯拉发血清变型（布拉迪斯拉发钩端螺旋体（Leptospira Bratislava) ;1000ELISA单位/ml)、问号钩端螺旋体黄痘出血性血清组哥本哈根血清变 型（黄痘出血性钩端螺旋体（X巧tospira icterohaemorrhagiae) ;540ELISA 单位/ml) 和科氏钩端螺旋体流感伤寒血清组化das血清变型（流感伤寒钩端螺旋体（L巧tospira grippothyphosa) ;1000E：LISA单位/ml)配制在lOmM抑为7. 2的PBS缓冲液（该缓冲液 每升水中含有8. 9g化C1、0. 2g KCl、1.44g化2册〇4和0. 2g KH2PO4)中。将最终的制剂充入 3ml小瓶中，用橡胶塞加盖并用铅卷边盖密封。该疫苗在2-8C胆存（稳定长达39个月）。 在该疫苗后，通过将抗原在相同的PBS缓冲液中稀释，达到包含25 %的化ISA单位/血量的 终浓度，从而制备稀释的疫苗。按如下对所述疫苗进行测试。
[0024] 连輪动物的饲养
[00巧]由商业供应商提供六周龄的常规比格犬，其没有可检测到的针对本文上述各钩端 螺旋体血清组的凝集血清抗体。在每个研究中，治疗组（n = 8)由两种性别的幼犬和来自 不同窝的幼犬组成，W防止干扰治疗效果的性别和窝效应。选定的犬在入选到该