一种利用难溶或不溶蛋白、多肽抗原制备纳米微粒疫苗的方法_2

文档序号:8272357阅读:来源:国知局
[0047] 所述种子菌为猪圆环病毒2型Cap蛋白的重组大肠杆菌(PCV2Cap_pET21/ Rosetta,第5代生产种子),代号为PCPl 1SU15 ;将收集到的沉淀物重悬于100倍体积(W : V)的的TNE-U缓冲液中,在超声破碎仪中在200w的功率下冰浴超声15min,使沉淀物均匀 分散;接着加入等体积的体积为培养基体积1/100的TNE-U缓冲液,然后在温度为4°C的 层析柜中振荡30min ;接着离心收集沉淀,所述离心处理的相对离心力为7000xg、时间为 15min ;接着将收集到的沉淀重悬于体积为培养基体积1/100的TNE-T缓冲液中,超声破 碎仪中在200w的功率下冰浴超声15min,使沉淀物均匀分散;接着加入体积为培养基体积 1/100的TNE-T缓冲液,然后在温度为4°C的层析柜中振荡30min,得到抗原液;
[0048] 所述TNE-U缓冲液由如下方法制成:将Tris-Base、NaCl、Urea和蒸馏水混合,然 后经过0. 45 μπτ滤器过滤除菌处理,即得;其中Tris-Base的摩尔浓度为0. 5mol/L、NaCl的 摩尔浓度为〇. 25mol/L、Urea的摩尔浓度为2-4mol/L,所述TNE-U缓冲液的pH值为7. 4 ;
[0049] 所述TNE-T缓冲液由如下方法制成:取Triton X100、Tris-Base、NaCl和蒸馏水 混合,然后经过0. 45 μ m滤器过滤除菌处理,即得;其中Tris-Base的摩尔浓度为0. 5mol/ L、NaCl的摩尔浓度为0· 25mol/L、Triton XlOO的体积百分数为0· 1 %,所述TNE-T缓冲液 的pH值为7. 4。
[0050] 实施例2
[0051] 取少量由实施例1的d步骤得到的沉淀物悬液,应用SDS-PAGE分析沉淀中目的重 组抗原的纯度,具体测试结果详见附图1 ;取经过e步骤获得的第二穿出液,用8mol/L尿素 稀释4倍,37°C作用5分钟,作为待测样品;准确称取2. OOOg BSA干粉,用8mol/L尿素分别 稀释至不同 BSA 浓度的溶液:1000 μ g/ml、500 μ g/ml、250 μ g/ml、125 μ g/ml、62. 5 μ g/ml, 以该BSA溶液为标准液;在紫外分光光度计上读取待测样品和标准液在波长280的吸光度 (0D),应用各标准品浓度(yg/ml)和吸光度(OD)绘制标准曲线,计算待测样品的浓度。结 合SDS-PAGE蛋白浓度百分含量计算抗原重组抗原含量的计算,重组抗原含量=待测样品 浓度X稀释倍数X重组抗原的纯度。取经过f步骤获得的重组抗原,利用显微镜观察其 中的抗原颗粒,并用粒径分析仪精确测试颗粒的粒径分布,具体结果详见附图2,可以看出 制备的颗粒多为聚集状态,分散的抗原颗粒粒径在20-200nm。使用PBS调整重组抗原浓度 至彡300 yg/mL;按照佐剂乳化说明分别配制油包水型(W/0)、水包油包水型(W/0/W)和水 包油型(0/W)疫苗。
[0052] 将上述制得的3种不同剂型疫苗在转速为3000r/min的条件下离心5min,检测无 分层,然后分别在4°C、20°C和37°C条件下检查疫苗稳定性,结果稳定性均良好。对于在生 理溶液中不溶解的蛋白抗原,传统疫苗工艺需要对蛋白进行层析、变性、复性、透析等处理, 本发明的方法大大简化利用此类抗原进行疫苗的生产工艺。
[0053] 效果检测
[0054] 1.安全评价
[0055] 分别用非靶动物和靶动物对本实施例中制得的3种疫苗(即油包水型(W/0)、水包 油包水型(W/0/W)和水包油型(0/W)疫苗)进行安全性质评价。非靶动物安全性检测方法 为:选择用BALB/c小鼠10只,各皮下注射疫苗0. lmL,连续观察14日,均应健活。靶动物 安全性检测方法为:用14-21日龄PCV2血清抗体阴性健康仔猪5头,各深部肌肉注射疫苗 2mL,连续观察14日,接种猪均应无不良反应,且均健活。具体测试结果见表1 :
[0056] 表1猪圆环病毒2型亚单位疫苗安全检验
[0057]
【主权项】
1. 一种利用难溶或不溶蛋白、多肽抗原制备纳米微粒疫苗的方法,其特征在于依次包 括如下步骤: a. 取溶解于生理盐水或PBS缓冲液的抗原液,在相对离心力为7000-10000xg的条件下 离心处理15min,收集沉淀物; b. 将经过a步骤得到的沉淀物用100?150倍体积(W : V)的生理盐水或PBS重悬,接 着搅拌使沉淀物均匀分散;然后在相对离心力为7000-10000Xg的条件下离心处理15min, 收集沉淀物;将收集到的沉淀物用生理盐水或PBS重复洗涤3次; c. 将经过b步骤得到的沉淀物在相对离心力为7000-10000xg的条件下离心处理 15min,收集沉淀物; d. 接着将c步骤得到的沉淀物重悬于100?150倍体积(W : V)的生理盐水或PBS 中;接着,进行冰浴超声处理使沉淀物均匀分散,得到沉淀物悬液; e. 将d步骤获得的沉淀物悬液加入无菌的低温超高压均质机/低温纳米级微生物破碎 机的上样容器中,在2?8°C、600?800bar的压力下进行均质,收集第一穿出液;接着,将 第一穿出液在2?8°C、1000?1200bar的压力下进行制粒,重复两次,得到,收集第二穿出 液; f. 将e步骤收集到的第二穿出液用生理盐水或PBS调整浓度到彡300 μ g/mL ; g. 向经过f步骤处理得到的第二穿出液中加入佐剂,制得疫苗。
2. 根据权利要求1所述的利用难溶或不溶蛋白、多肽抗原制备纳米微粒疫苗的方法, 其特征在于:所述e步骤中的制粒工艺制得的微粒的平均粒径为20-200nm。
3. 根据权利要求1所述的利用难溶或不溶蛋白、多肽抗原制备纳米微粒疫苗的方法, 其特征在于所述a步骤中的抗原液通过如下方法获得:将培养基中的工程菌进行酶解或机 械裂解,离心,分别收集上清液和沉淀;将收集到的沉淀物重悬于100?150倍体积(W : V) 的的TNE-U缓冲液中,在超声破碎仪中在200w的功率下冰浴超声10-20min,使沉淀物均匀 分散;接着加入体积为培养基体积1/100的TNE-U缓冲液,然后在温度为4°C的层析柜中振 荡30min ;接着离心收集沉淀,所述离心处理的相对离心力为7000xg、时间为15min ;接着将 收集到的沉淀重悬于体积为培养基体积1/100的TNE-T缓冲液中,超声破碎仪中在200w的 功率下冰浴超声10-20min,使沉淀物均匀分散;接着加入体积为培养基体积1/100的TNE-T 缓冲液,然后在温度为4°C的层析柜中振荡30min,得到抗原液; 所述TNE-U缓冲液由如下方法制成:将Tris-Base、NaCl、Urea和蒸馏水混合,然后经 过0. 45 μ m滤器过滤除菌处理,即得;其中Tris-Base的摩尔浓度为0. 5mol/L、NaCl的摩尔 浓度为〇. 25mol/L、Urea的摩尔浓度为2-4mol/L,所述TNE-U缓冲液的pH值为7. 4 ; 所述TNE-T缓冲液由如下方法制成:取脱氧胆酸和Triton XlOO的一种,然后 与Tris-Base、NaCl和蒸馏水混合,然后经过0.45μπι滤器过滤除菌处理,即得;其中 Tris-Base的摩尔浓度为0· 5mol/L、NaCl的摩尔浓度为0· 25mol/L、TritonXlOO的体积百 分数为〇. 1-1 %、脱氧胆酸的质量百分数为5-10%,所述TNE-T缓冲液的pH值为7. 4。
4. 根据权利要求3所述的利用难溶或不溶蛋白、多肽抗原制备纳米微粒疫苗的方法, 其特征在于:所述蛋白抗原为在生理溶液中溶解度较低的纯化蛋白或重组表达后为包涵体 形式的蛋白;所述多肽抗原为人工合成、提纯后在生理溶液中难溶多肽或重组表达后不溶 解的多肽物。
5. 根据权利要求4所述的利用难溶或不溶蛋白、多肽抗原制备纳米微粒疫苗的方法, 其特征在于: 所述TNE-U缓冲液中Tris-Base的摩尔浓度为0· 5mol/L、NaCl的摩尔浓度为0· 25mol/ L、Urea的摩尔浓度为2mol/L,所述TNE-U缓冲液pH值为7. 4 ; 所述TNE-T缓冲液中Tris-Base的摩尔浓度为0· 5mol/L、NaCl的摩尔浓度为0· 25mol/ UTriton XlOO的体积百分数为0. 1-1%、脱氧胆酸的质量百分数为5-10%,所述TNE-T缓 冲液pH值为7. 4。
6. 根据权利要求4所述的利用难溶或不溶蛋白、多肽抗原制备纳米微粒疫苗的方法, 其特征在于:所述a步骤中的相对离心力为lOOOOxg,离心时间为15min。
7. 根据权利要求4所述的利用难溶或不溶蛋白、多肽抗原制备纳米微粒疫苗的方法, 其特征在于所述b步骤具体为:将经过a步骤得到的沉淀物重悬于100?150倍(W : V) 沉淀物体积的生理盐水或PBS中,然后在7000r/min的转速下搅拌15min使沉淀物均匀分 散;在相对离心力为IOOOOxg的条件下离心处理15min,收集沉淀物;将收集到的沉淀物用 生理盐水或PBS重复洗涤3次。
8. 根据权利要求4所述的利用难溶或不溶蛋白、多肽抗原制备纳米微粒疫苗的方法, 其特征在于所述d步骤具体为:接着将c步骤得到的沉淀物重悬于100?150倍(W : V) 沉淀体积的生理盐水或PBS中;接着,进行冰浴超声处理使沉淀物均匀分散,得到沉淀物悬 液;其中,所述冰浴超声处理的功率为200w、时间为10-20min。
9. 根据权利要求4所述的,其特征在于所述e步骤具体为:将d步骤获得的沉淀物悬 液加入无菌的低温超高压均质机/低温纳米级微生物破碎机的上样容器中,在2?8°C、 800bar的压力下进行均质,收集第一穿出液;接着,将第一穿出液在2?8°C、1100bar的压 力下进行制粒,重复两次,得到,收集第二穿出液。
10. 根据权利要求4所述的利用难溶或不溶蛋白、多肽抗原制备纳米微粒疫苗的方法, 其特征在于:所述超声破碎仪中在200w的功率下冰浴超声lOmin。
【专利摘要】本发明涉及一种利用难溶或不溶蛋白、多肽抗原制备纳米微粒疫苗的方法,通过将难溶或不溶蛋白或多肽抗原进行离心收集、洗涤、均质、制粒等工艺处理,制得在常见生理溶液中较为稳定的抗原悬液。该方法大大简化了利用难溶或不溶蛋白或多肽进行疫苗制备的生产工艺,建立了一套利用难溶或不溶蛋白或多肽抗原直接进行疫苗制备的新方法,同时给出了应用该方法进行疫苗制备的佐剂可选范围;该工艺的应用可大幅减少利用难溶或不溶蛋白或多肽进行亚单位或多肽疫苗制备的生产环节、缩短生产时间,显著减低了疫苗生产成本。
【IPC分类】A61K9-107, A61K39-00
【公开号】CN104587457
【申请号】CN201510017280
【发明人】李中圣, 王贵平, 李其昌, 何永龙, 乔晶鑫
【申请人】广东海大畜牧兽医研究院有限公司
【公开日】2015年5月6日
【申请日】2015年1月13日
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