胞接种于培养瓶，置于37°C，饱和湿度，5% CO2培养箱中静止培养。2天 后，将未贴壁的细胞倒掉，PBS轻轻洗一遍，加入干细胞完全培养基，待细胞克隆长至80% 融合时，0. 05%胰酶消化传代至新培养瓶中。
[0048] 3、间充质干细胞（MSCs)流式检测细胞表面抗原
[0049] 选择P3代UC-MSCs及AD-MSCs，用0. 05%胰酶消化，PBS洗两遍后分别用小鼠抗 人 CDllb-PE、CD45-PE、HLA-DR-PE、CD73-PE、CD90-PE、CD105-PE、CD34-FITC 及 CD19-FITC 抗体标记5X IO5个MSCs，室温避光放置30min，再用PBS洗两遍后，4%多聚甲醛固定，FACS 检测。
[0050] 鉴定合格的细胞冻存于液氮罐中，用时复苏并传代至P5代，0.05%胰酶消化、离 心后用生理盐水重悬，计数，调整细胞浓度为5 X IO6Ail。
[0051] 三、实验动物分组治疗
[0052] I、db/db小鼠分组及治疗
[0053] 分组前测定小鼠空腹血糖及体重，选择血糖大于lOmmol/L且体重大于32g的小 鼠，按体重及血糖将小鼠平均分为3组，每组8只，另外选择8只同周龄正常C57BL/6J小鼠 作为正常对照：
[0054] (1)正常对照组（Normal):同周龄8只正常C57BL/6J小鼠，与L印rdb/dlVj、鼠同期 饲养，不做处理。
[0055] (2)生理盐水组（Vehicle) :8只L印rdb/db小鼠，每周腹腔注射生理盐水200 μ 1，共 3次。
[0056] (3)脂肪间充质干细胞治疗组（AD-MSC) :8只L印rdb/db小鼠，每周腹腔注射脂肪间 充质干细胞I. OX 1〇6,200 μ 1 (生理盐水作为溶剂），共3次。
[0057] (4)脐带间充质干细胞治疗组（UC-MSC) :8只L印rdb/db小鼠，每周腹腔注射脐带间 充质干细胞I. 〇X 1〇6,200 μ 1 (生理盐水作为溶剂），共3次。
[0058] 2、饮食诱导肥胖（DIO)模型分组及治疗：
[0059] 分组前测定小鼠体重，选择体重大于30g的小鼠，按体重将小鼠平均分为3组，每 组8只，另外选择8只同周龄正常饮食的C57BL/6J小鼠作为正常对照：
[0060] (1)正常对照组（Normal) :8只正常饮食C57BL/6J小鼠，不做处理。
[0061] (2)生理盐水组（Vehicle) :8只高脂高糖饮食小鼠，每周腹腔注射生理盐水 200 μ 1，共 3 次。
[0062] (3)脂肪间充质干细胞治疗组（AD-MSC) :8只高脂高糖饮食小鼠，每周腹腔注射脂 肪间充质干细胞1. 〇X 1〇6,200 μ 1 (生理盐水作为溶剂），共3次治疗。
[0063] (4)脐带间充质干细胞治疗组（UC-MSC) :8只高脂高糖饮食小鼠，每周腹腔注射脐 带间充质干细胞1. 〇X 1〇6,200 μ 1 (生理盐水作为溶剂），共3次治疗。
[0064] 四、动物试验相关指标检测
[0065] 1、称量体重
[0066] UC-MSCs及AD-MSCs治疗小鼠后，每隔1周称量一次小鼠体重，根据小鼠平均体重 绘制小鼠体重变化曲线。
[0067] 2、空腹血糖检测
[0068] 间充质干细胞治疗小鼠后每隔1周测一次空腹血糖。方法：小鼠禁食10小时后， 尾部取血，滴在血糖试纸的反应端，通过血糖测试仪显示出血糖浓度。绘制血糖变化曲线。
[0069] 3、葡萄糖耐量测定
[0070] 小鼠禁食IOh后，口服葡萄糖2mg/g体重，血糖测试仪测定给予葡萄糖0、30、60、 120min时的血糖值，绘制糖耐量曲线。
[0071] 4、动物血清检测：
[0072] 4. 1血清生化指标检测：
[0073] 实验结束后，小鼠眼球取血，3000rpm离心IOmin分离血清，样品送至北京北方生 物技术研宄所进行甘油三脂（TG)、总胆固醇（CHOL)、高密度脂蛋白胆固醇（HDL-C)、低密度 脂蛋白胆固醇（LDL-C)、谷丙转氨酶（ALT)、谷草转氨酶（AST)及碱性磷酸酶（ALP)生化指 标检测。
[0074] 4. 2血清炎性因子检测：
[0075] 分离小鼠血清，使用Luminex炎性因子检测试剂盒检测小鼠血清中IL-I β、IL_4、 IL-6、IL-12(p70)、IL-17、TNF-a 及 IFN-γ 等。
[0076] 5、动物组织病理检测：
[0077] 5. 1动物组织苏木素-伊红（HE)染色：
[0078] 小鼠断颈处死后，做腹部正中切口，充分暴露腹部，取出小鼠肝脏、胰腺、脂肪，以 10倍体积的10%甲醛固定24小时，送样于北京雪邦生物科技有限公司进行石蜡包埋、苏木 素-伊红（HE)染色。
[0079] 5. 2胰腺组织冰冻切片荧光染色
[0080] 取小鼠胰腺组织，进行冰冻切片，将切片放入染色盒，进行荧光染色：
[0081] (1)加入 0· 5% TritonX-IOO 溶液孵育 30min，PBS 清洗 3 次（5min/ 次）：
[0082] (2)山羊血清工作液封闭30min，PBS清洗2次；
[0083] (3)Glucagon抗体以及Insulin抗体共同孵育4°C过夜，PBS清洗3次；
[0084] (4)焚光二抗（FITC 标记 Goat 抗 Guinea pig 二抗及 PE 标记 Goat 抗 Rabbit 二 抗），室温孵育2小时，PBS清洗3次；
[0085] (5)接着入DAPI核染料室温孵育lOmin，PBS清洗，50 %甘油PBS封片；
[0086] (6)荧光显微镜下观察并采集图像，进行相应图像分析。
[0087] 6、动物组织 Q-PCR 及 Western Blot 检测
[0088] 取小鼠肝脏、脂肪等组织，在组织匀浆器中进行匀浆，每份组织分为两组，其中一 组加入RIPA裂解液后提取肝脏及脂肪组织总蛋白，按照常规方法进行Westernblot分析， 抗体为HSL，HSL-P，ACC1，ACCl-P等，选择GAPDH做内参；另一组加入Trizol裂解液后提 取RNA，qPCR法分析脂肪组织中1-磷酸鞘氨醇（Sphingosinel_phosphate，SlP)受体1-5， GAPDH做内参；引物序列如下表：
[0089] SlP受体家族1-5引物序列
[0090]
【主权项】
1. 一种脂肪间充质干细胞在降脂方面的应用。
2. 根据权利要求1所述的脂肪间充质干细胞在降脂方面的应用，其特征在于，所述脂 肪间充质干细胞来源于健康成人的脂肪组织，并采用混合胶原酶消化法分离培养取得。
3. 根据权利要求1所述的脂肪间充质干细胞在降脂方面的应用，其特征在于，所述降 脂包括降低血脂含量、减轻体重和/或改善脂代谢异常。
【专利摘要】本发明公开了一种脂肪间充质干细胞在降脂方面的应用，脂肪间充质干细胞来源于健康成人的脂肪组织，并采用混合胶原酶消化法分离培养取得。脐带间充质干细胞采用脐带组织块爬片法分离获得。通过对UC-MSCs和AD-MSCs在db/db小鼠模型治疗中的比较，AD-MSCs可显著降低小鼠体重和血脂含量，改善脂代谢异常状态，为消除和治疗身体肥胖带来新的应用方向，甚至还可为T2DM或代谢性疾病提供新的解决思路和理论依据。
【IPC分类】A61P3-06, A61K35-28, A61P3-00, A61P3-04
【公开号】CN104606230
【申请号】CN201510033480
【发明人】段海峰, 胡显文, 刘广洋, 刘金
【申请人】北京吉源生物科技有限公司
【公开日】2015年5月13日
【申请日】2015年1月23日