一种治疗急性淋巴样白血病的干细胞制剂及其制备方法

文档序号:8305828阅读:769来源:国知局
一种治疗急性淋巴样白血病的干细胞制剂及其制备方法
【技术领域】
[0001] 本发明属于生物医疗技术领域,涉及一种治疗急性淋巴样白血病的干细胞制剂及 其制备方法,具体地说所述的干细胞制剂是一种由胚胎干细胞在体外诱导生成的造血干细 胞制备而成。
【背景技术】
[0002] 白血病是发生在血液中的癌症,可侵及血液、骨髓以及淋巴系统。白血病可以分为 急性白血病和慢性白血病,急性白血病可以进一步分为急性骨髓性白血病(AML)和急性淋 巴样白血病(ALL)。慢性白血病包括慢性骨髓性白血病(CML)和慢性淋巴样白血病(CLL)。 急性淋巴性白血病(ALL)是一类以淋巴母细胞(不成熟的淋巴细胞的前身)失调增生和分化 异常或分化受阻,形成大量非成熟白细胞为特征的快速进展型白血病,约占我国儿童期白 血病的80%和儿童期全部癌症的25% ;在成人中,约占急性白血病的20%。
[0003] 临床上急性白血病的治疗都需要足量的符合要求的造血细胞,为得到治疗所需要 的细胞数量,许多科学家都试图通过体外培养来获得红细胞,主要是通过加入各种细胞因 子等,但是目前所采用的方法扩增造血细胞的数量有限,而且得到的造血细胞纯度不高。
[0004] 造血干细胞(hematopoieticstemcell,HSC)是一种能够分化产生各种血细胞 和免疫细胞的细胞,它是当前应用于细胞疗法最多的一类细胞。应用于患有白血病、再生障 碍性贫血、重症免疫缺陷征、地中海贫血、急性放射病、恶性实体瘤或者淋巴瘤等造血及免 疫系统功能障碍性疾病的患者,它能够发挥功能,重建患者体内的造血功能和免疫系统,提 高生存率,从而达到治疗的目的,这就是造血干细胞移植疗法,干细胞移植是当前治疗恶性 血液疾病和免疫疾病的最佳手段。目前用于移植的造血干细胞主要有三种来源:骨髓、外 周血和脐带血,由于这些组织中造血干细胞含量稀少以及移植排斥等问题的存在,导致90% 以上的潜在患者缺乏合适配型的造血干细胞。另外体内来源的造血干细胞在体外培养一段 时间后,其治疗功效也会大打折扣。而胚胎干细胞来源的造血干细胞,经体外实验和动物模 型实验,已充分证明具有进一步分化为红系细胞、髓系细胞以及淋巴系细胞的潜能,是治疗 造血及免疫系统功能障碍性疾病前景看好的细胞来源。研究胚胎干细胞分化为造血干细 胞,不仅可作为研究动物的早期造血发生的模型,而且可以增加造血干细胞的来源,并且没 有免疫排斥反应。不需要通过基因剔除、治疗性克隆等方法来解决移植排斥的问题,从而为 造血干细胞移植的发展扫除了障碍,因此有着重要的研究价值和应用前景。本发明为一种 最新型高效的胚胎干细胞分化为造血干细胞的方法,对急性淋巴样白血病的治疗有显著功 效。

【发明内容】

[0005] 本发明的目的是提供一种治疗急性淋巴样白血病的干细胞制剂,本发明还提供了 一种治疗急性淋巴样白血病的干细胞制剂的制备方法。本发明利用人胚胎干细胞诱导生成 的造血干细胞制剂通过静脉输注方式移植给急性淋巴样白血病病人,能明显改善急性淋巴 样白血病病人的生存率,修复和替换受损细胞,增强代谢功能;具有修复造血微环境,促进 白血病病理上恢复,为临床治疗白血病开辟细胞治疗的新途径。
[0006] 为实现上述技术目的,达到上述技术效果,本发明通过以下技术方案实现: 一种治疗急性淋巴样白血病的干细胞制剂是由人胚胎干细胞来源的造血干细胞与以 浓度比为1-5的血清白蛋白的生理盐水或者将造血干细胞附在与微载体的溶液,优选所述 的载体为脂质载体、微胶囊、微球等载体配制而成的。
[0007] 所述的干细胞制剂中人胚胎干细胞来源的造血干细胞按照(1-5) X 106个细胞,与 l-5ml牛血清白蛋白BSA或人血清白蛋白HAS和95-99. 5ml生理盐水配制而成。用于急性 淋巴样白血病的病人进行外周静脉输注的有效剂量为(1-5) X 1〇7次。该有效剂量是通过 大量动物模型试验取得治疗效果以及临床实验而确定的。
[0008] 所述的造血干细胞由人胚胎干细胞经体外诱导分化培养而成。
[0009] 所述的胚胎干细胞是早期胚胎(原肠胚期之前)或原始性腺种分离出来的一类细 胞,它具有体外培养无限增殖、自我更新和多向分化的特性。
[0010] 所述的造血干细胞活力保持在90%以上。
[0011] 一种治疗急性淋巴样白血病的干细胞制剂的制备方法,主要包括以下步骤:胚胎 干细胞的传代培养,造血细胞拟胚体的形成,人胚胎干细胞向造血干细胞分化,造血干细胞 的培养和传代及检测,干细胞制剂的制备;其中所述的胚胎干细胞的传代培养的步骤具体 为:常规培养胚胎干细胞进行传代和扩增,此阶段培养基为:85%DMEM培养基为基础培养 基,添加15%胎牛血清或血清替代品,lmmol/L必需氨基酸,50IU/mL青霉素,10ii g/mL链霉 素和4ng/mL碱性成纤维细胞生长因子。
[0012] 所述的造血细胞拟胚体的形成:在传代培养6~7天对胚胎干细胞进行诱导,用 lmg/mLIV型胶原酶吹打成小细胞团,然后使用超低黏附6孔培养板悬浮7天,每2天换液 一次,在拟胚体(EBs)形成阶段在拟胚体形成阶段80%DMEM培养基为基础培养基,添加20% 胎牛血清或血清替代品,lmmol/L必需氨基酸,50IU/mL青霉素,10 y g/mL链霉素,并同时 添加4种定量的制剂,在EB培养的第5~7天分别加入0.1 mM的丝裂霉素、IX 104mol/L的 维生素C、2mM的L-谷氨酰胺和0.1 mM的3 -巯基乙醇(P -ME)。
[0013] 所述的人胚胎干细胞向造血干细胞分化的步骤具体为:拟胚体培养7天后,在显 微镜下观察是否有红细胞出现,红细胞团用拉细的玻璃吸管机械切割并进行单细胞传代培 养。
[0014] 所述的造血干细胞的培养和传代及检测的步骤具体为:将上述成功诱导生成的造 血干细胞消化、终止消化反应,进行传代培养并进行流式细胞仪检测阳性标记物CD34并达 到99%以上,此阶段培养基为85%DMEM培养基为基础培养基,添加15%胎牛血清或血清替代 品,lmmol/L必需氨基酸,50IU/mL青霉素,10 y g/mL链霉素。
[0015] 所述的干细胞制剂的制备的步骤具体为:按照注射剂的制备方法将上述造血干细 胞加牛血清白蛋白BSA或人血清白蛋白HAS和生理盐水或者将造血干细胞附在与微载体的 溶液,按照一定比例定容配制而成制成细胞悬液注射剂即干细胞制剂。
[0016] 本发明的优点在于: (1)本发明中将胚胎干细胞形成拟胚体进而定向分化生成造血干细胞的方法进行了创 新且具有较高的成功率,在本条件下的诱导成功率能够达到90%以上。
[0017] (2)本发明中用胚胎干细胞诱导拟胚体形成阶段,所使用的诱导因子以及剂量和 诱导时间为首创。诱导因子为丝裂霉素、维生素C、L-谷氨酰胺和巯基乙醇-ME), 添加剂量分别是丝裂霉素〇. ImM、维生素Cl X 104mol/L、L-谷氨酰胺2mM和0 -ME0.1 mM,添 加时间为拟胚体培养的第5~7天。
[0018] (3)本发明中所诱导生成的造血干细胞对淋巴样白血病细胞株Jurkat的生存具 有显著的消亡作用。
[0019] (4)本发明选择胚胎干细胞,由于国家计划生育的国策,因此来源广泛;制备体系 成熟易于控制,且诱导条件及诱导因子明确,具有较强的可复制率。
[0020] (5)本发明所形成的干细胞制剂为注射液,成分清晰,经严格标准化检测,可用于 临床,安全可靠。
[0021] (6)本发明所生成的造血干细胞,在临床应用上具有很大的优势。它既具有高度 自我更新能力,又具有进一步分化各系统祖细胞的能力。由于无免疫原性,无免疫排斥反 应,不会发生移植物抗宿主病;能快速修复骨髓抑制现象,使血象恢复正常;抗放射反应能 力强;
当前第1页1 2 
网友询问留言 已有0条留言
  • 还没有人留言评论。精彩留言会获得点赞!
1